Egfr小分子不可逆抑制劑和t細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及上皮生長因子受體(EGFR)小分子不可逆抑制劑(E)?N?[4?[4?[(3?氟芐氧基)?3?氯苯基]氨基]?7?乙氧基?喹唑啉?6?基]?3?(吡咯烷?2?基)丙烯酰胺和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，降低了個(gè)體中腫瘤大小及抑制癌細(xì)胞生長或抑制轉(zhuǎn)移癌發(fā)展。
【專利說明】
EGFR小分子不可逆抑制劑和Τ細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及上皮生長因子受體化GFR)小分子不可逆抑制劑化)-Ν-[4-[4-[(3-氣 節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺和Τ細(xì)胞聯(lián) 合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，降低了個(gè)體中腫瘤大小及抑制癌細(xì)胞生長或抑制轉(zhuǎn)移癌發(fā)展。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的第一殺手，在我國每年因癌癥死亡的 病例高達(dá)211萬例。而腫瘤細(xì)胞在用藥過程中產(chǎn)生的耐藥問題是腫瘤難W根治的重要原因 之一;異常的蛋白激酶活性牽設(shè)到眾多癌癥;因此，使用激酶抑制劑成為一個(gè)重要的治療手 段，其中，EGFR(epide;rmal growth factor receptor,EGFR)為勒1點(diǎn)的小分子抑制劑的研制 則是抗腫瘤的熱點(diǎn)之一，表皮生長因子受體化GFR)是一種受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK)，具有催化活性并受到嚴(yán)密的調(diào)控;EGFR及其家族成員包括皿R2， 肥R3和肥R4在調(diào)控細(xì)胞增殖，生存和轉(zhuǎn)移等活動(dòng)中起到極其重要的作用；因 EGFR，皿R2過表 達(dá)和/或突變而引起的信號(hào)傳遞系統(tǒng)異常，是許多上皮類型腫瘤惡變的共同特征；同時(shí)具有 EGFR或肥R2變化的癌癥患者一般有著更加嚴(yán)重的病情和不良的預(yù)后。
[0003] 在過去的幾十年內(nèi)，針對(duì)EGFR的小分子祀向制劑相當(dāng)成功，發(fā)展了一系列的藥物， 如吉非替尼(gefitinA)，厄洛替尼（erlotinA)等，然而有激活突變的EGFR的腫瘤患者，尤 其是非小細(xì)胞肺癌患者在用藥10-16個(gè)月后往往會(huì)產(chǎn)生耐藥性，而導(dǎo)致此耐藥性最重要的 原因之一就是EGFR的790氨基酸產(chǎn)生突變(T790M);因此研制針對(duì)此耐藥性的小分子祀向制 劑成為目前非小細(xì)胞肺癌祀向治療的關(guān)鍵。
[0004] 除了分子祀向治療外，近些年來發(fā)展的抗腫瘤細(xì)胞免疫治療是繼傳統(tǒng)手術(shù)、化療、 放療之后又一新型的腫瘤治療方法，抗腫瘤過繼免疫細(xì)胞治療已逐步在臨床上應(yīng)用并發(fā)揮 著重要的作用；與傳統(tǒng)化療不同，抗腫瘤細(xì)胞免疫治療對(duì)患者沒有明顯的毒副反應(yīng)，且患者 耐受性更好，生活質(zhì)量的改善明顯提高。
[0005] 然而，運(yùn)些方法雖然取得了良好的臨床效果，但是由于每個(gè)個(gè)體之間存在著巨大 的差異，且腫瘤也存在著巨大的異質(zhì)性；因此現(xiàn)存的運(yùn)些方法對(duì)許多癌癥類型的治療效果 是有限的，因此亟需表現(xiàn)出臨床益處的新的改進(jìn)形式的治療。
[0006] 化)-N-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-川比 咯燒-2-基)丙締酷胺是一種潛在的新型的針對(duì)上皮生長因子受體化GFR)耐藥性T790M突變 的小分子祀向不可逆抑制劑；化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基- 哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)抗多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞系的顯著體 外活性W及小鼠中如非小細(xì)胞肺癌的異種移植的人細(xì)胞系顯著體內(nèi)活性;對(duì)其作用機(jī)制的 初步探索提示其可W與EGFR形成共價(jià)鍵形式結(jié)合，并長期抑制EGFR活性。
[0007] 由于癌癥是目前人們普遍關(guān)注并具有高發(fā)病率及死亡率的疾病，為了獲得安全且 行之有效的療法來給予患者，已經(jīng)進(jìn)行了并仍然正在進(jìn)行一些努力，本發(fā)明要解決的問題 是提供EGFR小分子不可逆抑制劑和Τ細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)W上的問題，提供設(shè)及上皮生長因子受體巧GFR)小分子不可逆抑制劑 化)-Ν-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2- 基)丙締酷胺和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，降低了個(gè)體中腫瘤大小及抑制癌細(xì)胞生 長或抑制轉(zhuǎn)移癌發(fā)展。
[0009] 在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，包括給予需要運(yùn)樣的治療的患者治療有效量的化)-N- [4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締 酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽和治療有效量的抗原刺激后的T細(xì)胞。
