一種組織工程血管化支架及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一種組織工程血管化支架及其構(gòu)建方法。該方法包括以下步驟：(1)將脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理以洗去脫細(xì)胞過(guò)程以及保存過(guò)程中可能引入的雜質(zhì)；(2)使用組織工程支架成型方法，制備脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架；(3)將步驟(2)制備的脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架進(jìn)行后期處理，除去制備處理過(guò)程中的殘留物質(zhì)，獲得組織工程血管化支架。該方法基于生物體血管化過(guò)程的基本原理，契合內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖特點(diǎn)，最大程度地模擬生物體血管化生成的微環(huán)境，構(gòu)建脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架，協(xié)同發(fā)揮脫細(xì)胞基質(zhì)材料和合成材料的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)造出可以滿足組織工程血管化要求的支架產(chǎn)品。
【專利說(shuō)明】
一種組織工程血管化支架及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程血管化支架及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在生物體內(nèi)，幾乎所有的組織都是通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)精細(xì)分支網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)、氧氣以及代謝產(chǎn)物的交換。組織工程支架植入生物體后，粘附在支架材料內(nèi)部的細(xì)胞失去營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)將大量死亡，導(dǎo)致種子細(xì)胞的存活率，影響組織工程產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。組織工程血管化，就是針對(duì)組織工程產(chǎn)品植入后無(wú)營(yíng)養(yǎng)代謝的局限性，進(jìn)行植入前的程序性血管構(gòu)建，以期解決植入后組織工程產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)代謝的問(wèn)題。
[0003]組織工程血管化作為組織工程研究的熱點(diǎn)，目前主要從支架材料結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子、構(gòu)建方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。其中支架材料作為細(xì)胞吸附和增殖的載體，起到細(xì)胞外基質(zhì)的作用，在組織工程血管化中具有重要的意義。
[0004]目前用于組織工程血管化的支架材料主體為可降解的高分子材料，其設(shè)計(jì)原則就是基于仿生原理，最大限度地在體外模擬目標(biāo)組織或器官的細(xì)胞外基質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)和功能，增進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)。最初所用的材料主要包括聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、乳酸與乙交酯共聚物(PLGA)、聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基丁酸酯(PHB)和聚氨基酸等。優(yōu)點(diǎn)是可以根據(jù)具體的組織和器官特點(diǎn)設(shè)計(jì)適宜結(jié)構(gòu)的支架，并通過(guò)對(duì)孔徑、孔隙率和連通率等因素的控制，增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。但生物識(shí)別點(diǎn)匱乏，降解速率和降解產(chǎn)物的毒性也限制了其應(yīng)用。為彌補(bǔ)其的不足，研究者通過(guò)材料進(jìn)行改性，并引入膠原、明膠、蠶絲蛋白、糖蛋白、糖胺聚糖等，增加支架材料的細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，提高支架的生物活性，促進(jìn)細(xì)胞吸附的能力。
[0005]近年來(lái)隨著脫細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，脫細(xì)胞基質(zhì)材料也被研究用于組織工程血管化。脫細(xì)胞基質(zhì)材料的優(yōu)點(diǎn)是具有良好的生物識(shí)別性和生物相容性，但機(jī)械強(qiáng)度、來(lái)源批次間的差異性、結(jié)構(gòu)相容性等限制了其發(fā)展和應(yīng)用，且單位時(shí)間內(nèi)可長(zhǎng)入的細(xì)胞量較少。
