一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，包括以下步驟：將殼聚糖研磨、烘干，然后溶于冰醋酸的水溶液，得到殼聚糖溶液；排除殼聚糖溶液中的氣泡；在攪拌條件下，向絲素蛋白水溶液中加入處理過的殼聚糖溶液，再加入交聯(lián)劑，得到混合溶液；在攪拌條件下，向混合溶液中加入正丁醇，得到凝膠；排除凝膠中的氣泡，成型，冷凍干燥，得到復合凝膠三維腫瘤模型支架。本發(fā)明使用絲素蛋白作為主料，采用較少量的殼聚糖作為輔料，使用正丁醇作為變性劑，在水溶液體系下構(gòu)建腫瘤組織工程支架材料，制備的復合凝膠三維腫瘤模型支架既能保留體內(nèi)細胞微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎，又能模擬更加真實的腫瘤細胞生長生理條件。
【專利說明】
一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明涉及細胞生物學領域，尤其涉及一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一種復雜的疾病，取決于原癌基因的激活、腫瘤抑制基因的功能缺失突變以及環(huán)境影響下的局部和系統(tǒng)因素。腫瘤組織環(huán)境十分復雜，除了瘤細胞外，還有很多其他類型的細胞，如上皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞等，癌癥基因的變異促使在此復雜環(huán)境中腫瘤具有不同表現(xiàn)和特征。腫瘤細胞中不同類型的細胞內(nèi)和細胞間存在著復雜的信號傳導通路，此外，由不同細胞群形成的復雜網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)會進一步被腫瘤細胞所處的不同的物理及化學環(huán)境影響。
[0003]傳統(tǒng)的腫瘤治療藥物的體外試驗多數(shù)局限在平面的二維(2D)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)下，忽略了腫瘤細胞間的相互作用和它們所處特殊微環(huán)境的結(jié)構(gòu)特征，無法了解細胞在組織內(nèi)的功能和應答反應，結(jié)果可能導致以2D細胞培養(yǎng)為基礎的藥物或生物學研究出現(xiàn)偏頗，并且也難以預測藥物在體內(nèi)的效果。
[0004]三維(3D)細胞培養(yǎng)模型能在體外構(gòu)建與體內(nèi)相近的細胞所處的空間結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)2D單層細胞培養(yǎng)系統(tǒng)所存在的許多限制。3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)細胞培養(yǎng)模型能更好地模擬細胞生長的微環(huán)境，體現(xiàn)腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的相互作用，還能重現(xiàn)人體腫瘤細胞局部黏附、侵襲以及遠端轉(zhuǎn)移的過程，以便于更好地研究腫瘤黏附、迀移和侵襲的分子作用機制。先進的3D細胞培養(yǎng)模型還能夠由多種不同類型的細胞組成，它的應用和發(fā)展不僅為破解細胞內(nèi)外信號傳導途徑提供了一種有效的方式，在不同癌細胞群的基因和表觀遺傳多樣性的背景下也促進了非基因來源方面的研究。
[0005]目前在組織工程中使用的合成高分子材料，它們在降解性等方面基本能滿足支架材料的要求，但在生物相容性和細胞粘附能力方面卻遠不如天然高分子。絲素蛋白和殼聚糖都是優(yōu)良的生物大分子，具有獨特的生物特性和機械性能，是近年來比較熱門的研究對象。
[0006]絲素蛋白是一種高分子纖維蛋白，在濕潤狀態(tài)下有很好的透氣和透氧性，能夠支持細胞的粘附、增殖及分化，具有優(yōu)良的生物相容性。但由于絲素蛋白經(jīng)過溶解、成型、干燥后脆性變大，使其實際應用受到了一定程度的限制。因此，需要對絲素蛋白進行適度地改性，改善其力學性能，提高利用率。
[0007]殼聚糖作為甲殼素的脫乙酰衍生物，來源及應用十分廣泛，且自身性能優(yōu)異。其表面電荷密度高，毒副作用小，可生物降解，表面帶有吸水基團，吸水性強，并且具有較強的生物粘附作用。然而，殼聚糖本身具有一定的缺陷:由于溶菌酶的作用，殼聚糖降解很快，很容易失去其機械性能而造成結(jié)構(gòu)上的失效。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)公布的絲素蛋白-殼聚糖復合多孔支架穩(wěn)定性相對較低，難以滿足實際應用的需求，且制備過程繁瑣，周期較長，需要先初制三維支架材料，然后在加入致孔劑，經(jīng)過處理得到最終的多孔三維支架材料，所制備的支架材料孔徑均勻度較差，形貌不好，不利于腫瘤細胞的粘附。
