Artalbic acid的衍生物的組合物用于制備抗肝纖維化藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Artalbic acid的O?(二氯乙胺基)乙基與O?(二(2?甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物的組合物在抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開并提供了一種由Artalbic acid的O?(二氯乙胺基)乙基與O?(二(2?甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物按照質(zhì)量比為30：70組成的組合物以及將上述化合物按照30：70的質(zhì)量比進(jìn)行混合從而制備本發(fā)明組合物的方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的這種組合物在20ug/ml時(shí)能夠顯著抑制NIH/3T3增殖以及轉(zhuǎn)化生長因子?β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖，具有抗肝纖維化的作用，因此本發(fā)明還提供了Artalbic acid的O?(二氯乙胺基)乙基與O?(二(2?甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物按照質(zhì)量比為30：70組成的組合物在制備抗肝纖維化藥物中的用途。
【專利說明】
Arta I b i c ac i d的衍生物的組合物用于制備抗肝纖維化藥物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量 合成、分泌，而降解絕對(duì)或相對(duì)不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細(xì)胞(HC)壞死， 隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細(xì)胞(FSC)激活，最終以肝臟結(jié)締組織成分的 合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預(yù)后的重要 因素。
[0003] 過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進(jìn)展，證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學(xué)藥、生物制劑、中 藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強(qiáng)抗肝纖維化作用機(jī)制的研 究.中華肝病雜志，2005，8(13): 561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對(duì)與肝星狀細(xì)胞激活相 關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是:減輕肝損傷;抑制星狀細(xì)胞激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生;調(diào)節(jié)細(xì)胞因子紊 亂，促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞凋亡；抑制肝臟成纖維細(xì)胞的增殖以及星狀細(xì)胞激活大量分泌誘 導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的增殖。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2011年發(fā)表（Antonella Maggio et al .， 2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily·Tetrahedron Letters，52(2011 )4543-4545)的化合物，我 們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合 物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗肝纖維化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗肝纖 維化活性。
[0006] 由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子 會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞 上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為30%和70%。
[0008]
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上 可接受的鹽具有同樣的藥效。
[0011] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗成纖維細(xì)胞增殖的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。
[0012] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗生長因子誘導(dǎo)的成纖維 細(xì)胞增殖的活性，組合物是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物，它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以 及相關(guān)藥物的制備。
[0013] 以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1化合物Artalbic acid的制備
[0015] 化合物Artalbic acid(I)的制備方法參照Antonella Maggio等人發(fā)表的文獻(xiàn) (Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily. Tetrahedron Letters ,52 (2011)4543-4545)的方法。
[0016]
[0017] 實(shí)施例2 Artalbic acid的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0018] 將化合物1(26611^，1.00111111〇1)溶于1011^苯，向溶液中加入四丁基溴化銨〇8八8) (0.088)，1，2-二溴乙燒(3.76(^，20.00_〇1)和61]1]^的50%氫氧化鈉溶液。混合物在40攝氏 度攪拌lehieh之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然 后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌5次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100:1.0，v/V)， 收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(272mg，73% )。
[0019] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5ll.41(s,lH),6.06(s,lH),5.76(s,lH),4.99(s,lH), 4.71(s,1H),4.56(s,1H),3.86(s,2H),3.54(s,2H),2.65(s,1H),2.43(s,2H),2.33(s,2H), 2.10(s,lH),1.64(s,3H),1.54(s,lH),1.44(s,2H),0.95(s,3H).
[0020] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.95(s),175.93(s),149.13(s),148.15(s),117.05 (s),109.43(s),81.86(s),70.27(s),57.68(s),41.26(s),39.07(s),38.86(s),35.69(s), 33.36(s),30.72(s),20.44(s),18.42(s).
[0021] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci7H26Br〇4：373.1014；found 373.1017.
[0022]
[0023] 實(shí)施例3 Artalbic acid的0_(二氯乙胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0024] l、Artalbic acid的0_(二輕乙胺基）乙基衍生物的合成
[0025] 將化合物II(187mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5.0mmol)，碘化鉀（252mg，1.5mmol)和二乙醇胺（1051mg，lOmmol)，混合物加熱回流lh。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和 食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。 產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮=100: l.〇，v/v)，收集黃色集中洗脫 帶并揮去溶劑即得到化合物Artalbic acid的0_(二輕乙胺基）乙基衍生物的淡黃色固體 (146.9mg,74%)〇
[0026] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl8.72(s，lH)j6.11(s，lH)，5.80(s，lH)，5.14(s，lH)， 4.73(s,lH),4.63(s,lH),3.57(s,2H),3.45(s,4H),2.70(d,J=15.6Hz,3H),2.60(s,4H), 2.50(s,2H),2.46(s,2H),2.33(s,lH),1.88(s,2H),1.68(s,3H),1.62(d,J=19.9Hz,3H), 1.02(s,3H).
[0027] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5202.01(s),176.11(s),149.21(s),148.55(s),117.15 (s),109.60(s),81.93(s),67.25(s),59.28(s),57.88(s),56.83(s),53.74(s),41.36(s), 39.24(s),38.93(s),35.88(s),30.82(s),20.61(s),18.49(s).