[0006]總之，目前的復(fù)合材料支架依然未能很好地實(shí)現(xiàn)組織的血管生成。主要原因:1.血管生成時(shí)間較長(zhǎng)，高分子支架材料的降解需要時(shí)間，所具有的空間僅能滿足內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和迀移，后期支架材料本身將阻礙細(xì)胞的迀移，而脫細(xì)胞基質(zhì)具有致密結(jié)構(gòu)，單位時(shí)間內(nèi)長(zhǎng)入的細(xì)胞數(shù)量較少;2.現(xiàn)有的支架材料僅能實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞的單向長(zhǎng)入，新生血管雜亂無(wú)章，血流混亂，限制新鮮血液流入新生組織。
[0007]總之，現(xiàn)有的組織工程血管化支架材料尚不能最大限度的模擬生物體血管生成所需要微環(huán)境，得到成熟的血管網(wǎng)絡(luò)。因此，構(gòu)建一種更貼近細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料用于組織工程的血管化具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種組織工程血管化支架的構(gòu)建方法。該方法基于生物體血管化過(guò)程的基本原理，契合內(nèi)皮細(xì)胞迀移、增殖特點(diǎn)，最大程度地模擬生物體血管化生成的微環(huán)境，構(gòu)建脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架，協(xié)同發(fā)揮脫細(xì)胞基質(zhì)材料和合成材料的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)造出可以滿足組織工程血管化要求的支架產(chǎn)品。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法構(gòu)建的組織工程血管化支架。
[0010]本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn):
[0011]—種組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其主要包括以下步驟:
[0012](I)將脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理以洗去脫細(xì)胞過(guò)程以及保存過(guò)程中可能引入的雜質(zhì)；
[0013](2)使用組織工程支架成型方法，制備脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架；
[0014](3)將步驟(2)制備的脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架進(jìn)行后期處理，除去制備處理過(guò)程中的殘留物質(zhì)，獲得組織工程血管化支架。
[0015]步驟(I)中所述的脫細(xì)胞基質(zhì)可為未改性的或改性的脫細(xì)胞心包膜、脫細(xì)胞軟骨、脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞羊膜、脫細(xì)胞膀胱、脫細(xì)胞小腸粘膜下基質(zhì)、脫細(xì)胞腎臟、脫細(xì)胞血管中的至少一種。
[0016]步驟(I)中的改性是指引入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、音猬因子(SHH)、鍶離子(Sr2+)、銅離子(Cu2+)中的一種或一種以上。
[0017]優(yōu)選的，當(dāng)進(jìn)行改性時(shí)，可采用以下步驟:
[0018](I)將脫細(xì)胞基質(zhì)浸入MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物)緩沖液(pH = 5.60)預(yù)置0.5h；
[0019](2)將EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)溶于含有2%(W/V)Hep(肝素鈉鹽)的0.05mol/LMES緩沖液中作用lOmin，其中EDC:NHS:Hep摩爾比為 7.5:12.5:1;
[0020](3)將步驟(I)中預(yù)置好的基質(zhì)放入步驟(2)中的溶液，震蕩并室溫反應(yīng)24h，然后將基質(zhì)進(jìn)行清洗、冷凍干燥即得肝素化的脫細(xì)胞基質(zhì)；
[0021](4)將肝素化的脫細(xì)胞基質(zhì)浸泡在含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、音猬因子(SHH)、鍶離子(Sr2+)、銅離子(Cu2+)中的一種或一種以上的PBS溶液中，4°C孵育過(guò)夜，即得改性的脫細(xì)胞基質(zhì)。
[0022]更優(yōu)選的，當(dāng)用鍶離子進(jìn)行改性時(shí)，也可將脫細(xì)胞基質(zhì)直接浸入氯化鍶的PBS溶液中，4°C孵育過(guò)夜，得鍶離子改性的脫細(xì)胞基質(zhì)。
[0023]步驟(I)中所述的預(yù)處理包括如下的步驟A，或步驟A和步驟B，或步驟A?C:
