一種骨靶向膠束材料以及用該材料制備的姜黃素膠束制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種骨靶向膠束材料及其制備方法，所述膠束材料由阿侖膦酸、透明質(zhì)酸和硬脂酸共價連接而成，其結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明還提供了一種骨靶向姜黃素膠束制劑及其制備方法，所述姜黃素膠束制劑由所述膠束材料包裹姜黃素而成。通過本發(fā)明的膠束材料和膠束制劑，可將姜黃素精確靶向骨腫瘤處，所制備的姜黃素膠束制劑具有包封率高、粒徑小的優(yōu)點，并且還具有明顯的緩釋作用。
【專利說明】
一種骨靶向膠束材料以及用該材料制備的姜黃素膠束制劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及靶向藥物載體和制劑領(lǐng)域，更特別地，涉及一種骨靶向膠束材料以及 以該材料制備的姜黃素膠束制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是一種多發(fā)性疾病，其可以侵入或擴散到身體的各個部位?；蜃儺悓?dǎo)致了 細胞的特異性生長，使局部組織細胞增殖異常，增殖的贅生物的生長和分化無法被正常調(diào) 節(jié)，從而嚴重損害了人體的組織和器官，最終導(dǎo)致人體死亡。惡性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移是一個亟待 解決的問題。據(jù)報道，美國每年都有超過一百萬的新的癌癥患者，其中約50%的患者有骨轉(zhuǎn) 移現(xiàn)象[1]。惡性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程。癌細胞侵入正常組織附近，然后 通過附近的淋巴管壁或血管壁移動，并通過淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)到達身體的其他部位。在 小血管停止后，它們侵入血管壁并迀移到周圍組織并在那里繁殖形成較小的腫瘤。一旦他 們達到了骨，癌細胞必須避免人體的免疫系統(tǒng)的攻擊，因此，他們可能會經(jīng)歷更多的變化， 這意味著新的腫瘤與原發(fā)腫瘤有些不同，這樣使它更難以治療。
[0003] 雖然目前針對腫瘤的治療方法有很多，但多缺乏特異性，而靶向療法因其能靶向 于骨組織，所以在骨轉(zhuǎn)移的治療中受到了廣泛關(guān)注。靶向療法可以將靶向藥物最大限度的 運送到骨，而對其他部位產(chǎn)生較小的影響，這種低風(fēng)險高收益的治療方法無疑為骨轉(zhuǎn)移的 治療迎來了新的契機。
[0004] 目前臨床上已知有效的腫瘤治療藥物很多，但較高的毒性和較低的生物利用度限 制了他們的發(fā)展。納米技術(shù)在近幾年腫瘤的靶向給藥系統(tǒng)方面取得了很大的發(fā)展和應(yīng)用。 納米制劑的粒徑較小，多呈納米級，可以通過細胞膜并穿透血腦屏障，從而提高大分子藥物 的生物利用度。目前常用的納米制劑有脂質(zhì)體、納米粒與聚合物膠束等。藥物通過溶解、包 裹在脂質(zhì)體、膠束內(nèi)部或吸附耦合在粒子表面，從而實現(xiàn)藥物的靶向性和長循環(huán)性。
[0005] 姜黃素是近年來從姜黃的根莖中提取的一種天然的酸類，其分子式為C2iH2〇〇6,分 子量為368。它具有多種生物活性，可作用于各種靶分子諸如細胞因子，生長因子和它們的 受體，轉(zhuǎn)錄因子，酶和基因等，通過調(diào)控細胞增殖和凋亡，實現(xiàn)抗腫瘤，抗氧化，降血脂，抗炎 等作用。其中抗癌作用受到了人們廣泛關(guān)注，因為它有較低的毒副作用、較好的安全性，所 以成為近年來研究的熱點。
[0006] 但是，姜黃素在水里不溶解，所以口服生物利用度較差，且對光熱敏感，這些特點 都使其研究過程和臨床應(yīng)用過程受到很大的限制。因此需要開發(fā)研究更有效的劑型來提高 其溶解度和穩(wěn)定性，進而提高其生物利用度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種骨靶向和腫瘤靶向的膠束材料，由阿 侖膦酸、透明質(zhì)酸和硬脂酸共價連接而成，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0008]
[0009]本發(fā)明還提供了一種上述膠束材料的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)使硬脂酸與透明質(zhì)酸在EDC和DMAP的催化下發(fā)生酯化反應(yīng)，生成透明質(zhì)酸-硬脂
酸：
[0011]
