一種h5亞型禽流感dna疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及DNA疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方法，所述H5亞型禽流感DNA疫苗由H5亞型禽流感病毒HA基因和真核表達(dá)載體組成。所述的H5亞型禽流感DNA疫苗能夠預(yù)防H5亞型禽流感，減少感染，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)與人類健康具有十分重要的意義。
【專利說(shuō)明】
一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及DNA疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，制約家禽養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的關(guān)鍵疫病因素依然是禽流感疫情的預(yù)防與控 制。從2003年到目前為止，H5N1高致病性禽流感病毒影響了三個(gè)大洲總共63個(gè)國(guó)家或地區(qū)， 各國(guó)均采用了多種有利方法旨在遏制和根除禽流感的爆發(fā)與流行(1!10,2015)。2010年在羅 馬尼亞和保加利亞分離到了位于2.3.2分支的H5N1亞型高致病性禽流感病毒，這是自2005 年以來(lái)該分支的高致病性禽流感病毒首次出現(xiàn)在歐洲(Dundon et al.，2012)。2012年，全 球共有14個(gè)國(guó)家或地區(qū)包括孟加拉國(guó)、印度、不丹、尼泊爾、越南、印尼、柬埔寨、緬甸、日本、 中國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣、中國(guó)香港、以色列和埃及等向WHO報(bào)告了H5N1高致病性禽流感疫情，而在中 國(guó)臺(tái)灣、南非、斯里蘭卡、愛爾蘭和荷蘭等5個(gè)國(guó)家或地區(qū)發(fā)生H5N2低致病性禽流感疫情 (Ramey et al.，2016)。2013年下半年出現(xiàn)位于2.3.4分支的!15_亞型毒株目前已在亞洲和 歐洲多國(guó)的多種鳥類（雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉和野生水禽等）中發(fā)生感染并形成流行情況 (Lee et al. ,2014)，其中包括中國(guó)、日本、韓國(guó)、蒙古、加拿大、俄羅斯西伯利亞、美國(guó)、英 國(guó)、荷蘭、德國(guó)、匈亞利等(Conraths et &1.，2016)。2014年以來(lái)，全世界共有17個(gè)國(guó)家暴發(fā) H5N1高致病性禽流感疫情或在野禽中檢測(cè)到病毒，亞洲和非洲是疫情重災(zāi)區(qū)，而亞洲疫情 則呈現(xiàn)區(qū)域性流行(Arafa et al.，2016;Berhane et al.，2016)。世界各地出現(xiàn)候鳥感染 的報(bào)道也在不斷增加，其中包括天鵝、大雁、野鴨等，而候鳥感染率的升高、感染病毒亞型的 增多、分布地域的擴(kuò)大都暗示著禽流感病毒流行與變異會(huì)加劇(Wawegama et al.，2016; 朱迪國(guó)等，2015)。
[0003] 1996廣東省首次報(bào)道了 H5N1亞型高致病性禽流感病毒的暴發(fā)式流行(Shortridge et al.，1998)。此前，從中國(guó)東南沿海地區(qū)的家鴨和家鵝體內(nèi)只分離出了低致病性H5亞型 禽流感病毒，但是沒(méi)有在雞體內(nèi)分離出病毒。1997年香港雞群中暴發(fā)了 H5N1亞型HPAI疫情， 并引起了 18人的感染，最終造成6人死亡，這是全球首次出現(xiàn)H5N1亞型AIV直接感染人類并 致死的案例(De Jong et &1.，1997)。2004年初，H5亞型HPAI疫情在我國(guó)多個(gè)地區(qū)流行，并 持續(xù)數(shù)月，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)造成了沉重的打擊(Fang et &1.，2008)。2012年，中國(guó)臺(tái)灣與香港 相繼報(bào)道了H5亞型禽流感疫情，而2013年2月在我國(guó)暴發(fā)的H7N9亞型禽流感更是造成了巨 大的損失，引起了世界各國(guó)的廣泛重視(Wang et al. ,2013)。在2013-2014年，我國(guó)因 H5N1 疫情撲殺的家禽超過(guò)36萬(wàn)只，造成這大量撲殺的主要原因是多亞型病毒同時(shí)感染、抗原匹 配度差、免疫抗體水平參差不齊，從而出現(xiàn)自然感染和排毒現(xiàn)象。2015年，我國(guó)多地出現(xiàn)了 H5N2和H5N8亞型禽流感的感染(Kapczynski et al.，2016;Ramey et al.，2016)。