[0024]A、使用生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或超純水浸泡脫細(xì)胞基質(zhì)；
[0025]B、對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行適度裁剪，得到面積為0.0lmm2?4cm2，厚度為0.0lmm?Icm的脫細(xì)胞基質(zhì)塊，并用去離子水清洗浸泡后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)；
[0026]C、風(fēng)干或冷凍干燥后，在干燥器中保存?zhèn)溆谩?br>[0027]步驟(2)中所述的合成材料為可降解合成材料，可為醫(yī)用級(jí)聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸酯(PLGA)、聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基丁酸酯(PHB)和聚氨基酸中的至少一種。
[0028]步驟(2)中所述的成型方法包括冷凍干燥法、靜電紡絲法、3D打印法等。
[0029]步驟(2)中所用的脫細(xì)胞基質(zhì)與合成材料的質(zhì)量比為1:1000?3:1。
[0030]步驟(2)中所述的組織工程支架成型方法中，所用的合成材料以溶液形式存在，溶液濃度為0.0lwt %?30wt %，溶劑可為二甲基亞砜、I，4二氧六環(huán)、二氯甲燒中的至少一種。
[0031]步驟(3)中所述的后處理是指用去離子水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液沖洗步驟
(2)制備的組織工程血管化支架，再用截留分子量為100?200000Da的透析裝置進(jìn)行透析，透析液為生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或超純水，最后經(jīng)過(guò)滅菌即可。
[0032]一種由上述方法構(gòu)建得到的組織工程血管化支架。
[0033]本發(fā)明的機(jī)理為:
[0034]生物體內(nèi)血管的生長(zhǎng)作為機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷愈合和組織再生的重要環(huán)節(jié)，主要有三種形式:血管發(fā)生、血管形成、動(dòng)脈生長(zhǎng)。血管發(fā)生，胚胎發(fā)育時(shí)多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，增殖聚集成內(nèi)皮細(xì)胞管，周皮細(xì)胞環(huán)繞分化，分化為平滑肌細(xì)胞，加固初級(jí)血管網(wǎng)，并賦予其一定的功能，最終形成成熟的血管。血管形成，已生成的血管在周邊因素的刺激下，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶降解周邊的細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖再次形成管腔，重現(xiàn)血管發(fā)生的過(guò)程。動(dòng)脈生長(zhǎng)，毛細(xì)血管網(wǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟮膫鬏斝詣?dòng)脈的過(guò)程，在動(dòng)脈發(fā)生閉塞時(shí)也有此模式。
[0035]在組織工程產(chǎn)品構(gòu)建過(guò)程中，本發(fā)明構(gòu)建的組織工程血管化支架的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)刺激內(nèi)皮細(xì)胞和種子細(xì)胞迀入支架內(nèi)部;支架的多孔結(jié)構(gòu)和生物位點(diǎn)為細(xì)胞的大量增殖提供3維環(huán)境，形成“內(nèi)皮細(xì)胞庫(kù)”，為血管化提供大量的內(nèi)皮細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)分泌金屬基質(zhì)蛋白酶長(zhǎng)入脫細(xì)胞基質(zhì)，無(wú)需等待合成材料的降解，減少血管化形成的時(shí)間;脫細(xì)胞基質(zhì)的多層立體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，使得內(nèi)皮細(xì)胞可以“多向”長(zhǎng)入脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)部。
[0036]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0037]1、縮短血管化的時(shí)間。支架的多孔性和生物位點(diǎn)為內(nèi)皮細(xì)胞提供大量增殖的3維微環(huán)境，且內(nèi)皮細(xì)胞在此過(guò)程中可以直接長(zhǎng)入脫細(xì)胞基質(zhì)材料內(nèi)部，縮短血管化時(shí)間，這是單獨(dú)使用合成材料或脫細(xì)胞基質(zhì)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。