[0009]本發(fā)明利用絲素蛋白作為主體材料，將殼聚糖作為輔料與絲素蛋白共混，通過交聯(lián)劑和變性劑綜合作用，制備復合凝膠三維腫瘤模型支架，通過化學鍵作用、氫鍵作用、離子鍵作用和疏水作用等大分子間的相互作用，以改善支架的穩(wěn)定性和降解性。
[0010]鑒于上述缺陷，本設計人積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，該制備方法結(jié)合絲素蛋白優(yōu)異的力學性能和殼聚糖豐富的活性基團，利用正丁醇作為變性劑，簡化了合成步驟，縮短了制備時間，在水溶液體系下構(gòu)建組織工程支架材料，探索出簡單工藝，將兩者復合，在保持其原有良好的生物相容性的同時，改善成型性和降解性能。該制備方法制備的復合凝膠三維腫瘤模型支架能更好地模擬細胞生長的微環(huán)境，以便于對腫瘤黏附、迀移和侵襲的分子作用機制更好地研究。
[0012]本發(fā)明的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)將殼聚糖研磨、烘干，然后溶于冰醋酸的水溶液，得到殼聚糖溶液；
[0014](2)排除步驟(I)中的殼聚糖溶液中的氣泡；
[0015](3)在攪拌條件下，向絲素蛋白水溶液中加入經(jīng)步驟(2)處理過的殼聚糖溶液，再加入交聯(lián)劑，得到混合溶液；
[0016](4)在攪拌條件下，向步驟(3)中的混合溶液中加入正丁醇，得到變性絲素蛋白凝膠；
[0017](5)排除步驟(4)得到的變性絲素蛋白凝膠中的氣泡，成型，冷凍干燥，得到復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0018]進一步的，在步驟(I)中，殼聚糖的分子量為8500Da。
[0019]進一步的，在步驟(2)和步驟(5)中，在4_8°C下排除氣泡，以提高腫瘤細胞支架的均一性，使得支架孔徑均勻，保證在凝膠三維腫瘤支架上生長的細胞處于相對均勻的培養(yǎng)環(huán)境中。
[0020]進一步的，在步驟(3)中，絲素蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為10:1?50:1。
[0021]進一步的，在步驟(3)中，絲素蛋白水溶液的濃度為75_150g/L。
[0022]進一步的，在步驟(3)中，交聯(lián)劑為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)。
[0023]進一步的，在步驟(3)中，交聯(lián)劑與殼聚糖的摩爾比為50:1?1:1。
[0024]進一步的，正丁醇的體積為殼聚糖溶液和絲素蛋白水溶液總體積的1/2?1/4。
[0025]進一步的，在步驟(5)中，在-200C下預凍，然后在-80 V下冷凍成型。
[0026]進一步的，在步驟(5)中，在-200C下預凍20分鐘。
[0027]進一步的，改變輔料殼聚糖的用量、變性劑正丁醇的用量或絲素蛋白溶液的濃度可以調(diào)節(jié)復合凝膠三維腫瘤模型支架的孔徑和相應孔徑的標準差大小。
[0028]絲素蛋白的提取方法如下:首先在堿中使蠶繭脫膠，然后清洗、干燥，得到脫膠絲素蛋白；然后將脫膠絲素蛋白溶于氯化鈣、水和乙醇的三元溶液，得到水溶性絲素蛋白，然后過濾、透析，制備絲素蛋白母液;稀釋絲素蛋白母液，得到不同濃度的絲素蛋白溶液。
[0029]本專利采用梯度冷凍的方式，先在-20°C下預凍，然后在-80°C下冷凍成型，由于溶劑冷凍形成的冰晶直接決定著三維支架的孔徑大小，在這個過程中，先在較低溫度下冷凍，縮短了冰晶形成的時間，最后形成的冰晶粒徑較小，從而使制備的三維支架的孔徑大小和均一性適宜，更好地滿足腫瘤細胞的生長需要。
[0030]本專利使用少量的殼聚糖，起到改善混合液粘度的作用，不僅可以改善凝膠三維腫瘤模型的絲素蛋白支架主體的力學性能，提高絲素蛋白的利用率，還能夠發(fā)揮殼聚糖本身的吸水性，維持腫瘤細胞生長的水性介質(zhì)環(huán)境，促進細胞在凝膠三維腫瘤支架上的附著，對于培養(yǎng)介質(zhì)要求不同的細胞可以添加不同量的殼聚糖來適應不同細胞生長對于培養(yǎng)接觸介質(zhì)的粘度需求。