[0004] 當(dāng)前我國(guó)禽流感流行現(xiàn)狀為同時(shí)存在多種不同亞壓型毒株的感染，其中H5亞型高 致病性禽流感主要有2.3.2、2.3.4和7.2分支的病毒混合感染，包括H5N1、H5N2、H5N5、H5N8 和H5N6等多種亞型病毒（Gu et al.，2012;Gu et al.，2011;Song et al.，2015;Wu et al.，2014)。而且出現(xiàn)感染情況的范圍在逐漸擴(kuò)大，幾乎已經(jīng)遍布全國(guó)各地。而從近期感染 情況可以看出，感染多呈散發(fā)，但也有在個(gè)別地區(qū)呈流行趨勢(shì)。流行毒株在不斷的變異，包 括出現(xiàn)不同分支的新毒株及其他亞型毒株，例如H5N3亞型感染鴨的報(bào)道（Deriabin et al.,2007；Nicholson et al·，2001;Stephenson et al.,2005；Stephenson et al., 2003)。耶亞型高致病性禽流感疫情爆發(fā)的區(qū)域相對(duì)集中，目前主要集中在中東、東南亞和 南亞，而且疫情的爆發(fā)呈明顯的季節(jié)性，多為寒冷的月份(朱迪國(guó)等，2015)。H5亞型禽流感 在我國(guó)長(zhǎng)期大范圍的存在，呈現(xiàn)反復(fù)感染與不斷變異，對(duì)多地區(qū)造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失， 且感染禽類的發(fā)病情況日趨復(fù)雜化，已成為危害養(yǎng)殖業(yè)與人類健康事業(yè)的重要破壞性因 素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方 法，所述H5亞型禽流感DNA疫苗能夠預(yù)防H5亞型禽流感，能夠解決上述技術(shù)問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種H5亞型禽流感DNA疫苗，該疫苗由H5亞型禽流感病毒 HA基因和真核表達(dá)載體組成。
[0007] 所述 HA 基因?yàn)?H5 亞型禽流感病毒 A/chicken/Guangdong/E85/2011 (H5N1)的 HA 基 因，其序列如HAseq所示;或HA基因的密碼子優(yōu)化型optiHA基因，其序列如optiHAseq所示。
[0008] 所述真核表達(dá)載體為限制性內(nèi)切酶SacI或EcoRI和Nhel同時(shí)酶切質(zhì)粒pCAGGK(卡 納抗性)得到的載體片段。
[0009] 所述H5亞型禽流感DNA疫苗的制備方法，包括如下步驟
[0010] S1.獲取野生H5亞型禽流感病毒的HA基因，其序列如HAseq所示；
[0011] S2.獲取將H5亞型禽流感病毒HA基因根據(jù)雞的密碼子偏嗜性優(yōu)化的optiHA基因， 其序列如optiHAseq所示；
[0012] S3.利用內(nèi)切酶處理S1和S2獲取的目的基因 HA和optiHA與真核表達(dá)載體；
[0013] S4.回收目的片段與載體片段，連接轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性菌落后，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒 定。
[0014] 步驟S1 中，擴(kuò)增H5亞型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/E85/2011 (H5N1)的HA基 因的引物的5 '端添加的酶切位點(diǎn)為EcoRI，3 '端添加的酶切位點(diǎn)為NheI，引物序列如下：
[0015] E85-F CCGGAATTCATGGAGAAAATAATGCTTC
[0016] E85-R CTAGCTAGCTTCAAATGCAAATTCTG
[0017]所述H5亞型禽流感DNA疫苗為主要活性成分制備的預(yù)防或免疫治療H5亞型禽流感 的疫苗和藥物。
[0018] 所述5亞型禽流感DNA疫苗在制備或免疫治療H5亞型禽流感的疫苗和藥物中的用 途。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述的H5亞型禽流感DNA疫苗及其制備方法，能夠預(yù) 防H5亞型禽流感，減少感染，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)與人類健康具有十分重要的意義。
【附圖說(shuō)明】：
[0020] 圖1為本發(fā)明E85病毒HA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，該圖中M:DL2000; 1、2: E85病毒HA基因。
[0021]圖2為本發(fā)明H5亞型禽流感病毒HA基因的優(yōu)化前后的密碼子適用指數(shù)CAI對(duì)比結(jié) 果。
[0022]圖3為本發(fā)明H5亞型禽流感病毒HA基因的優(yōu)化前后GC含量對(duì)比。
[0023]圖4為本發(fā)明H5亞型禽流感病毒HA基因的優(yōu)化前后最優(yōu)密碼子使用頻率F0P對(duì)比 結(jié)果。
[0024] 圖 5 為本發(fā)明質(zhì)粒 pUCoptiHA 酶切分析，其中，M:DL5000;l:pUCoptiHA/SacI/NheI; 2：pUCoptiHA/NheI；3：pUCoptiHA/SacI〇
