羧甲司坦的藥物組合物及其對(duì)白血病的治療作用
【專利摘要】本發(fā)明公開了羧甲司坦的藥物組合物及其對(duì)白血病的治療作用，本發(fā)明提供的羧甲司坦的藥物組合物中含有羧甲司坦和一種從石韋的干燥葉中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，羧甲司坦和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)白血病具有一定的治療作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)白血病的治療效果更為顯著，可以開發(fā)成治療白血病的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
羧甲司坦的藥物組合物及其對(duì)白血病的治療作用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及羧甲司坦的新用途，具體涉及一種羧甲司坦的藥 物組合物及其對(duì)白血病的治療作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羧甲司坦為S -（羧甲基)半胱氨酸，由半胱氨酸和氯乙酸在一定條件下反應(yīng)制得。 羧甲司坦是一種化痰止咳藥，主要是在細(xì)胞水平影響支氣管腺體的分泌，使低粘度唾液蛋 白分泌增加，高粘度巖藻粘蛋白產(chǎn)生減少，使痰液稠度降低而易于咳出，臨床用于慢性支氣 管炎、支氣管哮喘等疾病引起的痰液粘稠、咯痰困難和痰阻氣管等癥。
[0003] 迄今為止，尚未見羧甲司坦及其藥物組合物與白血病的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種羧甲司坦的藥物組合物，該藥物組合物中含有羧甲司 坦和一種從石韋葉中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，羧甲司坦和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同發(fā) 揮治療白血病的作用，開發(fā)成治療白血病的藥物。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物a)，
[0007]
[0008] -種羧甲司坦的藥物組合物，包括羧甲司坦、如上所述的化合物（I)和藥學(xué)上可以 接受的載體。
[0009] 如上所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將石韋的干燥葉粉碎， 用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫10個(gè)柱體 積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物 用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4 個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和2:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠 分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液 減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(a)中用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
[0012] 如上所述的化合物(I)在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 如上所述的羧甲司坦的藥物組合物在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 本發(fā)明提供的羧甲司坦的藥物組合物中含有羧甲司坦和一種從石韋葉中分離得 到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，羧甲司坦和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)白血病具有一定的治療 作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)白血病的治療效果更為顯著，可以開發(fā)成治療白血病的藥物。本 發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0017] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0018]分離方法：（a)將石韋的干燥葉（2kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(20L X 3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水飽和的正 丁醇（4LX 3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中正丁醇萃取物用DlOl型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇 洗脫10個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙 醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1 (8個(gè)柱體積）、30:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體積)和5:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組 分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積）、15:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5 個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I)(280mg，HPLC歸一化純度大于98% )。