[0012] 2)將步驟1)得到的透明質(zhì)酸-硬脂酸溶解于水中，用鹽酸酸化至pH 2-3;
[0013] 3)向步驟2)得到的溶液中加入EDC、NHS和阿侖膦酸溶液，使透明質(zhì)酸-硬脂酸在 EDC和NHS的催化下與阿侖膦酸發(fā)牛酰胺化反應(yīng)，得到阿侖膦酸-誘明質(zhì)酸-硬脂酸：
[0014]
[0025] 7)微孔濾膜過濾，得到所述姜黃素膠束制劑。
[0026] 優(yōu)選地，所述膠束材料與所述姜黃素的重量比10:1。
[0027]優(yōu)選地，所述溶劑為乙醇。
[0028]優(yōu)選地，步驟4)中固化所述藥膜的溫度為80°C。
[0029]優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：
[0030] 1)將IOmg所述膠束材料和Img姜黃素溶解于裝有IOmL乙醇的容器中；
[0031] 2)于40°C、90r/min的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所述乙醇，至所述容器內(nèi)壁上形藥膜骨架；
[0032] 3)于冰箱中冷藏過夜后去除殘余的乙醇；
[0033] 4)將所述容器置于80°C油浴中使藥膜固化IOmin;
[0034] 5)在攪拌下加入IOmL重蒸水洗膜；
[0035] 6)超聲水化 IOmin;
[0036] 7)0.45μπι微孔濾膜過濾，得到所述姜黃素膠束制劑。
[0037]通過本發(fā)明的膠束材料和膠束制劑，可將姜黃素精確靶向骨腫瘤處，所制備的姜 黃素膠束制劑具有包封率高、粒徑小的優(yōu)點，并且還具有明顯的緩釋作用。
【附圖說明】
[0038]圖1為本發(fā)明的膠束材料的H1-NMR譜圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明的姜黃素膠束制劑的粒徑正態(tài)分布圖；
[0040] 圖3為姜黃素溶液體外釋放曲線圖；
[0041]圖4為本發(fā)明的姜黃素膠束制劑的體外釋放曲線圖。
【具體實施方式】
[0042]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0043] 膠束是由兩親性嵌段共聚物在水中自發(fā)形成的可用于包裹藥物的納米制劑。疏水 作用、靜電作用和氫鍵分子間作用力，使共聚物的疏水端聚集在一起，形成致密的疏水性內(nèi) 核，而親水端則形成親水性外層。聚合物膠束的形狀多為球形，其他的還包括棒狀、囊狀、片 狀、管狀、星狀等。
[0044] 聚合物膠束結(jié)構(gòu)的特異性，決定了它具有以下特點：第一，增溶。膠束內(nèi)核呈疏水 性，難溶性藥物易于包裹在膠束內(nèi)部，從而增加其溶解性。同時膠束的親水性外殼保護膠束 免受調(diào)理素識別和網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的吞噬，延長了體內(nèi)作用時間。第二，提高生物利用度。膠 束體積較小，易通過毛細血管進入體內(nèi)循環(huán)，同時肝排泄、腎排泄量小，從而延長了藥物在 血液里的循環(huán)時間，提高了藥物的生物利用度。第三，靶向性。膠束對腫瘤部位具有被動靶 向性，腫瘤部位的EPR效應(yīng)使毛細血管擴張，膠束極小的粒徑使藥物更容易滲透到腫瘤組織 血管壁，增加藥物到達腫瘤部位的比例，降低了對正常組織的毒副作用。
[0045] 聚合物膠束的制備方法有:薄膜分散法(film dispersion method)、直接溶解法、 透析法、自組裝溶劑蒸發(fā)法等。聚合物在水中的溶解性的溶解性不同，制備方法也不同，水 溶性好的聚合物多采用直接溶解的方法，而水溶性不好或難溶于水的聚合物則采用薄膜分 散法、透析法或溶劑蒸發(fā)法，如果包載的藥物的溶解性也較差，多采用薄膜分散法。
[0046] 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種天然的糖胺聚糖，由兩個雙糖單位D-葡萄 糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成。其分子式為：（C14H21N0n)n，結(jié)構(gòu)式如下：
[0047]
[0048] HA有重要的生物學(xué)功能，高分子量的HA有鎖水的功能，并且能保持細胞的完整性， 當高分子量的HA分解為寡糖小片段后，可以參與受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。HA受體CD44 和HA介導(dǎo)能動性的受體(receptor for hyaluronic acid-mediated motility,RHAMM)在 多種腫瘤細胞表面過度表達，可以與HA發(fā)生特異性結(jié)合，并且HA具有良好的水溶性、生物相 容性和生物可降解性 [5]。利用HA的水溶性和腫瘤細胞靶向性的特點，將其作為藥物載體已 成為抗腫瘤藥物的研究熱點之一。由于HA親水性很強，限制了其載體材料的應(yīng)用，連接上親 酯性基團，可以增加兩親性，從而可以用來制備膠束。