[0025] 圖6為本發(fā)明質(zhì)粒pCAGGKHA酶切分析，其中Μ: DL5000; 1: pCAGGK;
[0026] 2:pCAGGKHA；3:pCAGGKHA/EcoRI；4：pCAGGKHA/NheI；5：
[0027] pCAGGKHA/EcoRI/Nhel。
[0028] 圖 7 為本發(fā)明質(zhì)粒 pCAGGKopt iHA 酶切分析 Μ: DL5000; 1: pCAGGK; 2: pCAGGKopt iHA; 3:pCAGGKoptiHA/SacI；4:pCAGGKoptiHA/NheI；
[0029] 5:pCAGGKoptiHA/SacI/NheI〇
[0030] 圖8為本發(fā)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞間接免疫熒光的結(jié)果(200X)了，其中A.未轉(zhuǎn)染的 293T細(xì)胞;B.轉(zhuǎn)染pCAGGK 的 293T細(xì)胞;C.轉(zhuǎn)染pCAGGKHA 的 293T細(xì)胞;D.轉(zhuǎn)染pCAGGKoptiHA 的293T細(xì)胞。
[0031] 圖9為本發(fā)明H5亞型DNA疫苗質(zhì)粒在293T細(xì)胞中蛋白表達(dá)產(chǎn)物Western-blot結(jié)果 M:蛋白Marker; 1.未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞；2 .轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGK的293T細(xì)胞；3 .轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCAGGKHA的293T細(xì)胞;4.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGKoptiHA的293T細(xì)胞;5. E85病毒病毒尿囊液的陽(yáng)性 對(duì)照。
[0032]圖10為本發(fā)明H5亞型禽流感DNA疫苗免疫后HI抗體的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0033]為了使本發(fā)明的發(fā)明目的，技術(shù)方案及技術(shù)效果更加清楚明白，下面結(jié)合具體實(shí) 施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例及相關(guān)附圖，僅用于解 釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0034]材料與方法 [0035] 1 材料
[0036] 1.1病毒、H5陽(yáng)性血清和抗原
[0037] 本實(shí)驗(yàn)中使用的H5亞型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/E85/2011(H5Nl)(以下 簡(jiǎn)稱E85)和由其制備的陽(yáng)性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程 實(shí)驗(yàn)室保存。
[0038] 1.2載體質(zhì)粒
[0039]真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGK(卡納抗性)和基因工程菌DH5a均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)人獸共患 病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。
[0040] 1.3SPF雞
[0041 ] 3周齡SPF(Specific Pathogen Free)白來(lái)航雞和9-10日齡SPF雞胚購(gòu)自廣東省新 興大華農(nóng)禽蛋有限公司;本實(shí)驗(yàn)中涉及活病毒的試驗(yàn)均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物安全三級(jí) (Animal biosafety level 3，ABSL_3)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
[0042] 1.4主要試劑