[0031]本專利使用正丁醇作為變性劑，可以使得支架材料成型性好，具有開孔式、互穿網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，這將有利于細胞的粘附與增殖以及培養(yǎng)介質(zhì)在支架中的流動。正丁醇使得絲素蛋白分子鏈受迫而互相貫穿、纏結(jié)，有利于形成規(guī)整的晶核結(jié)構(gòu)，因而加速了冷凍過程中冰晶的形成速度，從而縮短了制備時間。在冰晶形成過程中變性劑正丁醇體積的膨脹也有可能產(chǎn)生相應的剪切力，從而促進絲素蛋白的構(gòu)象變化并使之完善，使得該種凝膠支架更易于培養(yǎng)腫瘤細胞。
[0032]借由上述方案，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0033]本發(fā)明采用天然生物材料，原料易得，生物相容性好，易于在水溶液體系下構(gòu)建；本發(fā)明采用較少的殼聚糖作為改善粘度的輔料，制備出孔徑均一并且形貌較好的多孔復合凝膠三維腫瘤模型支架;本發(fā)明使用正丁醇作為變性劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的甲醇或乙醇等變性劑，改善了所制備三維支架的孔徑均一性及形貌，簡化了合成步驟，縮短了制備時間;本發(fā)明結(jié)合絲素蛋白優(yōu)異的力學性能和殼聚糖豐富的活性基團，在水溶液體系下構(gòu)建肺腫瘤組織工程支架材料，對于模擬真實的實體瘤腫瘤生長環(huán)境具有獨特的優(yōu)勢;工藝簡單，將絲素蛋白作為主要材料，將少量的殼聚糖作為輔料，保持了二者的生物相容性，改善成型性和降解性;構(gòu)建的復合凝膠三維腫瘤模型支架的孔徑可通過改變殼聚糖溶液和變性劑的用量以及絲素蛋白溶液的濃度進行調(diào)節(jié);構(gòu)建的復合凝膠三維腫瘤模型支架，為腫瘤細胞提供生長基質(zhì)，細胞通過緊密連接或縫隙連接等連接方式建立細胞間及細胞與胞外基質(zhì)間的聯(lián)系，形成一定的三維結(jié)構(gòu)，生長速度更快，能夠更加準確地模擬更加真實的腫瘤細胞生長生理條件。
[0034]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下為本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0035]圖1是本發(fā)明實施例1中制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架上7天后A549細胞生長的SEM圖；
[0036]圖2是不同支架的紅外吸收譜圖；
[0037]圖3是不同支架的XRD譜圖；
[0038]圖4是本發(fā)明實施例2制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架SEM圖；
[0039]圖5是本發(fā)明的絲素蛋白溶液濃度對所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架孔徑的影響圖；
[0040]圖6是本發(fā)明正丁醇加入體積對所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架孔徑的影響圖；
[0041]圖7是本發(fā)明殼聚糖溶液的加入量對所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架孔徑的影響圖；
[0042]圖8是本發(fā)明所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架與二維支架培養(yǎng)細胞蛋白含量的比較圖；
[0043]圖9是本發(fā)明所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架上生長的細胞狀態(tài)的激光共聚焦顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0044]下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0045]提取絲素蛋白的步驟如下:
[0046](I)配制21^農(nóng)度為0.005g/mL的碳酸鈉水溶液，取1g蠶繭，加入IL上述碳酸鈉水溶液，100°C下反應lh，將溶液倒出，換上余下的碳酸鈉水溶液，100°C下繼續(xù)反應lh，然后用去離子水清洗3次，放入50 V烘箱中烘干，得到脫膠蠶絲。
[0047](2)將脫膠蠶絲剪碎，并溶解在CaCl2 = H2O = C2H5OH(摩爾比為1:8:2)的三元溶液中，78°C下恒溫攪拌溶解4h，得到水溶性絲素蛋白溶液，然后用醫(yī)用八層紗布過濾2遍，在透析袋(截留分子量=8000-14000Da)中雙蒸水透析12h，每隔I h換液一次。