[0049] 為了增加透明質(zhì)酸的骨靶向性和兩親性，發(fā)明人合成了一種新的載體材料一一阿 侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸聚合物。其優(yōu)勢有如下幾點：
[0050] (1)透明質(zhì)酸與硬脂酸以酯鍵連接，形成兩親性共聚物。硬脂酸增加了親酯性部分 使形成的膠束更加穩(wěn)定，同時疏水性藥物與親酯性內(nèi)核相結(jié)，使其溶解性增強。
[0051] (2)透明質(zhì)酸-硬脂酸衍生物與阿侖膦酸進行酰胺化反應(yīng)，成為多功能的以酰胺鍵 連接的共聚物。透明質(zhì)酸具有腫瘤靶向性，阿侖膦酸具有骨靶向性，二者同時應(yīng)用可以起到 治療腫瘤后期骨轉(zhuǎn)移疾病的作用。
[0052] (3)透明質(zhì)酸為水溶性物質(zhì)，其包裹在姜黃素的外部，能夠防止被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞 噬，增加膠束在體內(nèi)的作用時間，保證藥物更完整有目的的到達病理組織發(fā)揮治療作用。 [0053]實施例1阿侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸的合成
[0054] 1)于50mL圓底燒瓶中，加入硬脂酸（0 · 280g，lmmol)、EDC(0 · 230g，1 · 5mmol)、DMAP (0.012g，0.1 mmol)，再加入IOmL DMSO使其完全溶解，油浴80 °C攪拌2h。取透明質(zhì)酸 (0.200g，0.5mmol)于另一50mL圓底燒瓶中，用少量水溶解后加入等量的DMS0,混合均勻。將 上述反應(yīng)液攪拌下逐滴加入該溶液中，45 °C油浴12h:
[0055]
[0056]反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻，裝入透析袋(截留分子量7000)中用大量去離子水透 析48h，然后將樣品液裝在培養(yǎng)皿中預(yù)凍12h后真空冷凍干燥，得白色絮狀物，備用；
[0057] 2)取凍干粉末于IOmL圓底燒瓶中，加適量的水完全溶解，逐滴加入lmol/L的鹽酸， 混合均勻后測定PH，直至PH2-3;
[0058] 3)將酸化后的溶液轉(zhuǎn)移至25mL的圓底燒瓶中，加入EDC(0.120g，0.75mmol)、NHS (0.010g，0.05mmol)，60°C攪拌lh。取阿侖膦酸（0.150g，0.6mmol)于50mL圓底燒瓶中，用適 量水溶魅后琢謫加入H術(shù)溶液中，45Γ沛洛I 2h ,得剞阿侖醅-誘明質(zhì)醅-硬脂醅，
[0059]
[0000]反應(yīng)完成后，待反應(yīng)液冷卻，裝入透析袋(截留分子量7000)中用大量去離子水透 析48h，然后將樣品液裝在培養(yǎng)皿中預(yù)凍12h后真空冷凍干燥，得到的白色產(chǎn)物即為純化的 阿侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸，稱重70.23mg。通過合成分析，其H 1-匪R譜圖如圖1所示，通過 與透明質(zhì)酸的H1-NMR譜圖對比，顯示透明質(zhì)酸已和硬脂酸和阿侖膦酸進行了反應(yīng)生成了阿 侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸聚合物。
[0061] 實施例2姜黃素膠束制劑的制備
[0062] 本發(fā)明采用薄膜分散法來制備姜黃素膠束制劑：
[0063]取5mg阿侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸載體材料和Img姜黃素于IOmL梨形瓶中，加入 5mL無水乙醇，超聲使完全溶解。40°C，90r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇，至瓶壁形成黃色的 藥膜骨架，冰箱中冷藏過夜，除去殘留的無水乙醇。將梨形瓶置于80°C油浴中使藥膜固化 IOmin，攪拌下加入10mL45°C的重蒸水洗膜，超聲水化IOmin，0.45μηι的微孔濾膜過濾，得黃 色的姜黃素膠束溶液。
[0064]制備條件的優(yōu)化 [0065] 1.載體材料與藥物的比例