[0043] Trizol LS Reagent、Pfx Taq DNA聚合酶、無(wú)血清培養(yǎng)基Opti_MEM、Gibco 胎牛血 清、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)反 轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；RNA酶抑制劑（Rib nuclease Inhibitor，RNAsin)、dNTP、ExTaq 酶、T載體(pMD19_T vector)購(gòu)自TaKaRa公司；核酸染料(EB替代物)購(gòu)自Bioteke公司；兔抗 雞二抗抗體(F8888)購(gòu)自SIGMA-AL0RICH公司；T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自New England Bliolabs公司；通用型DNA純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限 公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)麗公司；DNA marker購(gòu)自東盛生物公司；蛋白 marker和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑和SDS-PAGE蛋白 凝膠試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。
[0044] 一、H5HA基因的獲取及優(yōu)化
[0045] 將含有E85病毒的尿囊液12000r/m離心5min，取上清液250yL到DEPC處理過(guò)的 1.5mL的Eppendorf管中，加入750yL預(yù)冷的Trizol LS Reagent，劇烈振蕩后室溫放置5min， 加250yL氯仿靜置l_2min后充分混合，于4°C離心機(jī)12000r/m離心15min。取600yL上層水相 移至另一新的DEPC處理過(guò)的1.5mL滅菌Eppendorf管中，加入600yL預(yù)冷的異丙醇，顛倒混 勻，-20°C放置30min，4°C12000r/m離心15min，棄去上清液，加入1000yL預(yù)冷的75%乙醇，緩 慢顛倒搖勾，4°C，12000r/m離心10min。棄去上清液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干后，加入41yL DEPC處理水溶解RNA，-40 °C保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄。
[0046] 參照Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄體系中包括以下兩部 分：
[0047] 病毒 RNA(DEPC 水溶）41yL
[0048] 12bp(20pmol/yL) 4yL
[0049] 在41yL病毒RNA(DEPC水溶）中加入4yLl 2bp，置于70 °C水浴鍋中10min，取出后置于 冰上2min。再加入以下試劑：
[0050] 5X M-MLV Buffer 16μ1. dNTPs (2.5minol/pL) 16'uL
[0051 ] M-MLV (5?/μΙ.) 2\ L Rnasiii (401Ι/μ￡) lpL
[0052] 加入以上組分混勻后，置于42°C水浴lh，所得到的E85病毒cDNA置于-20°C保存或 直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0053] 應(yīng)用軟件〇lig〇7設(shè)計(jì)H9HA基因的擴(kuò)增引物為E85-F、E85-R，如表1所示，同時(shí)加入 酶切位點(diǎn)，以E85病毒cDNA做模版，利用pfx高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增HA基因。
[0054] 表1E85病毒HA基因 PCR引物
[0055]
[0056] 反應(yīng)體系和條件如下： l〇xpfx buffer 5 pL 10 χ pfx enhancer Buffer 5 μΙ dNTP 4 [iL cDNA 模板 3 pL 50mg MgS04 1 |iL
[0057] E85-F 0.5 μL^ E85-R 0.5 μL Pfx DNA Polymerase 0.:5. pL ddH20 30.5 pL Totle 50 pL
[0058] 反應(yīng)條件：94°(：預(yù)變性21^11;94°(：158,581€3〇8,681€21^1130個(gè)循環(huán) ；最后68°(：延 伸lOmin。
[0059] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂凝膠中電泳。其電泳結(jié)果見圖1，電泳顯示得到了一條 位于2000bp下方的條帶，與預(yù)期大小一致。
[0060] 切下目的片段的DNA條帶后，按照PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行：平 衡柱子，向吸附柱中加入500yL的平衡液BL，12000r/m離心lmin。切下含有目的片段的凝膠， 稱重，按照l(shuí)〇〇yL/mg凝膠的比例加入PC緩沖液，55°C水浴融化凝膠。將融化后的凝膠液轉(zhuǎn)入 離心柱中，12000r/m離心lmin，棄掉收集管中的廢液。加入600yL漂洗液PW，12000r/m離心 lmin，棄掉收集管中的廢液，再加入700yL漂洗液PW，12000r/m離心lmin，棄掉收集管中的廢 液，12000r/m離心2min，盡量出去漂洗液。將吸附柱放入新的離心管中，加30yL滅菌去離子 水，12000r/m離心2min。取2yL回收產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或者直接檢測(cè)濃度，檢測(cè)回收 效果，將部分產(chǎn)物送上海英濰捷基生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如表2中HAseq。