[0010] 增強(qiáng)抗原刺激后的T細(xì)胞在癌癥治療中的治療功效的方法，包括給予有運(yùn)樣需要 的患者治療有效量的抗原刺激后的T細(xì)胞和治療有效量的巧)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3- 氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽。 [00川其中（E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3- (化咯燒-2-基)丙締酷胺或其可接受的鹽和T細(xì)胞構(gòu)成同一組合物的部分，所述的T細(xì)胞來 自于有運(yùn)樣需要的患者自身，患者經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后，抽取患者外周血，分離外周血白細(xì) 胞，并在符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞間內(nèi)進(jìn)行篩選培養(yǎng)。
[001^ 其中（E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3- (化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽和T細(xì)胞提供為用于同時(shí)或不同時(shí)給藥的分 別的組合物，其中所述的T細(xì)胞來自于有運(yùn)樣需要的患者自身，并經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激和體外 培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0013] 其中所述的T細(xì)胞來源于有運(yùn)樣需要的患者自身，相應(yīng)抗原可W根據(jù)不同癌癥類 型而有所不同。
[0014] 其中巧)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3- (化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽和T細(xì)胞構(gòu)成同一組合物，所述的T細(xì)胞選自 有運(yùn)樣需要的患者自身，并經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激和體外培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0015] 其中與化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]- 3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺聯(lián)合的抗腫瘤治療為經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激的T細(xì)胞。
[0016] 其中治療的癌癥主要選自肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、頭頸癌、前列 腺癌等有EGFR異常表達(dá)或突變的上皮類型腺癌。
[0017] (E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基）-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(郵 咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽在制備用于前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的藥物 在聯(lián)合抗腫瘤用途中的應(yīng)用。
[0018]用于前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聯(lián)合抗腫瘤中的化）-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧 基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺或其藥學(xué)可接 受的鹽。
[0019]本發(fā)明證實(shí)，（E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟- 6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺增強(qiáng)腫瘤免疫細(xì)胞治療方法的抗腫瘤活性，特別是來自 腫瘤患者自身的經(jīng)特定抗原刺激并經(jīng)過嚴(yán)格體外篩選擴(kuò)增的T細(xì)胞；因此可W將化)-N-[4-
[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺 與經(jīng)特定抗原刺激并體外篩選擴(kuò)增的T細(xì)胞成功地用于聯(lián)合療法W治療特定的上皮細(xì)胞類 癌癥。
[0020] 因此，本發(fā)明設(shè)及利用聯(lián)合療法來治療癌癥的藥物組合物、方法W及化)-N-[4- [4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺 在制備用于聯(lián)合療法的藥物中的用途。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，我們提供了基于化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基] 氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽并且利用 特定經(jīng)過篩選擴(kuò)增的T細(xì)胞用于治療癌癥的有效聯(lián)合療法。