[0038]2、實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的“多向”生長(zhǎng)。支架提供的3維微環(huán)境以及內(nèi)皮細(xì)胞可以長(zhǎng)入脫細(xì)胞基質(zhì)材料，可以實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的“多向”生長(zhǎng)，這也是單獨(dú)使用合成材料或脫細(xì)胞基質(zhì)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。
[0039]3、通過(guò)對(duì)脫細(xì)胞材料的分布設(shè)計(jì)，可以在I和2的優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，得到近似生理的網(wǎng)狀血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)，有利于新鮮血液流入新生組織。
[0040]4、與膠原等天然物質(zhì)構(gòu)成的支架相比，脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)具有多種類型的膠原，且膠原比例與細(xì)胞外基質(zhì)相同，同時(shí)還保留脫細(xì)胞基質(zhì)中的糖胺聚糖等成分，更加近似生理環(huán)境，具有更好的生物相容性;具有多種血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子連接位點(diǎn)，有利于負(fù)載生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入脫細(xì)胞基質(zhì)。
[0041]5、單獨(dú)使用膠原、明膠等天然分子與合成材料復(fù)合構(gòu)成的支架，僅能發(fā)揮其細(xì)胞識(shí)別功能。本發(fā)明構(gòu)建的復(fù)合支架中包含均勻分布的脫細(xì)胞基質(zhì)，不僅使支架具備細(xì)胞識(shí)別功能，而且內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過(guò)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶長(zhǎng)入脫細(xì)胞基質(zhì)，增殖，逐步完成后期的組織血管化。
[0042]6、相比于單獨(dú)使用脫細(xì)胞基質(zhì)，復(fù)合支架的連通多孔結(jié)構(gòu)可以為細(xì)胞生長(zhǎng)增殖提供了必需的空間。體外構(gòu)建時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞等種子細(xì)胞可以在支架材料內(nèi)大量擴(kuò)增，為支架材料血管化提供細(xì)胞支持。
【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1為實(shí)施例1和3中使用冷凍干燥法制備組織工程血管化支架的模型圖；
[0044]圖2為實(shí)施例1中的組織工程血管化支架掃描電鏡圖；
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0046]實(shí)施例中如沒(méi)有特殊說(shuō)明，所用試劑均可從市場(chǎng)常規(guī)購(gòu)得。
[0047]實(shí)施例1
[0048]本實(shí)施例的組織工程血管化支架由以下方法制備得到:
[0049](I)接枝VEGF的豬脫細(xì)胞心包膜的制備
[0050]參考專利CN101274106 B(—種制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法)制備豬脫細(xì)胞心包膜，具體步驟如下:將豬心包膜組織預(yù)處理，然后將預(yù)處理后的豬心包膜組織加入到含有磷脂酶的溶液中，通過(guò)低滲或等滲透浸泡制備豬脫細(xì)胞心包膜，然后洗滌即得豬脫細(xì)胞心包膜。其中，磷脂酶的濃度小于10000U/mL，溶液的溫度范圍為O?56°C，pH值范圍為5?12。
[0051 ] 將Ig干重脫細(xì)胞心包膜浸入5mL0.05mol/L MES(2_(N_嗎啉)乙磺酸一水合物)緩沖液(pH=5.60)預(yù)置0.5h;將EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)溶于188.3mL含有2%(W/V)Hep(肝素鈉鹽)的0.05mol/LMES緩沖液中作用lOmin，EDC: NHS: Hep摩爾比= 7.5:12.5:1，然后將預(yù)置好的基質(zhì)放入此溶液，輕微震蕩，室溫反應(yīng)24h。然后基質(zhì)在0.lmol/L Na2HPO4溶液中清洗2h，4mol/LNaCl溶液中清洗24h(每6h更換一次NaCl溶液)，蒸餾水清洗24h(每6h更換一次蒸餾水)，冷凍干燥后4°C保存待用即得肝素化的脫細(xì)胞基質(zhì)；
[0052]配置濃度為1000ng/mL的VEGF的roS(pH = 7.2)溶液，將Ig肝素化的脫細(xì)胞基質(zhì)浸泡在ImLVEGF的I3BS溶液中，4°C孵育過(guò)夜，室溫下PBS漂洗4次，每次1min，即得接枝VEGF的豬脫細(xì)胞心包膜。
[0053](2)接枝VEGF的豬脫細(xì)胞心包膜的預(yù)處理