[0061 ] 二、H5HA基因的密碼子優(yōu)化
[0062]根據(jù)測(cè)序獲得的E85病毒HA基因序列及雞的基因組序列，利用密碼子優(yōu)化軟件 OPTHWIZ設(shè)計(jì)合成雞的密碼子偏嗜性的optiHA基因，其序列如表2中optiHAseq。將optiHA 基因片段以合適的酶切位點(diǎn)（5'SacI和3'NheI)連接到載體pUC57-Amp以便于獲得大量克 隆，以上操作均有蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
[0063]將E85病毒HA基因的開放閱讀框根據(jù)雞密碼子偏嗜性優(yōu)化后，密碼子適用指數(shù) (CAI)從原來(lái)的0.78變?yōu)楝F(xiàn)在的0.93，如圖2，最基因中GC含量由原來(lái)優(yōu)化前的40 %變?yōu)閮?yōu) 化后的54 %，如圖3，最優(yōu)密碼子使用頻率(F0P)由44 %上升到80 %，如圖4，優(yōu)化前后序列對(duì) 比如下表2,表2中下劃線表示優(yōu)化后的差異序列。
[0064] 表2優(yōu)化前后HA與optiHA核苷酸對(duì)比
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] 二、H5亞型DNA疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建及抽提
[0069] 抽取質(zhì)粒pUCoptiHA，利用SacI和Nhel限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pUCoptiHA進(jìn)行雙酶 切。酶切反應(yīng)體系如下： l〇x buffer 4 gL DNA 模板 2Q pL Sad 2.5 μL
[0070] Nhei 2.5 pL 去離子水 21 μL Totle 50 μL
[0071] 將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，電泳顯示獲得了 1700bp左右的條帶，如圖5所示。 將切下條帶按照天根通用型DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行膠回收，送測(cè)序。序列比對(duì)與 op t i HA-致，無(wú)位點(diǎn)突變，說(shuō)明密碼子優(yōu)化基因 op t i HA合成正確。
[0072] 利用SacI或EcoRI和Nhei限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pCAGGK進(jìn)行進(jìn)行單酶切和雙酶切， 利用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)酶切情況，回收雙酶切產(chǎn)物(線性PCAGGK)，按照天根通用型DNA純化 回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
[0073]分別將回收的E85的HA基因及optiHA基因與表達(dá)質(zhì)粒pCAGGK連接，連接體系如下： T4 DNA Ligase buffer ΙμΕ T4DNALigase (5U,'VL)
[0074] pCAGGIC (50ng/LiL) 2pL 目的基因片段
[0075] 將上述混合物混勻，16°C連接過(guò)夜。將獲得的連接產(chǎn)物10yL加到50uL感受態(tài)細(xì)胞 DH5a中，輕輕混勻，冰浴30min;42°C熱沖擊lmin后，迅速冰浴3~5min;加800yL不含抗菌素 的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37°C，180r/m搖動(dòng)50min; 3000r/m離心5min;棄去300yL上清， 將剩下的培養(yǎng)基吹吸混勻;取上述菌液涂布于含卡納青霉素(終濃度為1 〇〇yg/mL)的LB固體 選擇培養(yǎng)基平板上，待菌液完全吸收后放入溫箱，37°C倒置培養(yǎng)12-16h。
[0076] 從每個(gè)培養(yǎng)基平板中隨即挑取8個(gè)單菌落接種于10ml含100yg/mL卡納青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩（200r/m)培養(yǎng)12h-16h后，用天根質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，抽提 質(zhì)粒方法參考說(shuō)明書。將質(zhì)粒抽提產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果挑選出3個(gè)疑似陽(yáng) 性克隆，對(duì)疑似陽(yáng)性克隆的抽提產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切鑒定。