[0022] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療癌癥的方法，該方法包括給予需要運(yùn)種治療 的患者治療有效量的化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6- 基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽，W及在給予化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié) 氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺之前、期間或 之后給予的治療有效量的特定T細(xì)胞;運(yùn)兩種藥物可W形成同一組合物的部分，或者用于同 時(shí)或不同時(shí)給藥的分別的組合物提供。
[0023] 另一方面，本發(fā)明包括增加或增強(qiáng)特定抗原刺激的T細(xì)胞在癌癥治療中的治療效 果的方法，該方法包括給予需要該治療的患者治療有效量的化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)- 3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的 鹽;在給予T細(xì)胞之前、期間或之后給予化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7- 乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺。
[0024] 另一方面，本發(fā)明包括化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基- 哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽在制備用于在與T細(xì)胞治療 的聯(lián)合療法中治療癌癥的藥物中的用途。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明包括在用于治療癌癥的聯(lián)合療法中使用的藥物組合物，其包 含(E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(郵咯燒-2- 基)丙締酷胺或其藥學(xué)可按受的鹽和/或T細(xì)胞W及藥學(xué)可按受的載體或賦形劑。
[0026] 在一優(yōu)選的方面，本發(fā)明設(shè)及化)-n-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7- 乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺或其藥學(xué)可按受的鹽與T細(xì)胞的協(xié)同聯(lián) 厶 1=1 〇
[0027] 當(dāng)將(E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3- (化咯燒-2-基)丙締酷胺與T細(xì)胞聯(lián)合時(shí)，（E)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]- 7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺極大地增強(qiáng)了T細(xì)胞的抗腫瘤活性；因 此本發(fā)明提供基于化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6- 基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可按受的鹽與T細(xì)胞聯(lián)合的癌癥的有效治療。
[0028] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及使用化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7- 乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽與T細(xì)胞的協(xié)同聯(lián) 合;可W通過應(yīng)用本文所述的方法學(xué)來獲得運(yùn)協(xié)同聯(lián)合。
[0029] 在本申請(qǐng)中，癌癥表示包括腫瘤、瘤形成W及惡性組織或細(xì)胞所導(dǎo)致的任何惡性 疾病，且運(yùn)些惡性疾病必須具備有上皮生長因子受體巧GFR)異常表達(dá)或EGFR基因突變的基 因特征。
[0030] 本說明書中各處所用的術(shù)語"聯(lián)合"表示包括在相同或不同時(shí)間給予患有癌癥的 患者在同一或分別的藥物制劑中的所設(shè)及的治療劑;如果在不同時(shí)間給予治療劑，則它們 應(yīng)當(dāng)在時(shí)間上足夠接近地進(jìn)行給藥W發(fā)生增強(qiáng)或協(xié)同譴浪笑傲。
[0031] 另一方面，本發(fā)明巧)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫 嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺或其藥學(xué)可受的鹽在用于通過使用化)-N-[4-[4- [(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺或 其藥學(xué)可接受的鹽與T細(xì)胞聯(lián)合療法來有效的治療癌癥的藥物的制備中的用途。
[0032] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及治療癌癥的方法，該方法包括將治療有效量的化)-N-[4- [4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷 胺或其藥學(xué)可按受的鹽與治療有效量的T細(xì)胞聯(lián)合給予需要運(yùn)樣的治療的患者。