[0019] 結(jié)構(gòu)確證:淡黃色固體，HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 561.3895,結(jié)合核磁特征可 得分子式為C37H52〇4，不飽和度為12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ( ΡΡπι，CDCl3，500MHz): H-Ia(2.45， d，J=13.1Hz)，H-lb(2.34，d，J=13.1Hz)，H-4(2.28，q，J = 6.6Hz)，H-6a(1.41，m)，H-6b (1.92，dt，J=13.1，3.0Hz)，H-7a(1.57，m)，H-7b(1.66，m)，H-8(1.59，m)，H-10(1.75，m)，H-lla(1.31，td，J=13.8,3.3Hz)，H-llb(2.06，d，J=13.8Hz)，H-12a(1.39，m)，H-12b(1.52， m)，H-15a(1.38，m)，H-15b(1.64，m)，H-16a(1.41，m)，H-16b(1.71，m)，H-18(1.83，m)，H-19a (1.63，m)，H-19b(1.86，m)，H-21a(1.18，m)，H-21b(1.39，m)，H-22a(1.28，m)，H-22b(1.56， m)，H-23(0.92，d，J = 6.8Hz)，H-24(0.83，s)，H-25a(4.51，d，J=12.4Hz)，H-25b(4.95，d，J =12.4Hz)，H-26(1.07，s)，H-27(1.17，s)，H-28(1.14，s)，H-29(1.09，s)，H-30(1.16，s)，H- 3'，7'（7.98，br，d，J = 7.6Hz)，H-4'，6'（7.46，t，J = 7.6Hz)，H-5'（7.57，t，J = 7.6Hz)JS· 共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm CDCl3，125MHz): 36 · 2(CH2，1-C)，198 · 6(C，2-C)，187 · 5(C，3-C)，50 · 4 (CH，4-C)，42.3(C，5-C)，41.4(CH2,6-C)，18.3(CH2,7-C)，53.4(CH，8-C)，41.9(C，9-C)，60.8 (CH，10-C)，30.4(CH2，11-C)，31.7(CH2，12-C)，39.7(C，13-C)，37.6(C，14-C)，33.2(CH2，15-C)，35.2(CH2，16-C)，33.4(C，17-C)，41.9(CH，18-C)，37.0(CH2，19-C)，30.1(C，20-C)，34.7 (CH2,21-C)，36.4(CH2,22-C)，7.3(CH3,23-C)，14.6(CH3,24-C)，62.7(CH2,25-C)，20.8(CH 3， 26-C)，18.1(CH3,27-C)，33.5(CH3,28-C)，28.8(CH3,29-C)，25.3(CH 3,30-C)，166.7(C，r-C)，130.4(C，2'-C)，129.3(CH，3'，7'-C)，128.5(CH，4'，6'-〇，133.6(01，5'-〇。紅外波譜 中的1735CHT 1吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在羰基，而1448CHT1與1523CHT1吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在苯 環(huán)結(jié)構(gòu)。 13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有37個(gè)碳信號(hào)，包括七個(gè)甲基，^^一個(gè)亞甲基(一個(gè)連 氧碳），四個(gè)次甲基，九個(gè)季碳(三個(gè)羰基碳）以及一組單取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)，以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié) 合不飽和數(shù)表明該化合物為六環(huán)結(jié)構(gòu)。 1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示一組單取代苯環(huán)質(zhì)子信號(hào) δΗ 7.98(2!1，1^，(1，了 = 7.6抱）、7.46(2!1，^ = 7.6抱）、7.57(1!1，扒了 = 7.6泡），七個(gè)甲基質(zhì) 子信號(hào)δΗ 0.92(3H，d，J = 6.8Hz)、0.83(3H，s)、1.07(3H，s)、1.17(3H，s)、1.14(3H，s)、1.09 (3H，s)、1.16(3H，s)，十一組亞甲基質(zhì)子信號(hào)δ Η 2.45(lH，d，J=13.1Hz)與2.34(lH，d，J = 13.1泡）、1.41(1!1，111)與1.92(1!1，(1^=13.1，3.0!^)、1.57(1!1，111)與1.66(1!1，111)、1.31(1!1， td，J=13.8,3.3Hz)與 2.06(lH，td，J=13.8,3.3Hz)、1.39(lH，m)與1.52(lH，m)、1.38(lH， m)與1.64(1!1，111)、1.41(1!1，111)與1.71(1!1，111)、1.63(1!1，111)與1.86(1!1，111)、1.18(1!1，111)與1.39 (1!1，111)、1.28(1!1，111)與1.56(1!1，111)、5.51(1!1，(1，了 = 12.4!^)與4.95(1!1，(1，了=12.4抱），四個(gè) 次甲基質(zhì)子信號(hào)δΗ 2.28(lH，q，J = 6.6Hz)、1.59(lH，m)、1.75(lH，m)、1.83(lH，m);由以上 NMR數(shù)據(jù)可知該化合物為木栓烷型三萜類，并且結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)酮基以及一個(gè)羥甲基片段。 根據(jù)HMBC譜中顯示的H-3 '，7 '與C-Γ相關(guān)信號(hào)以及C-Γ、C-2 '、C-3 '、C-4 '、C-5 '、C-6 '和C-7'的碳化學(xué)位移和1H-NMR數(shù)據(jù)可知該化合物含有苯甲?；Y(jié)構(gòu)單元。通過分析HMBC譜中H2-25與C-Γ相關(guān)信號(hào)以及C-25的化學(xué)位移可知苯甲酸是通過與C-25的羥甲基成酯形成苯甲 酰基結(jié)構(gòu)單元。此外，HMBC譜中，H 2-I與C-2以及H3-23與C-3相關(guān)信號(hào)以及它們的碳化學(xué)位移 數(shù)據(jù)可以確定C-2和C-3為酮基碳。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類 型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與 實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和碳原子編號(hào)如下：
[0020]
[0021] 實(shí)施例2:治療白血病作用
[0022] 一、材料和儀器
[0023] K562細(xì)胞由中科院上海生物細(xì)胞所提供?；衔铮↖)為按實(shí)施例1方法自制，HPLC 歸一化純度大于98% APMI-1640干粉培養(yǎng)基購于Gibco公司。小牛血清購于杭州四季青生 物工程材料研究所。青霉素、鏈霉素購于華北制藥廠。Glutamine、MTT、DMSO購于AMRESC0。 Annexinv-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。M0PS，Rnasin、 瓊脂糖、嗅乙錠、溴酚蘭華美生物工程公司華美生物工程公司。
[0024] CO2孵箱（美國(guó)Thermo公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），磁力攪拌器(上海南 匯電訊器材廠），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），水平式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠），電 子分析天平(德國(guó)Sartorius公司），自動(dòng)酶標(biāo)儀(德國(guó)Humareader公司），U-3010型紫外分光 光度計(jì)（日本HITACHI公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMAN公司），Eppendorf Centrifuge 5417R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司）。