[0077] 將質(zhì)粒pCAGGKHA進(jìn)行酶切處理(EcoRI和Nhel)，得到了一條位于1500bp和2000bp 之間的片段條帶，如圖6,回收該片段后送測(cè)序，同時(shí)送質(zhì)粒pCAGGKHA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與E85 病毒HA基因成功比對(duì)，無(wú)突變，說(shuō)明質(zhì)粒pCAGGKHA構(gòu)建成功。
[0078] 質(zhì)粒pCAGGKoptiHA用SacI和Nhei雙酶切處理，得到了一條位于1500bp和2000bp之 間的片段條帶，如圖7，測(cè)序結(jié)果與optiHA序列一直，無(wú)突變位點(diǎn)，表明質(zhì)粒pCAGGKoptiHA構(gòu) 建正確。
[0079] 將獲得的陽(yáng)性克隆菌按1:1000擴(kuò)大培養(yǎng)，使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(德國(guó)MN 公司）抽提質(zhì)粒，步驟如下:將l〇〇mL菌液，用50mL離心管分多次以5000-10000r/m離心，每次 10min，每次棄菌液上清;加8mL的RES-EF于上述離心管中，振蕩，重懸菌體；向上述離心管中 加8mL的LYS-EF，顛倒8-10次，室溫放置5min;加8mL的NEU-EF于上述混合液中，上下顛倒ΙΟ-? 5次 ，冰上放置5min; 潤(rùn)洗柱子， 從柱子邊緣加 15mL 的 EQU-EF ， 待柱中的 液體過(guò)濾完后 ，將上 述混合液加入柱中；待柱中液體過(guò)濾完后，從柱子邊緣加5mL的FIL-EF;待柱中液體過(guò)濾完 后，棄濾膜，加35mL的ENDO-EF到柱中；加15mL的WASH-EF于柱中，待柱中液體過(guò)濾完后，將柱 子放在15mL離心管上，加5mL的ELU-EF，待柱中液體全部過(guò)濾到離心管中；向離心管中加 3.5mL的常溫異丙醇，搖勻后靜置2min。12000r/m，4°C離心30min;棄上清液，加入2mL 70% 乙醇，12000r/m，離心5min;棄上清液，盡量吸干離心管底部液體，開蓋放置5min;向管中加 200yL H2〇-EF，使白色沉淀全部溶解;用分光光度儀測(cè)提取質(zhì)粒的濃度后保存。
[0080] 三、H5亞型疫苗質(zhì)粒的體外表檢測(cè)達(dá)
[0081 ]在轉(zhuǎn)染前20-30h，將293T細(xì)胞均勻鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90 %左 右進(jìn)行轉(zhuǎn)染；每孔用500yL Opti-MEM稀釋4yg質(zhì)粒，吹打混勾；向質(zhì)粒稀釋液中加入10yL Lipofectamine 2000，并輕輕震蕩混勻；室溫下孵育15-20min;將6孔細(xì)胞板中的培養(yǎng)液吸 出并使用Opti-ΜΕΜ或PBS洗2-3次，并加400yL Opti-MEM培養(yǎng)液;將靜置了30min的混合液加 入到6孔板中，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞板使均勻分布;將細(xì)胞板置于C〇2濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48h，檢測(cè)表達(dá)情況。
[0082]間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)在6孔板中轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞，經(jīng)PBS (pH7.4)洗 2次，用中性甲醛固定15min后，PBS洗滌2次，加上適量1:100稀釋的H5亞型的AIV陽(yáng)性血清， 37°C作用60min，roS洗滌3次，每次5min，然后避光加入lmL的1:320稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗 雞二抗，37 °C作用60min，PBS洗滌3次，加入適量堿性甘油，焚光顯微鏡下觀察熒光。如圖8所 示，結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，表達(dá)的特異性HA蛋白主要分布于細(xì)胞膜上，間接免 疫熒光染色后，能在顯微鏡下呈現(xiàn)出綠色熒光。間接免疫熒光的結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及轉(zhuǎn) 染質(zhì)粒pCAGGK的293T細(xì)胞均檢測(cè)不到熒光信號(hào)，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGKHA和pCAGGKoptiHA的 293T細(xì)胞可觀察到特異性熒光，且密碼子優(yōu)化質(zhì)粒pCAGGKoptiHA轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度顯著高 于未優(yōu)化的野生型質(zhì)粒pCAGGKHA，如圖8，說(shuō)明構(gòu)建的質(zhì)粒pCAGGKHA和pCAGGKopt iHA可以表 達(dá)HA特異性蛋白，且優(yōu)化組質(zhì)粒表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未優(yōu)化組質(zhì)粒的表達(dá)水平。
