一種多孔細(xì)胞外基質(zhì)支架制備技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種孔徑可控且高度連通的細(xì)胞外基質(zhì)支架制備技術(shù)，解決細(xì)胞外基質(zhì)支架材料孔徑小、細(xì)胞化差的問題。具體是將可降解聚合物微球聚集體植入到宿主皮下、肌肉或者腹腔后，宿主細(xì)胞會遷移到微球聚集體孔隙內(nèi)部從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞化，先后將細(xì)胞化的微球聚集體支架材料進(jìn)行聚合物洗脫和脫細(xì)胞處理后，即可得到細(xì)胞外基質(zhì)支架。該工藝可以通過控制的聚合物微球大小來控制支架孔徑大小，同時也可以通過控制聚合物微球粘接程度來控制支架的連通度。本發(fā)明所制備的多孔細(xì)胞外基質(zhì)支架在干細(xì)胞移植，軟骨修復(fù)，皮膚修復(fù)等組織工程領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種多孔細(xì)胞外基質(zhì)支架制備技術(shù)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種組織工程領(lǐng)域多孔支架制備技術(shù)，具體說是一種孔徑可控且高度連通的細(xì)胞外基質(zhì)支架制備技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]支架材料是組織工程三要素之一，根據(jù)來源不同主要分為人工合成材料和天然材料兩大類。其中天然材料來源于生物組織或器官，與人工合成材料相比，具有更好的生物相容性，因而一直是組織工程研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞外基質(zhì)支架是一類獨(dú)特的天然材料，是通過物理或化學(xué)的方法將器官或組織中的免疫原成分去除得到的。細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分較復(fù)雜，主要包括膠原、蛋白多糖、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等，根據(jù)組織、器官及種屬的來源不同，其基本結(jié)構(gòu)成分也有所不同。此外，大量研究表明雖然經(jīng)過復(fù)雜脫細(xì)胞處理，脫細(xì)胞基質(zhì)材料仍保留了部分天然組織中的一些重要生物活性物質(zhì)，如透明質(zhì)酸酶、纖維結(jié)合蛋白、硫酸軟骨素、VEGF、TGF-13、EGF及BMP-4等。這些生物活性物質(zhì)在支架材料植入體內(nèi)后，隨著材料降解緩慢釋放，參與調(diào)節(jié)多種與組織修復(fù)密切相關(guān)的細(xì)胞的迀移、增殖和分化，在促進(jìn)組織修復(fù)、重建與血管再生方面發(fā)揮重要作用。同時，細(xì)胞外基質(zhì)支架能夠?yàn)榻M織和細(xì)胞的生長提供力學(xué)支持。
[0003]在支架材料植入體內(nèi)后需要與器官組織實(shí)現(xiàn)整合并完成血管化，從而發(fā)揮其修復(fù)功能，這就需要支架材料具有可控且連通的孔結(jié)構(gòu)，以使得植入部位周圍組織細(xì)胞能夠迀移到支架內(nèi)部。然而，目前所制備的脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料普遍存在結(jié)構(gòu)不可控、孔徑過小且連通差的問題，從而限制了細(xì)胞迀移以及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的傳輸，進(jìn)而影響修復(fù)組織器官的重塑和再生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對細(xì)胞外基質(zhì)支架材料存在的問題，本專利發(fā)明了一種孔徑可控且高度連通的細(xì)胞外基質(zhì)支架制備方法。由于宿主本身也是生物反應(yīng)器，在將聚合物材料模板植入到宿主皮下，肌肉或者腹腔后，宿主細(xì)胞會迀移到聚合物支架材料孔隙內(nèi)部從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞化，將細(xì)胞化的支架材料進(jìn)行聚合物洗脫和脫細(xì)胞處理后，可以得到細(xì)胞外基質(zhì)支架。微球或粒子致孔在制備組織工程支架材料方面有廣泛的應(yīng)用，可以通過控制微球或粒子大小來控制支架孔徑大小，同時可以通過控制微球或粒子粘接程度來控制所制備支架的連通度?；诖吮景l(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0005]步驟一，以生物可降解高分子為原料，通過乳化溶劑揮發(fā)方法制備具有不同粒徑大小的聚合物微球，將不同粒徑的微球加入到聚四氟乙烯圓孔中，恒溫加熱一定時間，使微球之間相互粘接形成微球聚集體支架；
[0006]步驟二，將上述微球聚集體支架埋植到實(shí)驗(yàn)動物包括豬，狗，羊，兔子，大鼠，小鼠皮下、肌肉或者腹腔部位2周到3個月時間，宿主細(xì)胞會向微球聚集體支架孔隙內(nèi)部迀移，從而使其細(xì)胞化;在埋植一定時間后將動物暫時麻醉，將實(shí)現(xiàn)細(xì)胞化的微球聚集體支架取出，縫合切口；