[0025]二、試驗(yàn)方法 [0026] 1、K562細(xì)胞的培養(yǎng)
[0027]將新購買的細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶表面用75%酒精擦拭3遍。將細(xì)胞懸液吸入離心管， 1000 rpm離心10min。棄去上清，滴加含10%NBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，輕輕吹打制備成細(xì) 胞懸液。接種于培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液傳代。
[0028] 2、實(shí)驗(yàn)分組
[0029]正常對(duì)照組：10%NBS 的 RPMI-1640;
[0030] 羧甲司坦組：10 % NBS的RPMI-1640+終濃度80mg/L的羧甲司坦；
[0031]化合物（I)組：10%NBS的RPMI-1640+終濃度80mg/L化合物（I);
[0032] 羧甲司坦與化合物（I)組合物組：10%NBS的RPMI-1640+終濃度40mg/L的羧甲司坦 +終濃度40mg/L化合物（I)。
[0033] 3、11'1'法檢測(cè)對(duì)1(562細(xì)胞增殖的影響
[0034] 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用含10%NBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配制成細(xì)胞懸 液，以5 X IO3細(xì)胞/孔接種于無菌96孔培養(yǎng)板中。（2)依實(shí)驗(yàn)分組，每組加入不同濃度的藥物 50yL，設(shè)無細(xì)胞孔為空白對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，將96孔培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（3) 24、48和72h后取出96孔培養(yǎng)板，每孔加入20yL MTT(5mg/mL)，放入⑶2培養(yǎng)箱孵育4h，即有 紫藍(lán)色結(jié)晶物生成，結(jié)晶物的生成量與細(xì)胞數(shù)成正比。（4)每孔加入酸化的SDS IOOyL放入 CO2培養(yǎng)箱過夜。（5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD，比色時(shí)以空白孔調(diào)零。
[0035] 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0036] 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均重復(fù)三次操作，結(jié)果用（x±s表示，P〈0.05示有顯著性差異。組 間比較采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0037]三、結(jié)果及結(jié)論
[0038] MTT法檢測(cè)對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用
[0039] 藥物作用K562細(xì)胞24h、48h、72h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D49Q顯示：與正常對(duì)照組比，作 用24h后羧甲司坦組和化合物（I)組對(duì)細(xì)胞K562細(xì)胞抑制作用不明顯(P>0.05，P>0.05)，羧 甲司坦與化合物（I)組合物組對(duì)K562細(xì)胞有抑制作用(P〈0.05);與正常對(duì)照組比，作用48h 和72h后，羧甲司坦組和化合物（I)組對(duì)細(xì)胞K562細(xì)胞有抑制作用(P〈0.05，P〈0.05)，羧甲司 坦與化合物（I)組合物組可顯著抑制K562細(xì)胞(P〈0.01)。
[0040] 表1各組作用K562細(xì)胞后的MTT值(X土s，n = 8)
[0042] 結(jié)論:羧甲司坦與化合物（I)組合物可顯著抑制K562細(xì)胞的增殖，抑制作用強(qiáng)于羧 甲司坦或化合物（I)單獨(dú)作用于K562細(xì)胞。羧甲司坦與化合物（I)之間存在協(xié)同作用，可以 開發(fā)成治療白血病的藥物。
[0043] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種簇甲司坦的藥物組合物，其特征在于:包括簇甲司坦、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可W接受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將石 韋的干燥葉粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、 乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取 物；（b)步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70% 乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中 70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:l、30:l、15:l和5:l的二氯甲燒- 甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為 25:1、15:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基 硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱 體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用75%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的簇甲司坦的藥物組合物在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/56GK106074561SQ201610412276
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日 公開號(hào)201610412276.X, CN 106074561 A, CN 106074561A, CN 201610412276, CN-A-106074561, CN106074561 A, CN106074561A, CN201610412276, CN201610412276.X
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】崔坤峰