通過靜電紡絲將核酸適配體修飾的高分子體系紡成纖維膜應用于控制釋放的制作方法
【專利摘要】通過靜電紡絲將核酸適配體修飾的高分子體系紡成纖維膜應用于控制釋放，本發(fā)明屬于材料科學領域，本發(fā)明設計制備特定的核酸適配體，兩條互補配對的DNA鏈，通過接枝將DNA雙鏈分別接枝到線狀聚丙烯酰胺高分子聚合物上，接著加入客體分子，通過引發(fā)適配子雜交形成包裹客體分子的裝載體系。通過靜電紡絲將裝載體系紡成纖維膜，當加入與適配子結(jié)合能力更強的目標分子時，通過競爭結(jié)合適配子，裝載體系解體，包裹的客體分子釋放出來。本發(fā)明技術(shù)方案設計新穎合理，重復性好。本發(fā)明通過靜電紡絲將適配子修飾的裝載體系制成纖維膜，用于客體分子的控制釋放，其具有大的比表面積且生物相容性好，大大擴展了釋放領域研究空間，有望應用于醫(yī)學等領域。
【專利說明】通過靜電紡絲將核酸適配體修飾的高分子體系紡成纖維膜應用于控制釋放
[0001]【技術(shù)領域】
在生物醫(yī)學領域，納米纖維的直徑小于細胞，可以模擬天然的細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物功能；人的大多數(shù)組織、器官在形式和結(jié)構(gòu)上與納米纖維類似，這為納米纖維用于組織和器官的修復提供了可能；一些電紡原料具有很好的生物相容性及可降解性，可作為載體進入人體，并容易被吸收；加之靜電紡納米纖維還有大的比表面積、孔隙率等優(yōu)良特性，因此，其在生物醫(yī)學領域引起了研究者的持續(xù)關(guān)注，并已在藥物控釋、創(chuàng)傷修復、生物組織工程等方面得到了很好的應用。
【背景技術(shù)】[0002]自1934年，F(xiàn)ormalas發(fā)明了用靜電力制備聚合物纖維的實驗裝置以來，通過靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維材料已經(jīng)成為近幾十年來世界材料科學【技術(shù)領域】的最重要的學術(shù)與技術(shù)活動之一。靜電紡絲并以其制造裝置簡單、紡絲成本低廉、可紡物質(zhì)種類繁多、工藝可控等優(yōu)點，已成為有效制備納米纖維材料的主要途徑之一。靜電紡絲技術(shù)已經(jīng)制備了種類豐富的納米纖維，包括有機、有機/無機復合和無機納米纖維。然而，利用靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維還面臨一些需要解決的問題。首先，在制備有機納米纖維方面，用于靜電紡絲的天然高分子品種還十分有限，對所得產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和性能的研究不夠完善，最終產(chǎn)品的應用大都只處于實驗階段，尤其是這些產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還存在較大的問題。其次，靜電紡有機/無機復合納米纖維的性能不僅與納米粒子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與納米粒子的聚集方式和協(xié)同性能、聚合物基體的結(jié)構(gòu)性能、粒子與基體的界面結(jié)構(gòu)性能及加工復合工藝等有關(guān)。如何制備出適合需要的、高性能、多功能的復合納米纖維是研究的關(guān)鍵。此外，靜電紡納米纖維擁有大的比表面積，開發(fā)通過靜電紡絲將適配子修飾高分子體系制備成為纖維小球用于藥物控制釋放，無疑是控釋領域的一個新的研究課題。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對控制釋放，本發(fā)明通過靜電紡絲將適配子修飾的高分子體系紡成具有生物性好，高比表面積的纖維膜的制備方法。