[0083] Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)裂解之前將PMSF和RIPA按照1:100的比例混勻 (現(xiàn)用現(xiàn)配）；將在6孔板表達(dá)的外源蛋白的293T細(xì)胞，用PBS清洗3次后，加入上述混合液(每 孔100uL)，反復(fù)吹打，并收集至1.5mL離心管中；5000r/m 4°C離心5min，取上清與5XSDS混 合，沸水中煮1 〇min; 5000r/m4 °C離心5min，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0084] 蛋白膠的配置參考碧云天SDS-PAGE凝膠配置試劑盒。在進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳 時(shí)，加入樣品，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照孔與陰性對(duì)照孔。先恒壓80V電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入下層膠后， 恒壓120V電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部。電泳完畢后，根據(jù)目的蛋白大小切膠，測(cè)量膠片大 小，將切好的膠置于轉(zhuǎn)膠緩沖液中室溫?fù)u晃平衡5min;裁剪硝酸纖維素膜和濾紙;將切好的 硝酸纖維素膜置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min，同時(shí)浸泡濾紙；用濕電轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，根據(jù) 目的蛋白大小設(shè)定轉(zhuǎn)膜條件和時(shí)間。
[0085]轉(zhuǎn)膜完成后，取下硝酸纖維素膜，用TBST漂洗3次，每次5min，漂洗后將硝酸纖維素 膜放入加有BSA封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床2h，或者4°C冰箱過(guò)夜;將封閉后的硝酸纖維素 膜放入含有TBST的洗缸中搖床上漂洗3次，每次5min，放入一抗中（1:100的H5亞型AIV陽(yáng)性 血清）室溫低速孵育2h;回收一抗，將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中室溫?fù)u床漂洗3次，每次 5min，然后將漂洗過(guò)的硝酸纖維素膜放入稀釋的二抗（鼠抗雞抗體）中，避光室溫孵育lh，孵 育后將硝酸纖維素膜在TBST洗缸中洗3次，每次lOmin。用掃膜儀進(jìn)行掃膜，分析處理圖片后 保存。
[0086]從Western blot結(jié)果看出，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGK的293T細(xì)胞裂解產(chǎn)物均 無(wú)特異性條帶，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGKHA和pCAGGKoptiHA的293T細(xì)胞裂解產(chǎn)物均有約70KDa大 小的特異性條帶，與E85病毒尿囊液的陽(yáng)性條帶一致，且質(zhì)粒pCAGGKoptiHA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞條帶 比質(zhì)粒pCAGGKHA的濃。說(shuō)明質(zhì)粒pCAGGKHA和pCAGGKopt iHA均能在體外表達(dá)HA特異性蛋白， 且后者表達(dá)蛋白的效率尚于如者，如圖9。
[0087] 五、SPF雞的免疫
[0088] 將3周齡SPF雞隨機(jī)分為3組，每組10只，分別免疫 免后二周以同等劑量進(jìn)行二免，采用大腿肌肉多點(diǎn)注射免疫方式。具體分組情況如下表3:
[0089] 表3實(shí)驗(yàn)分組情況
[0090]
[0091] 六、HI抗體檢測(cè)
[0092]在免疫期間對(duì)每組雞每周采集其靜脈血，分離血清，置-20°C保存?zhèn)溆?，通過(guò)微量 血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)測(cè)定抗體滴度。首先通過(guò)微量血凝法(HA)實(shí)驗(yàn)測(cè)定E85病毒的效價(jià)，可參 照《WHO動(dòng)物流感培訓(xùn)手冊(cè)》進(jìn)行。首先在V型96孔板每排的第1孔至第12孔中加入50yL的 PBS，吸取待檢尿囊液50yL加入第1孔，混勻后取50yL加入第2孔，如此倍比稀釋至第11孔，從 該孔中棄去50yL，第12孔不加尿囊液作為陰性對(duì)照，最后在每孔中加入50yL的1 %的紅細(xì)胞 懸液，輕微振蕩混勾，靜置于室溫下15~30min后判定結(jié)果，出現(xiàn)100 %凝集的病毒的最高稀 釋度即為該樣品的病毒凝集價(jià)。根據(jù)測(cè)定的病毒的HA效價(jià)，配置4倍抗原。