[0048](3)繼續(xù)用10%的聚乙二醇(分子量為20000g/mol)透析12h，得到絲素蛋白母液，將絲素蛋白母液儲存在4 V下的冰箱中備用。
[0049](4)通過稱重法測定絲素蛋白母液的濃度，其它濃度的溶液由母液稀釋得到。
[0050]透析好的樣品要盡量避免強烈攪拌和震蕩以及接觸有機溶劑等，以防引起構(gòu)象的變化，而在稀釋過程中也要盡量避免過于劇烈的攪拌。
[0051 ] 實施例1
[0052]1.絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備
[0053]取適量殼聚糖(分子量為8500Da)放入研缽研細，并在50°C烘箱烘干，然后稱取Ig粉末，加入到I OOmL濃度為I %的冰乙酸水溶液中，攪拌使其溶解，得到濃度為0.0I g/mL的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液放在4 0C的冰箱中過夜，使溶液中的氣泡排出。將1mL濃度為150g/L的絲素蛋白溶液裝入塑料容器中，邊攪拌邊緩慢加入7mL濃度為0.01g/mL的殼聚糖溶液，然后加入96mg的EDC和57.5mg的NHS，攪拌均勻后，逐滴加入5mL正丁醇，5分鐘后，溶液呈凝膠狀。停止攪拌，將凝膠放入4 V的冰箱中3分鐘，以除掉凝膠中的氣泡，然后再放入-20 V的冰箱中預凍20分鐘，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷凍干燥，得到絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0054]2.細胞模型的構(gòu)建
[0055]將絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架經(jīng)Co-60輻照滅菌后，用培養(yǎng)基浸潤一天，接種A549細胞，培養(yǎng)7天后取出，用固定液(0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛1ml，10 %多聚甲醛水溶液20ml，雙蒸水加至10ml)固定，冷凍干燥后放入掃描電鏡下觀察。如圖1所示，細胞保持正常形態(tài)，且局部聚集成團，圖1(A)表示細胞分布在孔內(nèi)，圖1(B)表示細胞聚集成球，圖1(C)表示細胞分布在嵴上。說明使用少量的殼聚糖，可以提高絲素蛋白的利用率，促進細胞在凝膠三維腫瘤支架上的附著，滿足了細胞生長對于培養(yǎng)接觸介質(zhì)的粘度需求。
[0056]分別取絲素蛋白支架、殼聚糖支架、絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架和絲素蛋白-殼聚糖物理混合物，測得紅外吸收譜圖，如圖2所示。其中a代表殼聚糖支架，b代表絲素蛋白支架，c代表絲素蛋白-殼聚糖物理混合物，d代表絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0057]從圖2中可以看出，純殼聚糖支架的羥基伸縮振動在3317cm—S純絲素蛋白樣品中的羥基伸縮振動在3537cm—S對比絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架和絲素蛋白-殼聚糖物理混合物的紅外吸收，可以看出絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架的游離酰胺的振動峰在1729cm—I明顯增強，說明交聯(lián)劑可以使絲素蛋白和殼聚糖以化學鍵結(jié)合在一起。
[0058]分別取絲素蛋白支架、殼聚糖支架和絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架，測得XRD譜圖，如圖3所示。a代表殼聚糖支架，b代表本實施例中制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架，c代表絲素蛋白支架。絲素蛋白的結(jié)晶形態(tài)主要分為兩種，I型絲素和Π型絲素，I型絲素的結(jié)構(gòu)中包括無規(guī)線團、螺旋構(gòu)象等非β折疊構(gòu)象，而Π型絲素的結(jié)構(gòu)則呈反平行β折疊。從圖3中可以看出，絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架的2Θ峰出現(xiàn)在20.7°，對應絲素蛋白的β折疊，且該峰的強度增加，說明少量殼聚糖的加入，可以促進絲素蛋白的晶體結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲向更加穩(wěn)定的β折疊轉(zhuǎn)變，表明絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架里絲素蛋白的結(jié)晶度顯著高于純絲素蛋白支架。