[0005]本發(fā)明的原理是在電紡絲過程中，噴射裝置中裝滿了充電的聚合物溶液或熔融液。在外加電場作用下，受表面張力作用而保持在噴嘴處的高分子液滴，在電場誘導下表面聚集電荷，受到一個與表面張力方向相反的電場力。當電場逐漸增強時，噴嘴處的液滴由球狀被拉長為錐狀，形成所謂的泰勒錐。而當電場強度增加至一個臨界值時，電場力就會克服液體的表面張力，從泰勒錐中噴出。噴射流在高電場的作用下發(fā)生震蕩而不穩(wěn)，產(chǎn)生頻率極高的不規(guī)則性螺旋運動。在高速震蕩中，噴射流被迅速拉細，溶劑也迅速揮發(fā)，最終形成直徑在nm級的纖維，并以隨機的方式散落在收集裝置上，形成纖維材料。
[0006]本發(fā)明的目標主要是提供一種高比表面且生物相容性好的纖維小球或纖維絲的制備方法，并應用于藥物控制釋放領域。
[0007]本發(fā)明以適配子修飾的高分子體系為紡絲材料，來制備具有高的比表面且生物相容性好的纖維小球與纖維絲。
[0008]本發(fā)明所制得的纖維小球直徑在l-2um之間，纖維絲的寬直徑在Ium左右。
[0009]本發(fā)明采用一步法合成的金納米粒子直徑為10_20nm。
[0010]本發(fā)明是在高分子體系上修飾DNA以及后續(xù)試驗都是在室溫下進行(不高于30。 C)。
[0011]步驟(1)中制備得到的六條DNA片段的純化的量是通過檢測260nm處紫外吸收來確定的。
[0012]步驟(2)得到的無色油狀目標化合物是通過柱層析提純了粗制得的丙烯酸亞磷酰胺。
[0013]步驟(3)所制的高分子體系是通過引入DNA雜交引發(fā)劑，通過DNA雜交拉近兩高分子鏈條的距離，交聯(lián)度增大，從而形成高分子體系；
本發(fā)明技術(shù)方案設計新穎合理，重復性好。本發(fā)明所制得的纖維小球與纖維絲，用于蛋白與藥物的控制釋放、選擇性和適用范圍非常廣。
[0014]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明通過靜電紡絲制備的纖維小球I的掃描電鏡圖片；
圖2是本發(fā)明通過靜電紡絲制備的纖維小球2的掃描電鏡圖片；
圖3是本發(fā)明通過靜電紡絲制備的纖維絲3的掃描電鏡圖片；
圖4是本發(fā)明一步法合成金納米粒子的SEM照片；
圖5是本發(fā)明通過UV-1800觀察表柔比星的釋放曲線(電紡纖維膜響應腺苷釋放表柔比星的吸光度曲線)；
圖6是本發(fā)明電紡纖維膜響應凝血酶釋放納米金粒子的吸光曲線圖。
[0016]
具體實施方案
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進一步說明。
[0018]高分子體系I
(I)首先，合成A鏈與B鏈兩條DNA單鏈，其A鏈堿基序列為:5’ -acrydite-AAA ATCACA GAT GAG T_3’，B鏈堿基序列為:5’-acrydite_AAA AGT CTC CCG AGA T_3，，分別修飾兩條DNA鏈得到S-A與S-B，將Acrydite修飾的S-A與S-B分別加入到pH= 8.0含有4%丙烯酸亞磷酰胺的10 mM的三羥甲基氨基甲硅烷鹽酸鹽中，并且分別加入200mM的NaCl，試樣置于真空干燥箱中反應20分鐘(試樣做兩份)。
[0019](2)然后加入52mg的胰島素，靜置20分鐘(另一份加入等量的金納米顆粒)
(3)試樣中加入1.4%新配置的引發(fā)劑(0.5 mL水，0.05 g過硫酸銨)和催化劑(0.5mL的水與25 U L四甲基乙二胺。將(PS-A)與(PS-B)以一定比例混合后，加入Linker-Apt，于真空干燥箱中反應20分鐘，形成溶膠I (試樣做兩份)。[0020](4)首先，將溶膠I溶于IOmL蒸餾水中，完全混勻后得到懸浮液；然后在攪拌速度為300r/min的磁力攪拌條件下攪拌4小時，即得到靜電紡絲溶液。將靜電紡絲液注入到靜電紡絲裝置中，然后將接收屏與注射器垂直放置，且與注射器針頭的垂直距離為22cm，然后在環(huán)境濕度小于30%RH，電壓為IOkv和推進速度為0.08mL/h的條件下靜電紡絲，即在接收屏上得到分布均勻的電紡纖維小球I。將得到的電紡纖維于真空干燥箱中30° C干燥過夜(試樣做兩份)。