[0007]步驟三，將步驟二中完成細(xì)胞化的聚合物支架，用梯度乙醇脫水后，再將其置于三氯甲烷或者二氯甲烷中振蕩一定時間除去聚合物，得到含有細(xì)胞的基質(zhì)支架；
[0008]步驟四，將步驟三得到的含有細(xì)胞的基質(zhì)支架，利用SDS和核酸酶等進(jìn)行脫細(xì)胞處理，再經(jīng)過冷凍干燥處理，便可得到多孔的脫細(xì)胞支架，以用于組織修復(fù)或研究。
[0009]其中，生物可降解高分子可以是合成高分子聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)，聚己內(nèi)酯(PCL)，聚羥基脂肪酸酯(PHA)，聚氨酯(PU)中的一種或幾種。
[0010]本發(fā)明專利與現(xiàn)有脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料相比，突出的優(yōu)點(diǎn)在于:1、目前的脫細(xì)胞基質(zhì)支架結(jié)構(gòu)致密，且細(xì)胞迀移困難，進(jìn)而影響組織修復(fù)，本發(fā)明利用聚合物微球聚集體支架為模板來制備孔徑可控且連通的細(xì)胞外基質(zhì)支架，成功解決了細(xì)胞外基質(zhì)支架材料致孔的問題;2、免疫排斥是目前所有組織工程支架都存在的問題，本發(fā)明利用聚合物洗脫和脫細(xì)胞方法，洗脫掉聚合物微球和核酸等具有免疫原性的物質(zhì)，從而使所得到支架沒有免疫原性;3、可以通過控制植入聚合物微球聚集體支架的微球粒徑的大小、熱熔時間長短來控制細(xì)胞外基質(zhì)支架孔徑大小和聯(lián)通度。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ]實(shí)施例1:以PCL微球聚集體為模板制備可控孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞基質(zhì)支架
[0012]PCL微球制備:采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備PCL微球。稱取10.0克分子量為80000的PCL，加入到200ml 二氯甲烷中，室溫攪拌溶解至澄清，制得濃度分?jǐn)?shù)為5 % (m/v)的PCL溶液。將上述PCL溶液加入到1800ml的2%聚乙烯醇(PVA)溶液中，在100rpm條件攪拌，室溫下?lián)]發(fā)去除二氯甲烷，靜置沉淀收集底部微球，蒸餾水洗滌5次去除殘余PVA，將收集的微球粒子冷凍干燥得到PCL微球。
[0013]PCL微球聚集體的制備:將0.5克PCL微球置于聚四氟乙烯板上直徑為1.0cm，高度為0.8cm的圓孔中，在80°C條件下恒溫加熱I小時，使微球間相互粘接熔融，得到PCL微球聚集體。
[0014]PCL微球聚集體皮下埋植:將直徑為1.0cm PCL微球聚集體支架用75%醫(yī)用酒精滅菌I小時，再用無菌生理鹽水洗滌。將大鼠用10% (m/v)水合氯醛麻醉后，背部兩側(cè)脫毛
1.5cm X 1.5cm大小面積，剪開長約1.2cm的切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出1.5cm大小的空腔，將PCL微球聚集體支架置于到皮下空腔中，縫合切口后消毒飼養(yǎng)。
[0015]細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備:在皮下埋植I個月后，將大鼠用異氟烷短暫麻醉，在植入材料附近部位脫毛切口，將細(xì)胞化的微球聚集體支架與周圍組織剝離后取出，縫合切口后消毒。將細(xì)胞化的微球聚集體支架置于生理鹽水中洗滌并去除周圍多余組織，再將其依次置于50%、70%、無水乙醇中脫水各2小時，最后置于三氯甲烷中振蕩72小時，以洗掉聚合物PCL。真空干燥后再于I % SDS中震蕩洗滌48小時，再用濃度為0.2g/L的DNA酶和濃度為
0.02g/LRNA酶的溶液37°C震蕩24小時去除核酸，最后用生理鹽水洗滌5次，冷凍干燥后環(huán)氧乙烷滅菌備用。
[0016]實(shí)施例2:以PLA微球聚集體為模板制備可控孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞基質(zhì)支架
[0017]PLA微球制備:稱取8.0克分子量為200000的PLA，加入到200ml三氯甲烷中，室溫攪拌溶解至澄清，制得濃度分?jǐn)?shù)為4% (m/v)的PLA溶液。將上述PLA溶液加入到1800ml的3 %聚乙烯醇(PVC)溶液中，在SOOrpm條件攪拌，室溫下?lián)]發(fā)去除三氯甲烷，靜置沉淀收集微球，蒸餾水洗滌5次去除殘余PVA，將收集的微球粒子冷凍干燥得到PLA微球。
[0018]PLA微球聚集體的制備:將0.4克PLA微球置于聚四氟乙烯板上直徑為1.0cm，高度為0.8cm的圓孔中，在200°C條件下恒溫加熱I小時，使微球間相互粘接熔融，得到PLA微球聚集體。
