一種生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，尤其涉及一種生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片。
【背景技術(shù)】
[0002]由于氣管先天畸形、腫瘤切除、外傷等各種病因，常會(huì)導(dǎo)致氣管壁部分缺失。如果直接將氣管縱行縫合，可能會(huì)造成醫(yī)源性氣道狹窄，引起一系列并發(fā)癥包括反復(fù)發(fā)作的致命性肺炎，此時(shí)將氣管切斷再吻合是目前解決這一難題的主要方法。但是，行長(zhǎng)段氣管切除術(shù)(成人大于全長(zhǎng)的50%，兒童大于30%)后，由于兩斷端距離太遠(yuǎn)造成吻合口張力過(guò)大，手術(shù)無(wú)法進(jìn)行。故尋找一種良好的補(bǔ)片材料對(duì)缺損的氣管壁進(jìn)行修補(bǔ)，對(duì)于解決這一臨床問題有著重要的意義。
[0003]同種異體移植作為最經(jīng)典的器官替代、修復(fù)和重建方法，已經(jīng)有百余年的歷史，并在多個(gè)領(lǐng)域取得一定的成功。但是，一方面供體器官的嚴(yán)重缺乏在世界范圍內(nèi)面臨的難題；另一方面，由于控制排異反應(yīng)存在，需要長(zhǎng)期服用免疫抑制劑所帶來(lái)的巨大副作用不容小覷。即便是在長(zhǎng)期堅(jiān)持服用藥物的情況下，慢性排異反應(yīng)也無(wú)法阻止，移植物最終會(huì)失去功能，從而需要再次手術(shù)或其他替代治療。更重要的是，研究表明氣管粘膜上皮細(xì)胞具有很高的MHC I和MHC II抗原，異體上皮細(xì)胞是免疫攻擊的把目標(biāo)和重要環(huán)節(jié)，所以造成氣管的同種異體移植成功率更低、風(fēng)險(xiǎn)更大。降低移植物的免疫原性，減少排異反應(yīng)是同種異體移植亟待解決的問題。
[0004]組織工程是在體外構(gòu)建具有生命力的活體植入體內(nèi)。從而達(dá)到修復(fù)缺損、重建功能、提高生活質(zhì)量之目的。理想的氣管補(bǔ)片應(yīng)該最大限度地降低移植物的免疫原性，并且盡可能的保留細(xì)胞外基質(zhì)。組織工程氣管正好滿足了這些基本條件，是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。2008年瑞典的Macchiarini醫(yī)生利用氣管脫細(xì)胞支架材料完成了第一例成功的組織工程氣管移植手術(shù)，標(biāo)志著氣管重建的組織工程時(shí)代的開始。然而，由于這一技術(shù)仍然依賴于供體捐獻(xiàn)氣管以制作脫細(xì)胞氣管支架，所以氣管來(lái)源仍然面臨挑戰(zhàn)。另一方面，由于受者的細(xì)胞要經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)一段時(shí)間的復(fù)雜培養(yǎng)工藝才能定植、攀附到脫細(xì)胞氣管支架上，所以這種制作方法的效率仍然有待提高。
[0005]最近的十年，增材制造技術(shù)，也就是人們熟悉的“三維打印技術(shù)”的快速發(fā)展，為生物醫(yī)學(xué)界帶來(lái)新的啟迪。它是一種個(gè)性化制備復(fù)雜支架和組織工程植入物的多功能快速成型技術(shù)。而生物打印在傳統(tǒng)三維打印的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)于細(xì)胞空間分布的精確定位?？墒牵壳把芯康玫降娜S打印氣管補(bǔ)片存在生物相容性差、細(xì)胞成活率低、制作工藝復(fù)雜、產(chǎn)品可塑性差、無(wú)法滿足個(gè)性化需求等缺點(diǎn)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006]本實(shí)用新型為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出了一種結(jié)合3D打印技術(shù)的生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片，合理調(diào)整補(bǔ)片的內(nèi)部層級(jí)結(jié)構(gòu)，完善內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，能夠臨床提供安全可行的氣管補(bǔ)片產(chǎn)品。
[0007]本實(shí)用新型解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)措施為:
[0008]—種生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片，包括上皮細(xì)胞復(fù)合材料層、軟骨細(xì)胞復(fù)合材料層及硬材料層，所述軟骨細(xì)胞復(fù)合材料層置于所述上皮細(xì)胞復(fù)合材料層和硬材料層之間。
[0009]為進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本實(shí)用新型所采取的技術(shù)措施還包括:
[0010]生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片平面結(jié)構(gòu)可以為矩形、圓形或任意多邊形。
[0011]生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片立體結(jié)構(gòu)可以為圓管型、C型圓管型或半圓管型。
[0012]在制備本實(shí)用新型的生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片時(shí)，包括以下步驟:
[0013]步驟一，利用支氣管鏡，無(wú)菌刷取支氣管上皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；提取耳廓軟骨細(xì)胞，消化、分散，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；
[0014]步驟二，將膠原和透明質(zhì)酸與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過(guò)濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養(yǎng)液中；
[0015]步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養(yǎng)液以1:1的體積比相混合，制成重懸細(xì)胞的軟材料混合物；
[0016]步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物；
[0017]步驟五，分別將所述步驟一中擴(kuò)增培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料；
[0018]步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料分別置于兩只低溫墨倉(cāng)內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機(jī)上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉(cāng)內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機(jī)針頭，加載于3D打印機(jī)上備用；
[0019]步驟七，使用建模軟件構(gòu)建貼合的三層矩形片狀結(jié)構(gòu)模型，依次為上皮細(xì)胞層(即上皮細(xì)胞復(fù)合材料層)、軟骨細(xì)胞層(即軟骨細(xì)胞復(fù)合材料層)和硬材料層，所述上皮細(xì)胞層由支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料組成，所述軟骨細(xì)胞層由軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料組成，所述硬材料層由硬材料混合物組成；
[0020]步驟八，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機(jī)并進(jìn)行3D打印，得到生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片。
[0021]為進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本實(shí)用新型所采取的技術(shù)措施還包括:
[0022]上述步驟八具體包括:
[0023]步驟1，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機(jī)驅(qū)動(dòng)程序，分層解析；
[0024]步驟2，將一片無(wú)菌載玻片置于打印機(jī)作業(yè)平臺(tái)上，校準(zhǔn)定位打印機(jī)針頭；
[0025]步驟3，設(shè)置打印機(jī)運(yùn)行參數(shù):硬材料混合物加熱溫度為150-210°C，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.2-0.5毫米，墨倉(cāng)內(nèi)驅(qū)動(dòng)氣壓為0.1-0.5Bar，針頭運(yùn)行速度為5_10毫米/秒；支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料保持室溫，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.1-0.3毫米，墨倉(cāng)內(nèi)驅(qū)動(dòng)氣壓為0.1-0.3Bar，針頭運(yùn)行速度為7_13毫米/秒；
[0026]步驟4，啟動(dòng)打印流程，按照設(shè)置的運(yùn)行參數(shù)打印硬材料層；
[0027]步驟5，打印軟骨細(xì)胞層，完成軟骨細(xì)胞層的打印后暫停打印作業(yè)，用超聲霧化機(jī)將三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于軟骨細(xì)胞層上，使之充分交聯(lián)；
[0028]步驟6，繼續(xù)打印作業(yè)，打印上皮細(xì)胞層，完成后用超聲霧化機(jī)將三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于上皮細(xì)胞層上，使之充分交聯(lián)；
[0029]步驟7，用鑷子小心將制作完成的生物性復(fù)合氣管補(bǔ)片從載玻片上揭下，無(wú)菌條件下修剪成受體所需求的形狀。
[0030]上述步驟二為將10%膠原和5%透明質(zhì)酸按照質(zhì)體積比與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過(guò)濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射24小時(shí)徹底滅菌，以8%質(zhì)量體積比分散于滅菌培養(yǎng)液中。
[0031]上述步驟四為將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物。
[0032]上述步驟五為分別將所述步驟一中擴(kuò)增培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)并離心，棄去上清后，按照1 X 106個(gè)/毫升的細(xì)胞濃度重懸于所述步驟三