[0021](5)取IOOmg干燥后的纖維小球I,加入到ImL的水中，待纖維小球分散均勻之后再加入ImM的cocaine,通過紫外UV-1800來測釋放的金納米粒子的濃度,進而確定釋放胰
島素的量。
[0022]高分子體系2
(I)響應腺苷的高分子體系的制備:首先，合成C鏈與D鏈兩條DNA單鏈，其C鏈堿基序列為:5，-Acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T_3，，D 鏈堿基序列為:5，-Acrydite-AAA ACCCAG GTT CTC T-3’，分別修飾兩條DNA鏈得到S-C與S-D，將Acrydite修飾的S-C與S-D分別加入到含有4%丙烯酸亞磷酰胺的(10 mM)三羥甲基氨基甲硅烷鹽酸鹽(pH= 8.0)中，并且分別加入(200mM) NaCl，試樣置于真空干燥箱中反應20分鐘。
[0023](2)接著加入(0.52mg/ml)的表柔比星，放置20分鐘后，于試樣中加入1.4%新配置的引發(fā)劑(0.5 mL水，0.05 g過硫酸銨)和催化劑(0.5 mL的水與25 y L四甲基乙二胺。將(PS-C)與(PS-D)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反應20分鐘，形成溶膠2。
[0024](3)首先，將溶膠2溶于IOmL蒸餾水中，完全混勻后得到懸浮液；然后在攪拌速度為300r/min的磁力攪拌條件下攪拌4小時，即得到靜電紡絲溶液2。
[0025](4)將靜電紡絲液注入到靜電紡絲裝置中，然后將接收屏與注射器垂直放置，且與注射器針頭的垂直距離為22cm，然后在環(huán)境濕度小于30%RH，電壓為IOkv和推進速度為0.25mL/h的條件下靜電紡絲，即在接收屏上得到分布均勻的電紡纖維小球2。將得到的電紡纖維于真空干燥箱中30° C干燥過夜。
[0026](5)取IOOmg干燥后的纖維小球2，加入到ImL的水中，待纖維小球分散均勻之后再加入ImM的腺苷，通過紫外UV-1800來測釋放的表柔比星的濃度。
[0027]高分子體系3
(I)響應凝血酶的高分子體系的制備:首先，合成E鏈與F鏈兩條DNA單鏈，其 E 鏈堿基序列為:5’ -Acrydite-ACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3’ ，F(xiàn) 鏈堿基序列為:5’-Acrydite-ACCAACCACAGT-3’，分別修飾兩條 DNA 鏈得到 S-E 與 S-F，將 Acrydite 修飾的S-E與S-F分別加入到含有4%丙烯酰胺的(10 mM)三羥甲基氨基甲硅烷鹽酸鹽(pH=
8.0)中，并且分別加入(200mM) NaCl，試樣置于真空干燥箱中反應20分鐘(試樣做兩份)。
[0028](2)然后加入55mg的云南白藥，靜置20分鐘后，試樣中加入1.4%新配置的引發(fā)劑(0.5 mL水，0.05 g過硫酸銨)和催化劑(0.5 mL的水與25 y L四甲基乙二胺。將(PS-E)與(PS-F)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反應20分鐘，形成溶膠3(另一份加入等質(zhì)量的金納米粒子)。
[0029](3)首先，將溶膠3溶于3m L蒸餾水中，加入IOuL(0.05mM/L)的DMS0，完全混勻后得到懸浮液；然后在攪拌速度為300r/min的磁力攪拌條件下攪拌4小時，即得到靜電紡絲溶液3 (試樣做兩份)。
[0030](4)將靜電紡絲液注入到靜電紡絲裝置中，然后將接收屏與注射器垂直放置，且與注射器針頭的垂直距離為15cm，然后在環(huán)境濕度小于30%RH，電壓為25kv和推進速度為
0.25mL/h的條件下靜電紡絲，即在接收屏上得到分布均勻的電紡纖維絲3。將得到的電紡纖維于真空干燥箱中30° C干燥過夜(試樣做兩份)。