[0033] 根據(jù)腫瘤類型和疾病的發(fā)展階段，本發(fā)明的治療方法的抗腫瘤效果包括但不限于 抑制腫瘤生長、延緩腫瘤生長，腫瘤的消退、腫瘤的收縮、腫瘤大小和/或腫瘤標(biāo)志物減少、 停止治療時(shí)腫瘤再生長時(shí)間的增加、疾病進(jìn)展減緩W及預(yù)防轉(zhuǎn)移;預(yù)期的是，當(dāng)給予諸如人 類患者的需要運(yùn)樣的治療的患者本發(fā)明的治療方法時(shí)，所述治療方法會(huì)產(chǎn)生例如通過抗腫 瘤效果的程度、應(yīng)答率、疾病進(jìn)展時(shí)間或存活率所測(cè)定的效果;特別是，本發(fā)明的治療方法 適用于人類患者，特別是對(duì)W前的化療復(fù)發(fā)或難治愈的那些人類患者。
[0034] 如上文所述，化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟- 6-基]-3-(化咯燒-2-基倆締酷胺是WEGFR為祀點(diǎn)的小分子不可逆抑制劑。
[0035] 本文中術(shù)語巧)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6- 基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺旨在涵蓋任何藥學(xué)可按受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥或 給予患者時(shí)能夠提供(直接或間接)本文所述的化合物的任何其他化合物;可W通過本領(lǐng)域 已知的方法進(jìn)行所述鹽、溶劑化物、水合物和前藥的制備。
[0036] 可W通過常規(guī)化學(xué)方法從含有堿性或酸性部分的母體化合物合成藥學(xué)可接受的 鹽，通?？蒞通過使游離酸或堿形式的運(yùn)些化合物與化學(xué)計(jì)算量的合適堿或酸在水中或在 有機(jī)溶劑中或在兩者的混合物中反應(yīng)來制備運(yùn)樣的鹽;酸加成鹽的實(shí)例包括鹽酸鹽、硫酸 鹽、硝酸鹽、憐酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、巧樣酸鹽、酒石酸鹽、甲橫酸鹽和對(duì)甲苯橫酸鹽等。 堿加成鹽的實(shí)例包括鋼鹽、鐘鹽、乙二胺鹽、Ξ乙醇胺鹽、堿性氨基酸鹽等。
[0037] 優(yōu)選的化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]- 3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺的藥物組合物或包含該化合物的藥物組合物可W被膠囊化、片 劑化或在乳狀液或糖漿中制備，W方便的通過口服給藥。
[003引優(yōu)選的是化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6- 基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽與T細(xì)胞在癌癥治療中的聯(lián)合，所述癌 癥選自肺癌、前列腺癌、胃癌、頭頸癌、乳腺癌等具有EGFR異常表達(dá)或EGFR突變的腺癌。
[0039] 優(yōu)選的是化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6- 基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺或其藥學(xué)可接受的鹽與T細(xì)胞免疫治療在癌癥治療中的并 且更特別的是選自肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、頭頸癌等具有EGFR異常表達(dá)或 EGFR突變的腺癌。
[0040] 治療上有效量最先可W通過確定IC50的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估計(jì);然后在動(dòng)物模型中 配制劑量，W獲得包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50的循環(huán)血漿濃度范圍；此類信息可W被用 于更精確地確定在人中有用的初始劑量。
【附圖說明】
[0041] 圖1是本發(fā)明中化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基）-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫 嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺化學(xué)式；
[0042] 圖2是本發(fā)明中免疫細(xì)胞采用抗原刺激前后的細(xì)胞亞群分析的結(jié)果對(duì)比圖；
[0043] 圖3是本發(fā)明中EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞及兩者聯(lián)合對(duì)小鼠移植瘤的治 療效果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面的實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，運(yùn)些實(shí)施例不旨在W任何方式限制本發(fā)明的范 圍。
[0045] -、材料和方法：
[0046] ( -)、試劑和小鼠 ：
[0047] A431細(xì)胞，H1975細(xì)胞，N87細(xì)胞，SW620細(xì)胞，DMS0，生物級(jí)，DMEM培養(yǎng)基；
[004引 RPMI -1640培養(yǎng)基，胎牛血清，MTT，雙抗，膜蛋白酶及其他相關(guān)有機(jī)無機(jī)試劑；
[0049] 選用六周齡雌BALB/c雌性小鼠，并培養(yǎng)于SPF條件下，12小時(shí)采光，12小時(shí)黑暗，恒 溫24°C;并遵照研究動(dòng)物的正確和人道使用的規(guī)定指南操作執(zhí)行；
[0050] (二）、實(shí)驗(yàn)方法：