[0066]精密稱取3份Img姜黃素于3個IOmL的梨形瓶中，分別按5:1、10:1、15:1的材料與藥 物比加入阿侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸，分別加入5mL無水乙醇，將其溶解后在40°C，90r/min 的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，至瓶壁形成黃色的藥膜骨架，冰箱中冷藏過夜，除去殘留 的無水乙醇。將梨形瓶置于80°C油浴中使藥膜固化IOmin，攪拌下加入IOmL 45°C的重蒸水 洗膜，超聲水化IOmin，0.45μπι的微孔濾膜過濾，得黃色的姜黃素膠束溶液。按照"包封率和 載藥量的測定方法"，分別測定包封率，Nicomp粒度儀測定粒徑。結(jié)果如表1所示：
[0067]表1不同的材料與藥物比對包封率的影響
[0069]根據(jù)測定結(jié)果可知，提高載體材料的比例可以最大可能的將藥物包裹在膠束中， 提高包封率，但材料多到一定程度時，膠束中包裹的藥物量反而減少，故10:1的材料與藥物 比是最適宜的。
[0070] 2有機溶劑的選擇
[0071] 精密稱取3份IOmg阿侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸載體材料和Img姜黃素于3個IOmL的 梨形瓶中，分別加入5mL乙醇、丙酮、氯仿，將其溶解后在40°C，90r/min的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去有機溶劑，至瓶壁形成黃色的藥膜骨架，冰箱中冷藏過夜，除去殘留的無水乙醇。將梨形 瓶置于80°C油浴中使藥膜固化IOmin，攪拌下加入IOmL 45°C的重蒸水洗膜，超聲水化 10min，0.45μπι的微孔濾膜過濾，得黃色的姜黃素膠束溶液。按照"包封率和載藥量的測定方 法"，分別測定包封率和載藥量，Nicomp粒度儀測定粒徑。結(jié)果如表2所示：
[0072] 表2不同成膜溶劑對膠束包封率的影響
[0074]根據(jù)測定結(jié)果，乙醇的成膜效果較好。實驗過程中，丙酮減壓旋蒸成膜時鼓泡，會 造成成膜不均、倒吸等問題，不易形成光滑透明貼壁的膜。同時氯仿對材料的溶解性相對較 差，成膜時存在細小的顆粒狀物質(zhì)。
[0075] 3固化溫度的選擇
[0076]精密稱取3份IOmg阿侖膦酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸載體材料和Img姜黃素于3個IOmL的 梨形瓶中，分別加入5mL無水乙醇，將其溶解后在40°C，90r/min的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機 溶劑，至瓶壁形成黃色的藥膜骨架，冰箱中冷藏過夜，除去殘留的無水乙醇。將3個梨形瓶分 別置于40°C、60°C、80°C油浴中使藥膜固化IOmin，攪拌下加入IOmL 45°C的重蒸水洗膜，超 聲水化IOmin，0.45μπι的微孔濾膜過濾，得黃色的姜黃素膠束溶液。按照"包封率和載藥量的 測定方法"，分別測定包封率和載藥量，Ni comp粒度儀測定粒徑和電位。結(jié)果如表3所示：
[0077] 表3不同的固化溫度對膠束包封率的影響
[0079]根據(jù)測定結(jié)果，80°C固化效果最好。
[0080] 4.正交實驗
[0081]通過單因素考察實驗，對姜黃素膠束制備工藝影響較大的因素有:載體材料和藥 物的比例(A)、有機溶劑的種類(B)、固化的溫度(C)，每個因素選擇三個水平進行三因素三 水平正交設(shè)計實驗，以此來優(yōu)化制備工藝并確定最優(yōu)實驗處方。因素水平見表4,正交設(shè)計 表及結(jié)果見表5。
[0082]表4姜黃素膠束正交設(shè)計實驗因素與水平

[0087] 根據(jù)表中極差(R和R'）可知，各因素對粒徑和包封率的影響順序依次為C>B>A，優(yōu) 化后得出的最佳處方為A 2B1C3，即載體材料和藥物比為10:1，成膜的有機試劑為乙醇，膜的 固化溫度為80 °C。
[0088] 膠束制劑的性能評估
[0089] 1.膠束粒徑的測量結(jié)果
[0090]根據(jù)最優(yōu)條件制備在姜黃素膠束，測量其粒徑，結(jié)果如圖2所示。由圖可以看出載 姜黃素膠束的粒徑近似為正態(tài)分布，并且分布范圍窄，粒徑分布在IOOnm附近，粒徑差異較 小。