[0093]在V型96孔血凝抑制板每排的第1到第12孔中加入25yL PBS溶液，將被檢血清25yL 加到第1孔，混勻后取25yL至第2孔，依次倍比稀釋到10孔棄去25yL，第11孔留作陽(yáng)性對(duì)照。 每孔中加入25yL的4倍抗原，輕輕搖勻后室溫下作用15min后，每孔中加入25yL的1%的紅細(xì) 胞懸液，室溫作用20min后判定并記錄結(jié)果。
[0094] 從表4和圖10可以看出，PBS對(duì)照組無(wú) HI抗體產(chǎn)生；在首免后pCAGGKHA質(zhì)粒免疫組 及密碼子優(yōu)化型pCAGGKoptiHA質(zhì)粒免疫組的HI抗體滴度均值呈上升趨勢(shì)，在二免后二周 pCAGGKHA質(zhì)粒組HI均值為4 · 51og2，pCAGGKoptiHA組HI均值為5 · 01og2，優(yōu)化質(zhì)粒組在二免 后一周及二免后2周HI抗體均值均高于未優(yōu)化質(zhì)粒組，表明優(yōu)化型質(zhì)粒pCAGGKoptiHA免疫 組能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高的HI抗體水平。
[0095] 表4免疫后HI抗體的動(dòng)態(tài)變化
[0096]
[0097] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其架構(gòu)形式能夠靈活多變，可以派生系列產(chǎn)品。只是做出若干 簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種H5亞型禽流感DNA疫苗，其特征在于，該疫苗由H5亞型禽流感病毒HA基因和真核 表達(dá)載體組成。2. 如權(quán)利要求1所述的H5亞型禽流感DNA疫苗，其特征在于，所述HA基因?yàn)镠5亞型禽流 感病毒六/(：11；^1^11/6皿即(1〇即/^85/2011(!15附）的]^基因，其序列如]^869所示;或撤基因的 密碼子優(yōu)化型optiHA基因，其序列如optiHAseq所示。3. 如權(quán)利要求1所述的H5亞型禽流感DNA疫苗，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為限制 性內(nèi)切酶SacI或EcoRI和Nhe頂每切質(zhì)粒pCAGGK(卡納抗性)得到的載體片段。4. 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的H5亞型禽流感DNA疫苗的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟51. 獲取野生H5亞型禽流感病毒的HA基因，其序列如HAseq所示；52. 獲取將H5亞型禽流感病毒的HA基因根據(jù)雞的密碼子偏嗜性優(yōu)化的optiHA基因，其 序列如optiHAseq所示；53. 利用內(nèi)切酶處理S1和S2獲取的目的基因 HA和optiHA與真核表達(dá)載體；54. 回收目的片段與載體片段，連接轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性菌落后，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。5. 如權(quán)利要求4所述的H5亞型禽流感DNA疫苗的制備方法，其特征在于，步驟S1中，擴(kuò)增 !15亞型禽流感病毒4/(3]1；^1^11/6皿]^(1〇]^/^85/2011(!151'11) 的HA基因的引物的5 '端添加的酶切位點(diǎn)為EcoRI，3 '端添加的酶切位點(diǎn)為Nhel，引物序 列如下： E85-F CCGGAATTCATGGAGAAAATAATGCTTC； E85-R CTAGCTAGCTTCAAATGCAAATTCTG 〇6. 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的H5亞型禽流感DNA疫苗為主要活性成分制備的預(yù)防或 免疫治療H5亞型禽流感的疫苗和藥物。7. 如權(quán)利要求1 _3任一項(xiàng)所述的所述H5亞型禽流感DNA疫苗在制備或免疫治療H5亞型 禽流感的疫苗和藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK106039303SQ201610457461
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】廖明, 焦培榮, 宋慧
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)