[0051 ]細(xì)胞水平活性測(cè)定是測(cè)試化合物對(duì)癌細(xì)胞的生長抑制能力;所選用的細(xì)胞模型為 人表皮癌細(xì)胞A431細(xì)胞，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975細(xì)胞系，人胃癌細(xì)胞N87細(xì)胞系及人結(jié) 直腸癌細(xì)胞系SW620細(xì)胞系，其中A431細(xì)胞過表達(dá)野生型EGFR，化975細(xì)胞表達(dá)突變型EGFR， N87過表達(dá)野生型皿R2，而SW620不表達(dá)EGFR和皿R2;抗增殖活性測(cè)定方法為MTT法，所得結(jié) 果用半數(shù)抑制濃度(IC50)表示；
[0052] 1、細(xì)胞復(fù)蘇：37°C水浴預(yù)熱事先無菌條件下配制的完全培養(yǎng)基及PBS。預(yù)先準(zhǔn)備 100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入完全培養(yǎng)基;凍存的細(xì)胞系37 °C水浴下使其迅速融化，一般時(shí)間控 制在2min內(nèi)，若2min仍有少量未融化，可加入少量預(yù)熱的培養(yǎng)基，輕輕吹打。將融化的細(xì)胞 移入培養(yǎng)皿中，搖勻后，置于37°C，5%C02、飽和濕度下培養(yǎng);待細(xì)胞貼壁后更換新鮮完全培 養(yǎng)基。
[0化3] 2、細(xì)胞系培養(yǎng)傳代:A431細(xì)胞系貼壁培養(yǎng)于10ml DMEM完全培養(yǎng)基中，H1975，N87 及SW620細(xì)胞系分別貼壁培養(yǎng)于含10ml RPMI1640完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37°C， 5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長到約90%匯合度時(shí)，吸出舊的培養(yǎng)基，用滅菌憐酸緩 沖液(PBS)清洗細(xì)胞，然后加1ml 0.25 %膜蛋白酶，37 °C作用約2-5min，倒置顯微鏡下觀察 消化情況;加入4ml完全培養(yǎng)基，用移液管將細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞;按比例接種至新的細(xì)胞 培養(yǎng)皿中，搖勻，置于C〇2培養(yǎng)箱中37 Γ培養(yǎng)。
[0054] 3、細(xì)胞凍存：當(dāng)細(xì)胞長至90%匯合后，用0.25%膜蛋白酶消化細(xì)胞，消化后的細(xì)胞 轉(zhuǎn)入15ml離屯、管中，常溫離屯、1200巧m，5min，棄上清，加入1ml凍存液，重懸細(xì)胞，將其移入 凍存管中，做好標(biāo)記，4°C平衡30min，-2(TC放置化，然后轉(zhuǎn)入-80°C冰箱短期保存，隨后再轉(zhuǎn) 入液氮罐中長期保存；
[0055] (Ξ)、抗原刺激的T細(xì)胞培養(yǎng)：
[0056] 人工抽取健康志愿者外周血，經(jīng)人淋己細(xì)胞分離液密度梯度離屯、法獲得外周血單 個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗涂?jī)纱?，懸浮于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，當(dāng)日添加 IF化，CD3單抗、CD8單 抗，IL2細(xì)胞刺激因子共培養(yǎng)Ξ天后，隨后添加針對(duì)四種腫瘤細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的抗原刺激物，并 將細(xì)胞懸浮于Tvac T細(xì)胞篩選培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)14天，從而達(dá)到治療量的細(xì)胞數(shù)量;細(xì)胞 經(jīng)處理前后采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
[0057] (四）、化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基）-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]- 3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性(Μ?Τ實(shí)驗(yàn)）：
[0058] 取長至90%匯合度的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，膜蛋白酶消化后收集細(xì)胞，用移液 管吹打均勻，取部分細(xì)胞懸液用臺(tái)吩藍(lán)染料(化ypan Blue)染色，加入到紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中， 于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，然后用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞數(shù)目調(diào)整到1X105個(gè)細(xì)胞/ml; 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入3000個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);第二天將培養(yǎng) 基換成無酪紅的完全培養(yǎng)基后，將梯度稀釋后的藥物，按每孔5ul加入到96孔板中，終濃度 為InM, lOnM, lOOnM, luM, lOuM, lOOuM,每個(gè)濃度設(shè)定6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基+MTT +DMS0)，陰性對(duì)照孔(細(xì)胞+培養(yǎng)基+MTT+相同濃度的DMS0)，繼續(xù)培養(yǎng)4她后，每孔加入20ul 的MTT儲(chǔ)存液，繼續(xù)于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后小屯、吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150ul 的DMS0，置搖床低速振蕩lOmin后，酶標(biāo)儀于0D490nm測(cè)定各孔吸光值;根據(jù)各孔0D值計(jì)算藥 物的IC50值，計(jì)算方法采用改良寇式法：IgIC50 = Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4);