[0031](5)取IOOmg干燥后的纖維絲3，加入到ImL的水中，待纖維小球分散均勻之后再加入ImM的凝血酶，通 過紫外UV-1800來測釋放的金納米粒子的濃度來確定釋放云南白藥的量。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸適配體交聯(lián)的聚丙烯酰胺高分子體系的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)核酸的合成 首先，將含有十幾個或幾十個堿基序列的能響應目標分子的DNA片段加入到2.5ml氫氧化銨中，于40° C水浴條件下培育17小時，DNA片段將在CPG島處被分成兩條單鏈DNA，單鏈DNA被轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，加入250uL物質(zhì)的量濃度為3M的NaCl與6.25ml乙醇，將離心管放入到-20° C冰箱中醇沉DNA;然后，試樣于將醇沉的DNA于4° C以下在4000rpm的轉(zhuǎn)速條件下離心30分鐘，移除上清液，沉淀下來的DNA試樣溶解于500uL物質(zhì)的量濃度為0.2M的三乙胺中用高相色譜純化，干燥收集到的DNA產(chǎn)物，然后將DNA溶解在200uL 80%的乙酸中溫育20分鐘，從而脫掉三苯甲基，脫去三苯甲基DNA試樣加入400uL乙醇并且真空干燥，通過檢測260nm處紫外吸收來確定純化的量，最后，純化后的DNA溶解于水中，于-20° C下保存，以備下一步實驗； (2)丙烯酸亞磷酰胺的合成 首先，9.32g的6-氨基-1-正己醇與16.16g的三乙胺加入到IOOmL 二氯甲烷中，然后將IOg甲基丙烯酰氯慢慢的加入，反應于0° C的冰水浴中攪拌2小時，通過加入IOOmL水終止反應，有機層用5%的HCl清洗并且干燥，得到粗制的6-羥乙基甲基丙烯酰胺，在0° C冰水浴中，將2 g的6-氨基-1-正己醇加入到40 mL無水乙腈中，15分鐘內(nèi)慢慢加A3.9 g的N，N’-二異丙腈，然后逐滴加入13 mmol的2-氰乙基二異丙基氯代亞磷酰胺，反應混合物在0 ° C下攪拌5小時，然后去除溶劑，沉淀再分散于乙酸乙酯中并且有機相用NaHC03標準溶液與NaCl標準溶液清洗并用過量的無水硫酸鎂干燥，當溶劑蒸發(fā)完之后，沉淀用柱層析法凈化(乙酸乙酯/己烷/三乙胺=40:60:3)，干燥后得3.33 g無色油狀目標化合物； (3)裝載客體分子 Acrydite修飾的S-A與S-B分別加入到含有4%丙烯酸亞磷酰胺的PH=8物質(zhì)的量濃度為10 mM的三羥甲基氨基甲硅烷鹽酸鹽中，并且分別加入物質(zhì)的量濃度為200mM的NaCl，試樣置于真空干燥箱中反應20分鐘，然后加入適量客體分子，靜置20分鐘； (4)裝載體系的形成 試樣中加入1.4%新配置的過硫酸銨溶液作為引發(fā)劑和四甲基乙二胺作為催化劑，將PS-A與PS-B以一定比例混合后，加入LinkerAdap,于真空干燥箱中反應20分鐘，形成裝載體系，其中所述的引發(fā)劑為將0.05g的過硫酸銨溶解于0.5mL的水中形成的溶液，所述的催化劑為將25uL四甲基乙二胺溶解于0.5mL的水中形成的溶液； (5)配置紡絲溶液 配置紡絲溶液:首先，將溶膠I溶于IOmL蒸餾水中，完全混勻后得到懸浮液；然后在攪拌速度為300r/min的磁力攪拌條件下攪拌4小時，即得到靜電紡絲溶液； (6)靜電紡絲 紡絲1:將靜電紡絲液注入到靜電紡絲裝置中，然后將接收屏與注射器垂直放置，且與注射器針頭的垂直距離為22cm，然后在環(huán)境濕度小于30%RH，電壓為IOkv和推進速度為0.08mL/h的條件下靜電紡絲，即在接收屏上得到分布均勻的電紡纖維小球1，將得到的電紡纖維于真空干燥箱中30° C干燥過夜；紡絲2:將靜電紡絲液注入到靜電紡絲裝置中，然后將接收屏與注射器垂直放置，且與注射器針頭的垂直距離為22cm，然后在環(huán)境濕度小于30%RH，電壓為IOkv和推進速度為.0.25mL/h的條件下靜電紡絲，即在接收屏上得到分布均勻的電紡纖維小球2，將得到的電紡纖維于真空干燥箱中30° C干燥過夜； 紡絲3:將靜電紡絲液注入到靜電紡絲裝置中，然后將接收屏與注射器垂直放置，且與注射器針頭的垂直距離為15cm，然后在環(huán)境濕度小于30%RH，電壓為25kv和推進速度為.0.25mL/h的條件下靜電紡絲，即在接收屏上得到分布均勻的電紡纖維網(wǎng)膜3，將得到的電紡纖維于真空干燥箱中30° C干燥過夜； (7)金納米粒子的制備 