[0059]實施例2
[0060]取適量殼聚糖放入研缽中研細，并在50°C的烘箱中烘干，然后稱取Ig粉末，加入到10mL濃度為I %的冰乙酸水溶液中，攪拌使其溶解，得到濃度為0.01g/mL的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液放在4°C的冰箱中過夜，使溶液中的氣泡排出。將1mL濃度為75g/L的絲素蛋白溶液裝入塑料容器中，邊攪拌邊緩慢加入7mL濃度為0.0I g/mL的殼聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，攪拌均勻后，逐滴加入4.25mL正丁醇變性，5分鐘后，溶液呈凝膠狀。停止攪拌，將凝膠放入8 V的冰箱中3分鐘，以除掉凝膠中的氣泡，然后再放入-20 V的冰箱中預凍20分鐘，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷凍干燥，得到絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。圖4為所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架不同截面的SEM圖，圖4(A)為該支架的表面，圖4(B)為該支架的橫斷面，圖4(C)為該支架的冠狀面，從圖中可以看出所制備絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架的多孔結(jié)構(gòu)，并且該支架的多孔結(jié)構(gòu)更加均一，形貌更加完整，能夠促進細胞的粘附，更準確模擬真實的腫瘤生長環(huán)境，更好的滿足了腫瘤細胞的生長需要。
[0061 ] 實施例3
[0062]取適量殼聚糖放入研缽中研細，并在50°C的烘箱中烘干，然后稱取Ig粉末，加入到10mL濃度為I %的冰乙酸水溶液中，攪拌使其溶解，得到濃度為0.01g/mL的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液放在6°C的冰箱中過夜，使溶液中的氣泡排出。將1mL濃度為75g/L的絲素蛋白溶液裝入塑料容器中，邊攪拌邊緩慢加入3mL濃度為0.0I g/mL的殼聚糖溶液，然后加入57.6mg的EDC和34.5mg的NHS，攪拌均勻后，逐滴加入3.25mL正丁醇，5分鐘后，溶液呈凝膠狀。停止攪拌，將凝膠放入4°C的冰箱中3分鐘，以除掉凝膠中的氣泡，然后再放入-20°C的冰箱中預凍20分鐘，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷凍干燥，得到絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0063]實施例4
[0064]取適量殼聚糖放入研缽中研細，并在50°C的烘箱中烘干，然后稱取Ig粉末，加入到10mL濃度為I %的冰乙酸水溶液中，攪拌使其溶解，得到濃度為0.01g/mL的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液放在6 0C的冰箱中過夜，使溶液中的氣泡排出。將1mL濃度為150g/L的絲素蛋白溶液裝入塑料容器中，邊攪拌邊緩慢加入4mL濃度為0.0I g/mL的殼聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，攪拌均勻后，逐滴加入8.5mL正丁醇，5分鐘后，溶液呈凝膠狀。停止攪拌，將凝膠放入6°C的冰箱中3分鐘，以除掉凝膠中的氣泡，然后再放入-20°C的冰箱中預凍20分鐘，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷凍干燥，得到絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0065]實施例5