[0059] 其中，Xm為設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值，I為最大劑量與相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)值，P為 陽性反應(yīng)率之各，化為最大陽性反應(yīng)率，Pn為最小陽性反應(yīng)率；
[0060] (五）、抗原刺激后的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞體外殺傷活性實(shí)驗(yàn)：
[0061] 乳酸脫氨酶化DH)在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損傷或死 亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外，此時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中LD田舌性與細(xì)胞死亡數(shù)成正比，用比色法測(cè)定并與 祀細(xì)胞對(duì)照孔LDH活性比較，可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞對(duì)祀細(xì)胞的殺傷率；
[0062] 同上，取長至90%匯合度的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，收集細(xì)胞后將細(xì)胞調(diào)整至 lX105/ml細(xì)胞，在96孔板中加入調(diào)整好的細(xì)胞懸液，每孔lOOul，于鋪板48小時(shí)后加入經(jīng)抗 原刺激后的不同效祀比的T細(xì)胞（10:1,20:1，40:1)，同時(shí)設(shè)置T細(xì)胞空白對(duì)照，每組3個(gè)復(fù) 孔，效應(yīng)細(xì)胞及祀細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后加入CCK8溶液20ul每孔，37°C解育2小時(shí)后，酶聯(lián)免 疫分析儀檢測(cè)每孔的0D值，計(jì)算殺傷活性(殺傷率），殺傷率（％ ) = [1-(實(shí)驗(yàn)組0D值-單獨(dú)T 細(xì)胞00值)/單獨(dú)腫瘤細(xì)胞00值]乂100%;
[0063] (六）、化)-N-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]- 3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺與經(jīng)抗原刺激的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性檢測(cè)：
[0064] 同上，接種四種腫瘤細(xì)胞，于鋪板24小時(shí)加入不同濃度的化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié) 氧基）-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-( R比咯燒-2-基）丙締酷胺（20nM/L, 40nM/L，60nM/L)，次日在經(jīng)過不同濃度藥物處理的細(xì)胞孔中加入不同祀比的經(jīng)抗原刺激后 的T細(xì)胞（10:1，20:1，40:1)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入CCK8溶液20ul/孔，37°C解育2小時(shí)后， 酶聯(lián)免疫分析儀檢測(cè)每孔的0D值，計(jì)算殺傷活性(殺傷率），計(jì)算公式同上；
[00化](屯）、化)-n-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基）-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]- 3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺、經(jīng)抗原刺激的Τ細(xì)胞及兩者聯(lián)合對(duì)小鼠移植瘤的治療效果：
[0066] 于小鼠右側(cè)前肢根部皮下注射處于對(duì)數(shù)期的Η1975細(xì)胞，將小鼠隨機(jī)分成生理鹽 水對(duì)照組、化)-Ν-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(郵 咯燒-2-基)丙締酷胺治療組，經(jīng)抗原刺激的T細(xì)胞治療組及聯(lián)合治療組。（E)-N-[4-[4-[(3- 氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基)丙締酷胺W灌胃 給藥的方式，25mg/kg每日，經(jīng)抗原刺激后的T細(xì)胞治療組給予腹腔注射，1X107/只，每3天一 次，給予6次的注射，聯(lián)合治療組先予化)-N-[4-[4-[(3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙 氧基-哇挫嘟-6-基]-3-(化咯燒-2-基）丙締酷胺W灌胃給藥的方式，25mg/kg每日，同時(shí)給 予經(jīng)抗原刺激后的T細(xì)胞腹腔內(nèi)注射，注射劑量與周期同單獨(dú)治療組，對(duì)照組為生理鹽水灌 胃并腹腔注射，輸入數(shù)量、時(shí)間、次數(shù)與聯(lián)合治療組相同；從治療開始每3天測(cè)量一次各組裸 鼠的腫瘤體積大??；用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最長徑(a)與最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積，并繪制 生長曲線;腫瘤體積計(jì)算方式為V = Jia化/6。