[0054]取步驟(I)制備的接枝VEGF的豬脫細(xì)胞心包膜浸入5mL生理鹽水中，2h后使用眼科環(huán)鉆裁剪成直徑為Imm的心包膜片，用去離子水沖洗3次后在4°C冰箱靜置過(guò)夜，用去離子水沖洗3次后，在-20 0C冰箱冷凍4h，冷凍干燥。
[0055](3)豬脫細(xì)胞心包膜/PLGA復(fù)合支架制備
[0056]使用350μπι直徑的針灸針將步驟(2)的豬脫細(xì)胞心包膜按照?qǐng)D1所示的模型(直徑1.5cm)排列(5 X 8)，針間距為1mm。饒鑄3mL10wt%PLGA的I，4二氧六環(huán)溶液(脫細(xì)胞基質(zhì)和PLGA的質(zhì)量比為1: 3)，然后移入冰盒中保持2h后，取出后依次置于-20°C和_80°C冰箱中保持4h，再移入液氣觸中保持8h，最后移除細(xì)針，冷凍干燥。
[0057](4)豬脫細(xì)胞心包膜/PLGA復(fù)合支架的后期處理
[0058]將步驟(3)得到的豬脫細(xì)胞心包膜/PLGA復(fù)合支架用去離子水沖洗6次后，使用超純水在截留分子量為5000Da的透析裝置中反復(fù)透析6次，每次4h。干燥后，使用鈷60(15KyG)照射滅菌15min，得到用于組織工程血管化的脫細(xì)胞心包膜基質(zhì)/PLGA復(fù)合支架。
[0059]將本實(shí)施例制備得到的組織工程血管化支架進(jìn)行如下性能檢測(cè):
[0060](I)支架形貌觀察
[0061 ]將實(shí)施例1得到的支架分別裁成薄片，使用掃描電子顯微鏡(Philips XL-30ESEM)對(duì)材料形貌進(jìn)行觀察，加速電壓20KV，樣品干燥后噴金處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，從圖2中的a可見(jiàn)支架大孔直徑為370 ± 4.7μπι，有利于細(xì)胞長(zhǎng)入和增殖;從圖2中的b可見(jiàn)小孔直徑為50±11μπι，可實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的滲透。從圖2中的c可見(jiàn)，豬脫細(xì)胞心包膜層疊分布于支架內(nèi)部，內(nèi)皮細(xì)胞可以借助基質(zhì)金屬蛋白酶降解心包膜后形成的空間長(zhǎng)入，并誘導(dǎo)支架內(nèi)部血管網(wǎng)絡(luò)的形成。
[0062](2)支架降解性能測(cè)定
[0063]將復(fù)合支架真空干燥至恒重(Wo)后放入盛有人工降解液(Hank溶液，ρΗ = 7.4)的密閉試管中(固液比為1:20)，37°C條件下進(jìn)行降解。試樣分別于第I周、第2周、第3周、第4周取出，蒸餾水清洗并干燥至恒重(Wt)，然后測(cè)定降解試樣的降解率(d)。計(jì)算公式:d= (Wo-Wt)/WoX100%o
[0064]結(jié)果表明，本實(shí)施例制備的組織工程血管化支架4周后的降解率為15%。
[0065](3)支架孔隙率測(cè)試
[0066]應(yīng)用排液法測(cè)定孔隙率，即分析天平稱重后放入盛有無(wú)水乙醇的量筒中，初始體積為VI，然后密封量筒，靜置5?lOmin，使試樣被無(wú)水乙醇完全浸透且試樣表面無(wú)明顯氣泡，此時(shí)的總體積為V2;取出試樣，量筒中無(wú)水乙醇的容積為V3。試樣的體積(V)及孔隙率(K)，按下列公式計(jì)算:V=(V2-V1) + (V1-V3)=V2-V3;K=(V1-V2)/(V2-V3)。
[0067]結(jié)果表明，本實(shí)施例1制備的組織工程血管化支架的孔隙率為90%。
[0068](4)大鼠股骨缺損模型檢測(cè)
[0069]取20只5周齡的大鼠，分為兩組，腹腔注射麻醉后，在其左側(cè)下肢股骨干中段骨處切除1.5_長(zhǎng)度的骨干和骨膜缺損，制備骨缺損模型。向?qū)嶒?yàn)組植入本實(shí)施例1制備的支架，使用鋼板固定，對(duì)照組僅用鋼板固定。術(shù)后使用生理鹽水沖洗傷口，縫合肌膜和皮膚，連續(xù)3天碘伏消毒切口，每天肌注青霉素20萬(wàn)U。右側(cè)下肢不予固定，可自由活動(dòng)。
[0070]84天后，脫頸處死，取出支架部位股骨。脫鈣處理后，石蠟包埋，5μπι連續(xù)切片，HE染色，結(jié)果表明，支架內(nèi)部有新血管形成，并有成纖維細(xì)胞支持;使用micro-CT掃描，結(jié)果表明支架內(nèi)部有血管網(wǎng)絡(luò)形成。
[0071]實(shí)施例2
[0072]本實(shí)施例的組織工程血管化支架由以下方法制備得到:
[0073](I)負(fù)載鍶離子的狗脫細(xì)胞膀胱的制備
[0074]參考專利CN101274106 B(—種制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法)制備狗脫細(xì)胞膀胱，然后將2g干重狗脫細(xì)胞膀胱浸入50mL0.05mo VL氯化鍶的roS(pH = 7.2)溶液，4°C孵育過(guò)夜，室溫下PBS漂洗4次，每次lOmin，即得負(fù)載鍶離子的狗脫細(xì)胞膀胱。
[0075](2)負(fù)載鍶離子的狗脫細(xì)胞膀胱的預(yù)處理
[0076]取步驟(I)制備的負(fù)載鍶離子的狗脫細(xì)胞膀胱浸入5mL生理鹽水中，在4°C冰箱靜置過(guò)夜，裁剪成直徑為Imm的膜片，用去離子水沖洗3次后，在_20°C冰箱中冷凍4h，然后冷凍干燥。
[0077](3)負(fù)載鍶離子的狗脫細(xì)胞膀胱/PLA復(fù)合支架制備