[0028] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C2iH36Ni〇6:398.2543;found:398.2547〇
[0029]
[0030] Artalbic acid的0_(二輕乙胺基）乙基衍生物
[0031] 2、Artalbic acid的0_(二氯乙胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0032] 合成足夠多的Artalbic acid的0_(二輕乙胺基）乙基衍生物，將Artalbic acid的 〇-(二輕乙胺基）乙基衍生物(0. l〇〇g，〇. 5mmol)溶于4mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(0.238g， 2mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃 縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.2，v/v)，得到化合物III的淡黃色 固體（145.4mg，67%)。
[0033] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl3.05(s，lH)，S6.05(s，lH)，5.75(s，lH)，4.67(s，2H)， 4.58(d,J = 7.5Hz,lH) ,3.68(s,4H) ,3.50(s,2H) ,2.86(s,2H) ,2.74(s,2H) ,2.62(d,J = 0.9Hz,3H),2.44(s,2H),2.38(s,2H),2.22(s,lH),1.61(s,3H),1.49(s,lH),1.42(s,2H), 0.95(s,3H).
[0034] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.68(s),175.56(s),148.88(s),147.80(s),116.82 (s),109.05(s),81.60(s),66.70(s),57.44(s),55.79(s),53.30(s),41.03(s),39.21(s), 38.80(s),38.49(s),35.44(s),30.38(s),20.17(s),18.05(s).
[0035] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C2iH34Cl2N〇4+:434.1865;found:434.1861。
[0036]
[0037] 實(shí)施例4 Artalbic acid的0_(二（2-甲硫基乙基）胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0038] 制備足夠多的化合物III，將化合物III(0.217g，0.5mmol)溶于10mL乙醇，室溫下 加入甲硫醇鈉(〇.21g，3mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱 層析進(jìn)行純化(石油醚/丙酮1 〇〇: 〇. 3，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.158g，69%)。
[0039] 4 MMR(500MHz，Chloroform-dl)Sl8.86(s，lH)，6·14(s，lH)，5.82(s，lH),5.33 (s，lH)，4.75(s，lH)，4.62(s，lH)，3.54(s，2H)，2.86(s，lH)，2.72(dd，J=18.2,6·8Ηζ, 11H),2.50(s,2H),2.39(s,2H),2.12(s,6H),1.71(s,3H),1.56(s,2H),1.41(s,lH),1.06 (s,3H).
[0040] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.96(s),175.97(s),149.17(s),148.22(s),117.11 (s),109.47(s),81.85(s),67.07(s),57.69(s),53.56(s),52.49(s),41.29(s),39.00(s), 38.79(s),35.63(s),32.15(s),30.74(s),20.43(s),18.43(s),14.87(s).
[0041] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C23H4〇N〇4S2+:434.1865；found:434.1863〇
[0042]
[0043] 實(shí)施例5組合物抗肝纖維化活性
[0044]由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子 會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞 上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。
[0045] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的30mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的70mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物， 使用時(shí)用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0046]實(shí)驗(yàn)例1:組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3增殖的抑制作用 [0047] 一、實(shí)驗(yàn)方法：
[0048] NIH/3T3細(xì)胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海細(xì)胞所細(xì)胞庫。
[0049] 將對(duì)數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細(xì)胞用0.25%胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM 培養(yǎng)液(含l〇%FCS)制成lX104cell/ml的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定存活率大于95%，按 每孔100ul加入96孔板中，在37°C、5%⑶ 2培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的 DMEM培養(yǎng)液（含10%FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入 150ulDMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490nm處讀取0D值，結(jié)果以0D49Q表示。
[0050] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0051 ] 1、形態(tài)學(xué)觀察
[0052] NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細(xì)胞增殖的速度 快;而加組合物24h后，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細(xì)胞排列混亂，細(xì) 胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多。化合物III和化合物IV無此作用。
[0053] MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0054] 表1 :MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3增殖的抑制作用 [0055]
[0057] 注:*，與細(xì)胞陰性對(duì)照P〈0.05
[0058] 結(jié)果:組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表 明組合物體外對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用?；衔颕II和化合物IV無此作用。
[0059] 實(shí)驗(yàn)例2:組合物對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-iMTGF-fo)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用
[0060] TGF-&是促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原生成的強(qiáng)活性因子，在細(xì)胞中加入TGF-β dOng/ml 刺激細(xì)胞增殖，再檢測(cè)藥物對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作 用機(jī)理。
[0061 ] 表2 :MTT法檢測(cè)組合物對(duì)TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用
[0062]
[0063] 注:*，與細(xì)胞+TGF 對(duì)照Ρ〈0·05
[0064] 結(jié)果：組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞ΝΙΗ/3Τ3在TGF-fo的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯 著的抑制作用，化合物III和化合物IV無此作用。表明組合物體外對(duì)纖維細(xì)胞增殖的抑制作 用可能是通過干預(yù)TGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
[0065] 結(jié)論:組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10 %小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著 的抑制作用；組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-fo的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作 用。組合物可以用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在 10%小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-比的 誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，不可以用來制備抗肝纖維化藥物。
[0066] 實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0067] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0068] 實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0069] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為30%和70%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為30%和70%充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述組合物抑 制成纖維細(xì)胞增殖。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述組合物抑 制生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖。6. 如權(quán)利要求5所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征為所述生長因子 為TGF-01。
【文檔編號(hào)】C07C323/25GK106038527SQ201610474940
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】丁秋菊
【申請(qǐng)人】南京海澳斯生物醫(yī)藥科技有限公司