[0067] 如圖2所示，免疫細(xì)胞采用抗原刺激前后的細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，處理后的免疫細(xì)胞 尤其是殺傷性T細(xì)胞與Μ細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。
[006引化)-ν-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基）-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-川比 咯燒-2-基)丙締酷胺單獨(dú)用藥時(shí)對(duì)各種細(xì)胞的殺傷：
[00691
[0070] 所合成的化合物在兩種腫瘤細(xì)胞（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975和人表皮癌細(xì)胞 A431)中進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究，并研究其對(duì)不表達(dá)EGFR和肥R2的細(xì)胞系 (SW620)的毒性；由表中數(shù)據(jù)顯示，對(duì)不表達(dá)EGFR和皿R2的細(xì)胞類型（人結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SW620)的毒性研究很好的顯示化合物的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)在lOOOnMW上，并不具有明顯 的細(xì)胞毒性作用。
[0071] 對(duì)同時(shí)攜帶激活突變L858R和耐藥突變T790M的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1975也表 現(xiàn)出較強(qiáng)的抗增殖活性，其IC5化到34nM，而對(duì)攜帶野生型的EGFR的人表皮癌細(xì)胞系A(chǔ)431表 現(xiàn)出中度的抑制活性，I巧0為62nM。
[0072] 同時(shí)化合物對(duì)高表達(dá)野生型皿R2的人胃癌細(xì)胞系N87抑增殖活性，結(jié)果顯示，所有 合成的化合物均對(duì)野生型的皿R2有明顯的抑制效果，其IC50達(dá)到47nM;W上所有結(jié)果均表 明，我們的化合物具有明顯的抗腫瘤增殖活性，尤其是對(duì)含有EGFR耐藥性突變T790M的腫瘤 類型也具有明顯的活性；對(duì)野生型的EGFR抑制活性較突變型的要低，且對(duì)不表達(dá)EGFR和 肥R2的細(xì)胞沒有明顯的抑腫瘤增殖活性，表明化合物具有明顯的祀點(diǎn)選擇性。
[0073] 經(jīng)抗原刺激后的Τ細(xì)胞對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的殺傷活性：
[0074]
[0076] 經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激后的Τ細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞殺傷活性，一般對(duì)于細(xì)胞的殺傷 作用細(xì)胞比例在20:1時(shí)表現(xiàn)出較好的活性。
[0077] 聯(lián)合治療對(duì)化975腫瘤細(xì)胞的殺傷活性：
[007引
[0079] 對(duì)具有EGFR敏感性突變L858R和耐藥性突變的化975細(xì)胞株經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激后 的Τ細(xì)胞具有明顯的殺傷活性，對(duì)于細(xì)胞的殺傷作用細(xì)胞比例在20:1時(shí)表現(xiàn)出較好的活性， 而聯(lián)合使用時(shí)，與表2結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥時(shí)，化合物對(duì)Τ細(xì)胞治療具有明顯的增強(qiáng)作 用;其中當(dāng)化合物濃度為40nM/L時(shí)表現(xiàn)出最好的殺傷效率。
[0080] 聯(lián)合治療對(duì)A431腫瘤細(xì)胞的殺傷活性：
[0081]
[0082] 對(duì)具有EGFR高表達(dá)的A431細(xì)胞株經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激后的Τ細(xì)胞具有明顯的殺傷活 性，對(duì)于細(xì)胞的殺傷作用細(xì)胞比例在20:1時(shí)表現(xiàn)出較好的活性，而聯(lián)合使用時(shí)，與表2結(jié)果 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥時(shí)，化合物對(duì)Τ細(xì)胞治療具有明顯的增強(qiáng)作用；其中當(dāng)化合物濃度為 40nM/L時(shí)表現(xiàn)出最好的殺傷效率。
[0083] 聯(lián)合治療對(duì)N87腫瘤細(xì)胞的殺傷活性：
[0084]
[0085] 對(duì)具有皿R2高表達(dá)的N87細(xì)胞株經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激后的T細(xì)胞具有明顯的殺傷活 性，對(duì)于細(xì)胞的殺傷作用細(xì)胞比例在20:1時(shí)表現(xiàn)出較好的活性，而聯(lián)合使用時(shí)，與表2結(jié)果 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥時(shí)，化合物對(duì)T細(xì)胞治療具有明顯的增強(qiáng)作用；其中當(dāng)化合物濃度為 40nM/L時(shí)表現(xiàn)出最好的殺傷效率。
[0086] 聯(lián)合治療對(duì)SW620腫瘤細(xì)胞的殺傷活性：