[0078]使用CAD軟件設(shè)計(jì)模型，細(xì)柱高度和寬度均為500μπι，細(xì)柱間距為50μπι。以可溶性蠟材料為原料使用3D打印機(jī)制備出模型樣品，加入裁剪后的脫細(xì)胞膜片。澆鑄3mL8 % PLA的二甲基亞砜溶液(脫細(xì)胞基質(zhì)與PLA的質(zhì)量比為1:900)，依次移入-20 0C和-80 V的冰箱中保持4h，然后冷凍干燥。固化后使用60 %乙醇4°C下洗去蠟制模具。
[0079](4)負(fù)載鍶離子的狗脫細(xì)胞膀胱/PLA復(fù)合支架的后期處理
[0080]將步驟(3)得到的脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)/PLA復(fù)合支架用去離子水沖洗6次后，使用生理鹽水在截留分子量為500Da的透析裝置中反復(fù)透析8次，每次4h。干燥后，使用鈷60(15KyG)照射滅菌15min，得到用于組織工程血管化的脫細(xì)胞心包膜基質(zhì)/PLGA復(fù)合支架。
[0081 ]將本實(shí)施例制備得到的組織工程血管化支架進(jìn)行如下性能檢測(cè):
[0082](I)支架形貌觀察
[0083]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例2制備的支架孔徑為500 ±8μπι。
[0084](2)支架降解性能測(cè)定
[0085]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例2制備的支架4周后降解率為30%。
[0086](3)支架孔隙率測(cè)試
[0087]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例2制備的支架孔隙率為60%。
[0088]實(shí)施例3
[0089]本實(shí)施例的組織工程血管化支架由以下方法制備得到:
[0090](I)脫細(xì)胞基質(zhì)的預(yù)處理
[0091]參考專利CN101274106 B(—種制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法)制備脫細(xì)胞羊膜，具體步驟如實(shí)施例1，區(qū)別僅在于將實(shí)施例1中的豬心包膜組織替換為羊膜組織；
[0092]取干重0.4g脫細(xì)胞羊膜浸入5mL生理鹽水中，4h后使用眼科環(huán)鉆裁剪成直徑為Icm的膜片，在4°C冰箱中靜置過(guò)夜，用去離子水沖洗3次后，在-20°C冰箱冷凍4h，然后實(shí)施冷凍干燥。
[0093](2)脫細(xì)胞羊膜/PLGA復(fù)合支架制備
[0094]使用500μπι直徑的針灸針將步驟(I)的細(xì)胞羊膜按照?qǐng)D1所示模型(直徑1.5cm)排列(5 X 8)，針間距為1.5mm。澆鑄2mL6 %PCL的I，4二氧六環(huán)溶液(脫細(xì)胞基質(zhì)與PCL的質(zhì)量比為1:20)，將模具移入冰盒中保持2h后，依次移入-20°C和-80°C冰箱保持4h，移除針后，冷凍干燥。
[0095](3)脫細(xì)胞羊膜/PCL復(fù)合支架的后期處理
[0096]將步驟(2)得到的脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)/PCL復(fù)合支架用去離子水沖洗6次后，使用PBS在截留分子量為SOOODa的透析裝置中反復(fù)透析6次，每次4h。干燥后，使用環(huán)氧乙烷滅菌，得到用于組織工程血管化的脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)/PCL復(fù)合支架。
[0097]將本實(shí)施例制備得到的組織工程血管化支架進(jìn)行如下性能檢測(cè):
[0098](I)支架形貌觀察
[0099]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例3制備的支架孔徑為537±5μπι。
[0100](2)支架降解性能測(cè)定
[0101 ]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例3制備的支架4周后降解率為9%。
[0102](3)支架孔隙率測(cè)試
[0103]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例3制備的支架孔隙率為93%。
[0104]實(shí)施例4
[0105]本實(shí)施例的組織工程血管化支架由以下方法制備得到:
[0106](I)接枝PDGF的豬脫細(xì)胞真皮的制備
[0107]接枝TOGF的豬脫細(xì)胞真皮方法同實(shí)施例1步驟(I)，區(qū)別僅在于:將其中的“豬心包膜組織”替換為“豬真皮組織” ;“1000ng/mL的VEGF的PBS(pH= 7.2)溶液”替換為“1000ng/mL的PDGF的PBS(pH=7.2)溶液”。
[0108](2)接枝PDGF的豬脫細(xì)胞真皮的預(yù)處理
[0109]取步驟(I)制備的接枝PDGF的豬脫細(xì)胞真皮浸入5mL生理鹽水中，置于4°C冰箱靜置過(guò)夜，用去離子水沖洗3次后，裁剪成直徑為Imm的膜片，在-20°C冰箱冷凍4h，然后冷凍干燥。
[0110](3)豬脫細(xì)胞真皮/PCL復(fù)合支架制備
[0111]配置8%PCL的二氯甲烷溶液，使用北京富有馬公司的FM-10靜電紡絲機(jī)紡織人工血管，收絲過(guò)程中加入豬脫細(xì)胞真皮膜片(脫細(xì)胞基質(zhì)和PCL的質(zhì)量比為1:300)。取下支架，干燥保存?zhèn)溆谩?br>[0112](4)豬脫細(xì)胞真皮/PCL復(fù)合支架的后期處理