[0066]取適量殼聚糖放入研缽中研細，并在50°C的烘箱中烘干，然后稱取Ig粉末，加入到10mL濃度為I %的冰乙酸水溶液中，攪拌使其溶解，得到濃度為0.0lg/mL的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液放在6 0C的冰箱中過夜，使溶液中的氣泡排出。將1mL濃度為100g/L的絲素蛋白溶液裝入塑料容器中，邊攪拌邊緩慢加入5mL濃度為0.0I g/mL的殼聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，攪拌均勻后，逐滴加入8.5mL正丁醇，5分鐘后，溶液呈凝膠狀。停止攪拌，將凝膠放入6°C的冰箱中3分鐘，以除掉凝膠中的氣泡，然后再放入-20°C的冰箱中預凍20分鐘，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷凍干燥，得到絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0067]實施例6
[0068]取適量殼聚糖放入研缽中研細，并在50°C的烘箱中烘干，然后稱取Ig粉末，加入到10mL濃度為I %的冰乙酸水溶液中，攪拌使其溶解，得到濃度為0.01g/mL的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液放在6 0C的冰箱中過夜，使溶液中的氣泡排出。將1mL濃度為125g/L的絲素蛋白溶液裝入塑料容器中，邊攪拌邊緩慢加入6mL濃度為0.01 g/mL的殼聚糖溶液，然后加入134.4mg的EDC和80.5mg的NHS，攪拌均勻后，逐滴加入8.5mL正丁醇，5分鐘后，溶液呈凝膠狀。停止攪拌，將凝膠放入6°C的冰箱中3分鐘，以除掉凝膠中的氣泡，然后再放入-20°C的冰箱中預凍20分鐘，最后放入-80°C的冰箱中成型，24h后取出，冷凍干燥，得到絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架。
[0069]圖5為加入體積為1mL的不同濃度絲素蛋白溶液對所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架孔徑的影響圖。從圖5可以看出，改變絲素蛋白溶液的濃度，支架的孔徑隨之改變，孔的分布比較均一。
[0070]正丁醇是一種相對比較溫和的蛋白質(zhì)變性劑，本發(fā)明將正丁醇添加到絲素蛋白溶液中，攪拌后形成乳液狀混合物，這種混合物具有較好的流動性，能夠在模具中均勻分散，混合溶液在冷凍時，短時間內(nèi)即可凍結(jié)，阻止了絲素蛋白聚集成團，使混合體系發(fā)生均勻的宏觀相分離。在冷凍過程中，水和正丁醇從混合溶液中分離出來形成冰核，冰核逐漸形成大的冰晶。由于液態(tài)水的減少，而使周圍的絲素蛋白分子鏈受迫，進一步互相貫穿、纏結(jié)，使原來在水溶液下呈無規(guī)線團分布的蛋白質(zhì)分子鏈間的距離縮短，同時正丁醇的存在破壞了蛋白質(zhì)分子的水化層，絲素蛋白部分構(gòu)象轉(zhuǎn)變。由于分子鏈內(nèi)和分子間強烈的氫鍵作用使蛋白質(zhì)分子鏈凝聚而緊密堆砌，部分形成規(guī)整的晶區(qū)結(jié)構(gòu)，因此使得本發(fā)明制備的支架具有完整的形貌和均一的孔徑。
[0071]圖6為加入不同體積的正丁醇對所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架孔徑的影響圖，從圖中可以看出，改變變性劑的加入體積，可以改變絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架的孔徑和孔的均一度。
[0072]圖7為加入濃度為0.0I g/mL的不同體積的殼聚糖溶液對所制備的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架孔徑的影響圖。從圖7中可以看出，改變殼聚糖溶液的加入量，可以改變支架的孔徑和孔的均一度。
[0073]圖8是本發(fā)明實施例6制得的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架上和普通培養(yǎng)皿上培養(yǎng)初始細胞數(shù)相同時，經(jīng)歷48h后，RIPA裂解液裂解Ih，3D扣除純絲素蛋白空白后所得到的三維支架上純細胞總蛋白含量和普通培養(yǎng)皿上總細胞蛋白含量的比較，從圖中可以看出，本發(fā)明的三維支架上蛋白總量是二維普通培養(yǎng)皿上細胞蛋白總含量的7倍以上，說明三維腫瘤模型支架上細胞數(shù)目明顯比二維普通培養(yǎng)皿細胞多，三維腫瘤模型支架更能模擬生物體真實的腫瘤生長條件。