[0091] 2.姜黃素在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，所以選擇PH5.7的PBS緩沖液為體外釋放介 質(zhì)，采用透析法進行膠束的體外釋放實驗。精密稱取姜黃素2mg，溶于2mL混合液[15%N，N-二甲基甲酰胺，45%聚乙二醇-400和40%濃度為5%的葡萄糖溶液(天平稱取2.5g葡萄糖， 放于200mL的燒杯中，用量筒量取45mL的蒸餾水倒入燒杯中，用玻璃棒攪拌至葡萄糖完全溶 解，既得50g的5%葡萄糖溶液。）]中，作為對照試劑，裝入透析袋中。將透析袋置于50mL的離 心管中，加入40mL PBS溶液后放進37°C，lOOr/min的恒溫水浴震蕩器中進行震蕩模擬體內(nèi) 環(huán)境，分別在〇. Ih、0.5h、Ih、2h、4h、6h、8h時間點取2mL溶液于EP管中，再加入等體積的I3BS， 然后分別進液相，膠束溶液的體外釋放曲線如圖3所示。
[0092]量取2mL制備好的載藥膠束于透析袋中，將透析袋置于50mL的離心管中，加入40mL PBS溶液后放進37°C，lOOr/min的恒溫水浴震蕩器中進行震蕩模擬體內(nèi)環(huán)境，分別在0.5h、 Ih、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h時間點取2mL溶液于EP管中，再加入等體積的I3BS，然后 分別進液相。測量2mL膠束在PH5.7的介質(zhì)中破乳后的含藥總量，通過計算，得出載藥膠束體 外釋放曲如圖4所示。
[0093] 通過體外釋放曲線可以看出，姜黃素對照溶液釋放較快，在6h時累計釋放率就達 到了90%左右；與之相比載姜黃素膠束呈現(xiàn)出明顯的緩釋作用，6h時其累計釋放率僅有 30%左右，48小時累計釋放95.88%，且釋放曲線變平緩。
[0094] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種骨祀向膠束材料，其特征在于，由阿侖麟酸、透明質(zhì)酸和硬脂酸共價連接而成， 其結(jié)構(gòu)式如下：2. -種如權(quán)利要求1所述的膠束材料的制備方法，其特征在于，包括W下步驟： 1) 使硬脂酸與透明質(zhì)酸在邸C和DMAP的催化下發(fā)生醋化反應(yīng)，生成透明質(zhì)酸-硬脂酸：2) 將步驟1)得到的透明質(zhì)酸-硬脂酸溶解于水中，用鹽酸酸化至pH 2-3; 3) 向步驟2)得到的溶液中加入EDC、NHS和阿侖麟酸溶液，使透明質(zhì)酸-硬脂酸在EDC和 N服的催化下與阿侖麟酸發(fā)生酷胺化反應(yīng)，得到阿侖麟酸-透明質(zhì)酸-硬脂酸：3. -種骨祀向姜黃素膠束制劑，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的膠束材料包裹姜黃素 而成。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的姜黃素膠束制劑，其特征在于，所述姜黃素膠束制劑中的膠束 呈球形。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的姜黃素膠束制劑，其特征在于，所述膠束的粒徑為98nm至 150nm。6. -種如權(quán)利要求3-5中任一項所述的姜黃素膠束制劑的制備方法，使用薄膜分散法 來制備，其特征在于，包括W下步驟： 1) 將權(quán)利要求1所述的膠束材料和姜黃素溶解于裝有溶劑的容器中； 2) 蒸發(fā)所述溶劑，至所述容器內(nèi)壁上形成藥膜骨架； 3) 10°CW下冷藏后去除殘余的溶劑； 4) 將所述容器置于油浴中使藥膜固化； 5) 加入水洗膜； 6) 超聲水化； 7) 微孔濾膜過濾，得到所述姜黃素膠束制劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述膠束材料與所述姜黃素的重量比 10:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述溶劑為乙醇。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中固化所述藥膜的溫度為80 Γ。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括W下步驟： 1) 將lOmg所述膠束材料和Img姜黃素溶解于裝有l(wèi)OmL乙醇的容器中； 2) 于40°C、9化/min的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所述乙醇，至所述容器內(nèi)壁上形成藥膜骨架； 3) 于冰箱中冷藏過夜后去除殘余的乙醇； 4) 將所述容器置于80°C油浴中使藥膜固化lOmin; 5) 在攬拌下加入lOmL重蒸水洗膜； 6) 超聲水化lOmin; 7 )0.45μπι微孔濾膜過濾，得到所述姜黃素膠束制劑。
【文檔編號】A61K31/12GK106074378SQ201610529490
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】陳大全, 董雪, 宋曉燕, 亓夢嬌
【申請人】煙臺大學(xué)