取一個250mL的圓底燒瓶，加入70mL水，接著再加入IOmL質(zhì)量分數(shù)0.1%的HAuCl4.3H20，用電熱套加熱到70° C，撤下水浴，然后加入還原劑，所述催化劑為4mL (1%)的檸檬酸鈉與5mL質(zhì)量分數(shù)為1%的單寧酸，最后加入5mL物質(zhì)的量濃度為2.5mM的K2C03與6mL水，用電熱套加熱使反應迅速升溫，反應6分鐘即可； (8)控制釋放 取IOOmg干燥后的纖維小球，加入到ImL的水中，待纖維小球分散均勻之后再加入ImM的目標分子，通過紫外UV-1800來測釋放的目標分子的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:高分子體系電紡纖維膜包括電紡纖維小球與電紡纖維絲。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的方法，其特征是:通過靜電紡絲制得的高分子體系電紡電紡纖維小球I的平均粒徑為I~2 um ;通過靜電紡絲制得的高分子體系電紡纖維小球2的平均粒徑為I~2 um ;通過靜電紡絲制得的高分子體系電紡纖維絲3的平均寬直徑為I um。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:引發(fā)高分子體系I聚合的引發(fā)劑為Linker-Apt,引發(fā)高分子體系2、高分子體系3、聚合的引發(fā)劑為LinkerApad。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:6條DNA片段依次為S-A為SEQIDNO: 1,5，-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T_3，，S-B 為 SEQ ID NO:2，5，-acrydite-AAAAGT CTC CCG AGA T_3 S-C為 SEQ ID NO: 3，5，-Acrydite_MA ATC ACA GAT GAG T_3，，S-D為 SEQ ID NO:4, 5，-Acrydite-AAA ACC CAG GTT CTC T_3，，S-E 為 SEQ ID NO:5, 5，-Acrydite-ACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3，，S-F 為SEQ ID NO:6, 5，-Acrydite_ACCAACCACAGT_3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:高分子體系電紡纖維小球I可以特異性結(jié)合cocaine，高分子體系電紡纖維小球2可以特異性結(jié)合腺苷，高分子體系電紡纖維絲3可以特異性結(jié)合凝血酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其特征是合成的DNA鏈段是多種DNA鏈段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其特征是響應性目標分子是多種物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其特征是裝載到高分子體系的客體可以為金納米粒子，銀納米粒子，量子點，熒光物質(zhì)，磁性納米粒子，抗原，抗體，蛋白，RNA, DNA,藥物分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其特征是高分子體系可以是聚乙烯，聚乙烯醇，蠶絲蛋白，聚笨乙烯，聚酰胺，絲彈性蛋白的高分子體系。
【文檔編號】D01D5/00GK103705438SQ201310712073
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】溫永強, 桂萬元, 王文謙, 李延生, 焦翔宇, 趙娜, 張學記 申請人:北京科技大學