[0074]目前制備的很多生物支架上細胞生長狀況難以直接觀察，采用常規(guī)的熒光染料染色方法會使染料在支架上產(chǎn)生吸附，使得細胞和支架串色而無法區(qū)分。本發(fā)明利用發(fā)光質(zhì)粒特異性轉(zhuǎn)染到細胞中表達綠色熒光蛋白，而絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架本身無綠色熒光的方法，解決了支架染色的難題。圖9是本發(fā)明實施例6制得的絲素蛋白-殼聚糖復合凝膠三維腫瘤模型支架上接種初始濃度6 X 15個/mL處于對數(shù)生長期的A549細胞24h后，用EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。待EGFP表達綠色熒光蛋白后，加入LysoTracker? Red紅色熒光染料染色lOmin，直接放于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞在支架上生長狀況。其中A代表生長一段時間后A549細胞形成大量細胞球聚集成團的狀態(tài);B代表一個A549細胞球狀態(tài)圖。C代表細胞球形成初期狀態(tài)圖。從圖中可以看出三維支架上的細胞與二維腫瘤細胞生長狀態(tài)有明顯差異，三維腫瘤模型支架上單個細胞呈現(xiàn)圓球狀，生長密集，有些成團或者成葡萄串形聚集，而二維普通培養(yǎng)皿上細胞呈成紡錘形，單層貼壁生長;三維腫瘤模型支架上多個細胞聚集成細胞球，細胞球會進一步發(fā)生團聚現(xiàn)象，形成更大的“細胞團”，說明在三維腫瘤模型支架上腫瘤細胞生長狀況與人體內(nèi)實質(zhì)瘤更加接近。
[0075]本發(fā)明采用較少的殼聚糖作為改善粘度的輔料，制備出孔徑均一且形貌較好的多孔復合凝膠三維腫瘤模型支架;本發(fā)明使用正丁醇作為變性劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的甲醇或乙醇等變性劑，改善了所制備三維支架的孔徑均一度及形貌;本發(fā)明結(jié)合絲素蛋白優(yōu)異的力學性能和殼聚糖豐富的活性基團，在水溶液體系下構(gòu)建腫瘤組織工程支架材料，對于更加準確地模擬更加真實的腫瘤細胞生長生理條件具有獨到的優(yōu)勢。
[0076]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將殼聚糖研磨、烘干，然后溶于冰醋酸的水溶液，得到殼聚糖溶液； (2)排除步驟(I)中所述殼聚糖溶液中的氣泡； (3)在攪拌條件下，向絲素蛋白水溶液中加入經(jīng)步驟(2)處理過的殼聚糖溶液，再加入交聯(lián)劑，得到混合溶液； (4)在攪拌條件下，向步驟(3)中的所述混合溶液中加入正丁醇，得到變性絲素蛋白凝膠； (5)排除步驟(4)得到的變性絲素蛋白凝膠中的氣泡，成型，冷凍干燥，得到復合凝膠三維腫瘤模型支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(1)中，所述殼聚糖的分子量為8500Da。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(2)和步驟(5)中，在4-80C下排除氣泡。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(3)中，絲素蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為10:1?50:1。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述絲素蛋白水溶液的濃度為75-150g/L。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述交聯(lián)劑為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述交聯(lián)劑與殼聚糖的摩爾比為50:1?1:1。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:所述正丁醇的體積為所述殼聚糖溶液和所述絲素蛋白水溶液總體積的1/2?1/4。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(5)中，在-20°C下預凍，然后在_80°C下冷凍成型。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復合凝膠三維腫瘤模型支架的制備方法，其特征在于:在步驟(5)中，在-20 0C下預凍20分鐘。
【文檔編號】A61L27/48GK105963790SQ201610292544
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】張學農(nóng), 李繼昭, 周燁娟
【申請人】蘇州大學