[0019]PLA微球聚集體皮下埋植:將得到直徑為1.0cmPLA微球聚集體支架用75%醫(yī)用酒精滅菌I小時，再用無菌生理鹽水洗滌。將兔子用30% (m/v)烏拉坦麻醉后，背部兩側(cè)脫毛1.4cmX 1.4cm大小面積，剪開長約1.3cm的切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出1.5cm大小的空腔，將PLA微球聚集體支架置于到皮下空腔中，縫合切口后消毒飼養(yǎng)。
[0020]細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備:在皮下埋植I個月后，將兔子用異氟烷短暫麻醉，在植入材料附近部位脫毛切口，將已經(jīng)細(xì)胞化的微球聚集體支架與周圍組織剝離后取出，縫合切口后消毒飼養(yǎng)。將細(xì)胞化的微球聚集體置于生理鹽水中洗滌并去除周圍多余組織，再將其依次置于60%、80%、無水乙醇中脫水各2小時，最后置于二氯甲烷中振蕩96小時，以洗掉聚合物PLA。真空干燥后再于I % SDS中震蕩洗滌72小時，再用濃度為0.25g/L的DNA酶和濃度為
0.025g/LRNA酶的溶液37°C震蕩48小時去除核酸，最后用生理鹽水洗滌7次，冷凍干燥后環(huán)氧乙烷滅菌備用。
[0021]實(shí)施例3:以PLGA微球聚集體為模板制備可控孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞基質(zhì)支架
[0022]PLGA微球制備:稱取10.0克分子量為20000的PLGA，加入到10ml三氯甲烷中，室溫攪拌溶解至澄清，制得濃度分?jǐn)?shù)為1 % (m/v)的PLGA溶液。將上述PLGA溶液加入到1900ml的I % PVA溶液中，在1200rpm條件攪拌，室溫下?lián)]發(fā)去除三氯甲烷，靜置沉淀收集微球，蒸餾水洗滌5次去除殘余PVA，將收集的微球粒子冷凍干燥。
[0023]PLGA微球聚集體的制備:將1.0克PLGA微球置于聚四氟乙烯板上直徑為2.0cm，高度為0.8cm的圓孔中，在60°C條件下恒溫加熱40分鐘，使微球間相互粘接熔融，得到PLGA微球聚集體。
[0024]PLGA微球聚集體皮下埋植:將得到直徑為2.0cmPLGA微球聚集體支架用75%醫(yī)用酒精滅菌I小時，再用無菌生理鹽水洗滌。將羊用速眠新麻醉后，背部兩側(cè)脫毛3.3cmX
3.3cm大小面積，剪開長約2.2cm的切口，用平頭剪刀將皮層與肌肉組織分離出2.5cm大小的空腔，將PLGA微球聚集體支架置于到皮下空腔中，縫合切口后消毒飼養(yǎng)。
[0025]細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備:在皮下埋植I個月后，將羊用異氟烷短暫麻醉，在植入材料附近部位脫毛切口，將已經(jīng)細(xì)胞化的微球聚集體支架與周圍組織剝離后取出，縫合切口后消毒飼養(yǎng)。將細(xì)胞化的微球聚集體支架置于生理鹽水中洗滌并去除周圍多余組織，再將其依次置于70%、90%、無水乙醇中脫水各2小時，最后置于二氯甲烷中振蕩48小時，以洗掉聚合物PLGA。真空干燥后再于I %SDS中震蕩洗滌48小時，再用濃度為0.2g/L的DNA酶和濃度為0.02g/L的RNA酶溶液37 °C震蕩24小時去除核酸，最后用生理鹽水洗滌5次，冷凍干燥后環(huán)氧乙烷滅菌備用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.本專利發(fā)明了一種孔徑可控且高度連通的細(xì)胞外基質(zhì)支架制備技術(shù)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下步驟: 步驟一，以生物可降解高分子為原料，通過乳化溶劑揮發(fā)方法制備具有不同粒徑大小的聚合物微球，將不同粒徑的微球加入到聚四氟乙烯圓孔模具中，恒溫加熱一定時間，使微球之間相互粘接形成微球聚集體支架； 步驟二，將上述微球聚集體支架埋植到實(shí)驗(yàn)動物包括豬，狗，羊，兔子，大鼠，小鼠皮下、肌肉或者腹腔部位2周到3個月時間，宿主細(xì)胞會向微球聚集體支架孔隙內(nèi)部迀移，從而使其細(xì)胞化;在埋植一定時間后將動物暫時麻醉，將已細(xì)胞化的微球聚集體支架取出； 步驟三，將步驟二中完成細(xì)胞化的聚合物支架，用梯度乙醇脫水后，再將其置于三氯甲烷或者二氯甲烷中振蕩一定時間除去聚合物，得到含有細(xì)胞的基質(zhì)支架； 步驟四，將步驟三得到的含有細(xì)胞的基質(zhì)支架，利用SDS和核酸酶等進(jìn)行脫細(xì)胞處理，再經(jīng)過冷凍干燥處理，便可得到多孔的脫細(xì)胞支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔細(xì)胞外基質(zhì)支架制備方法，其中，所述的生物可降解高分子可以是合成高分子聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)，聚L-丙交酯-己內(nèi)酯(PLCL)，聚羥基脂肪酸酯(PHA)，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)，聚氨酯(PU)中的一種或幾種。
【文檔編號】A61L27/36GK105999423SQ201610588945
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】朱美峰, 孔德領(lǐng), 王愷, 李雯
【申請人】南開大學(xué)