[0113]將步驟(3)得到的脫細(xì)胞真皮/PCL復(fù)合支架用去離子水沖洗6次后，使用PBS在截留分子量為15000Da的透析裝置中反復(fù)透析6次，每次8h。干燥后，使用鈷60(15KyG)照射滅菌15min，得到用于組織工程血管化的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)/PCL復(fù)合支架。
[0114]將本實(shí)施例4制備得到的組織工程血管化支架進(jìn)行如下性能檢測(cè):
[0115](I)支架降解性能測(cè)定
[0116]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例4制備的支架4周后降解率為11%。
[0117](2)支架孔隙率測(cè)試
[0118]測(cè)試方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示本實(shí)施例4制備的支架孔隙率為76%。
[0119]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理； (2)使用組織工程支架成型方法，制備脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架； (3)將步驟(2)制備的脫細(xì)胞基質(zhì)/合成材料復(fù)合支架進(jìn)行后期處理，除去制備處理過(guò)程中的殘留物質(zhì)，獲得組織工程血管化支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的脫細(xì)胞基質(zhì)為未改性的或改性的脫細(xì)胞心包膜、脫細(xì)胞軟骨、脫細(xì)胞真皮、脫細(xì)胞羊膜、脫細(xì)胞膀胱、脫細(xì)胞小腸粘膜下基質(zhì)、脫細(xì)胞腎臟、脫細(xì)胞血管中的至少一種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 所述的改性指引入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、音猬因子、鍶離子、銅離子中的一種或一種以上。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的預(yù)處理包括如下的步驟A，或步驟A和步驟B，或步驟A?C: A、使用生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或超純水浸泡脫細(xì)胞基質(zhì)； B、對(duì)脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行適度裁剪，得到面積為0.0lmm2?4cm2，厚度為0.0lmm?Icm的脫細(xì)胞基質(zhì)塊，并用去離子水清洗浸泡后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)； C、風(fēng)干或冷凍干燥后，在干燥器中保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的合成材料為可降解合成材料。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的合成材料為醫(yī)用級(jí)聚乳酸、聚乙交酯、聚乳酸-羥基乙酸酯、聚ε-己內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯和聚氨基酸中的至少一種。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的成型方法包括冷凍干燥法、靜電紡絲法、3D打印法。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(2)中所用的脫細(xì)胞基質(zhì)與合成材料的質(zhì)量比為1:1000?3:1; 步驟(2)中所述的組織工程支架成型方法中，所用的合成材料以溶液形式存在，溶液濃度為0.0lwt %?30wt %，溶劑為二甲基亞砜、I，4二氧六環(huán)、二氯甲燒中的至少一種。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程血管化支架的構(gòu)建方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的后處理是指用去離子水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液沖洗步驟(2)制備的組織工程血管化支架，再用截留分子量為100?200000Da的透析裝置進(jìn)行透析，透析液為生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或超純水，最后經(jīng)過(guò)滅菌即可。10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建得到的組織工程血管化支架。
【文檔編號(hào)】A61L27/18GK106075582SQ201610497681
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】屠美, 趙巨鵬, 武征
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)