[0087]
[0088] 由于SW620不具有EGFR或肥R2的表達(dá)與突變情況，化合物對(duì)SW620不具有抑制殺傷 作用，因此，當(dāng)聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)T細(xì)胞治療沒有明顯的增強(qiáng)殺傷的作用的。
[0089] 化)-N-[4-[4-[ (3-氣節(jié)氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-哇挫嘟-6-基]-3-川比 咯燒-2-基)丙締酷胺、經(jīng)抗原刺激的T細(xì)胞及兩者聯(lián)合對(duì)小鼠移植瘤的治療效果：
[0090] 由圖3結(jié)果所示，經(jīng)抗原刺激后的T細(xì)胞治療組、化合物治療組及聯(lián)合治療組均能 抑制腫瘤生長，聯(lián)合治療組抑制效果最為明顯，與化合物組和T細(xì)胞治療組相比，瘤重抑制 率W及瘤體積的差異顯著。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，其特征在于，在抗腫 瘤治療中的應(yīng)用，包括給予需要這樣的治療的患者治療有效量的(Ε)-Ν-[4-[4-[(3-氟芐氧 基)-3_氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其藥學(xué)可接 受的鹽和治療有效量的抗原刺激后的T細(xì)胞。 2. EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng)用，其特征在于，增強(qiáng)抗 原刺激后的T細(xì)胞在癌癥治療中的治療功效的方法，包括給予有這樣需要的患者治療有效 量的抗原刺激后的T細(xì)胞和治療有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的 應(yīng)用，其特征在于，其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其可接受的鹽和T細(xì)胞構(gòu)成同一組合物的部分，所述的 T細(xì)胞來自于有這樣需要的患者自身，患者經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后，抽取患者外周血，分離外周 血白細(xì)胞，并在符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞間內(nèi)進(jìn)行篩選培養(yǎng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的 應(yīng)用，其特征在于，其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽和T細(xì)胞提供為用于同時(shí)或不同時(shí) 給藥的分別的組合物，其中所述的T細(xì)胞來自于有這樣需要的患者自身，并經(jīng)過相應(yīng)抗原刺 激和體外培養(yǎng)擴(kuò)增。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng) 用，其中所述的T細(xì)胞來源于有這樣需要的患者自身，相應(yīng)抗原可以根據(jù)不同癌癥類型而有 所不同。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療中的應(yīng) 用，其特征在于，其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽和T細(xì)胞構(gòu)成同一組合物，所述的T細(xì) 胞選自有這樣需要的患者自身，并經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激和體外培養(yǎng)擴(kuò)增。7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、5及6所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療 中的應(yīng)用，其特征在于，其中與(E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基）丙烯酰胺聯(lián)合的抗腫瘤治療為經(jīng)過相應(yīng)抗原刺激的T細(xì) 胞。8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、5及6所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療 中的應(yīng)用，其特征在于，其中治療的癌癥主要選自肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、 頭頸癌、前列腺癌等有EGFR異常表達(dá)或突變的上皮類型腺癌。9. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、5及6所述的EGFR小分子不可逆抑制劑和T細(xì)胞聯(lián)合在抗腫瘤治療 中的應(yīng)用，其特征在于，（E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽在制備用于前述權(quán)利要求中任一項(xiàng) 所述的藥物在聯(lián)合抗腫瘤用途中的應(yīng)用。10. 用于前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聯(lián)合抗腫瘤中的(E)-N-[4-[4-[(3-氟芐氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其藥學(xué)可接受的 鹽。
【文檔編號(hào)】A61K31/517GK105998068SQ201610338285
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】曾驥孟, 胡鵬, 唐振州, 蒙明慧, 陳彪
【申請(qǐng)人】江蘇醫(yī)諾萬細(xì)胞診療有限公司