一種用于靶向捕獲癌細胞的葉酸功能化納米纖維的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于靶向捕獲癌細胞納米材料的制備領域，特別涉及一種用于靶向捕獲癌 細胞的葉酸功能化納米纖維的制備方法。
【背景技術】
[0002] 循環(huán)腫瘤細胞（CTC)是腫瘤轉移過程中在血液循環(huán)系統(tǒng)中存活的腫瘤細胞，該細 胞的生成被認為是腫瘤發(fā)生轉移的必要前提。惡性腫瘤是我國死亡率最高的重大疾病之 一，90%以上腫瘤患者的死亡都是由于腫瘤轉移所致。侵襲與轉移是惡性腫瘤最顯著的特 征之一，腫瘤細胞自發(fā)或因診療操作從原發(fā)腫瘤脫落，發(fā)生上皮-間質轉化（EMT)，從而具 有流動特性，進入外周血中，就形成了循環(huán)腫瘤細胞（CTC)。CTC的檢測有助于研宄腫瘤轉 移機制、指導腫瘤治療、判斷治療效果、為推斷預后提供可靠參考，是國內外腫瘤治療關注 的焦點。
[0003] 納米材料由于其尺寸較?。╨-100nm)，具有特殊的光學、電子學和磁學等性質受到 越來越多的關注。據(jù)報道證明納米結構可以很好地促進其與細胞間的相互作用，大大提高 捕獲效果。隨著納米科學與技術的發(fā)展，人們獲得了結構可控的、表面功能化的納米材料和 納米結構，靶向CTC表面標志物的特異性識別分子修飾的納米材料對CTC細胞的檢測研宄 受到了科學家的廣泛關注，并取得了令人矚目的成果。2013年，《自然》(Nature)雜志將CTC 納米檢測列為最具創(chuàng)新性和轉化潛力的腫瘤診斷新方法[MARXV.Trackingmetastasis andtrickingcancer[J].Nature, 2013, 494(7435):133-8. ]〇
[0004] 靜電紡絲技術因為其設備簡單，操作容易以及高效等特點，并且通過其制備的納 米纖維比表面積高、均一性好以及纖維形貌可調可控等優(yōu)點，而成為近年來備受關注、應用 最多的制備納米纖維的方法。使用該方法可以制備出直徑l〇nm~10ym的超細纖維，在催 化劑載體、生物醫(yī)學、增強材料、過濾材料、電極材料、傳感器等方面都有很好的應用。
[0005] 聚乙烯醇（PVA)具有優(yōu)異的生物可降解性、生物相容性，在外科用縫合線、體內植 入材料、藥物載體及組織工程支架方面有著廣泛的應用。PVA是一種半晶狀聚合物，具備較 高的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。PVA無毒，對動物體沒有負面影響，與皮膚接觸不會造成任何 損傷。聚乙烯亞胺（PEI)表面含有大量氨基，表面易修飾，且與PVA混紡可以很容易實現(xiàn)表 面交聯(lián)，提高其水穩(wěn)定性，目前正受到越來越廣泛的關注。
[0006] 目前，抗體、多肽、E-選擇素等細胞配體已被功能化修飾至納米纖維表面，并應 用于癌細胞的特異性捕獲。文獻[ZHAZB，COHNC，DAIZF，etal.Nanofibrouslipid membranescapableoffunctionallyimmobilizingantibodiesandcapturing specificcells[J].AdvMater, 2011，23(30) :3435-40.]中表明葉酸（FA)與葉酸受體 (FR)有很高的親和力。葉酸受體（FR)在許多上皮源性和非上皮源性惡性腫瘤細胞顯著高 表達，其表達水平大大高于正常細胞，具有組織特異性。FR是細胞攝取葉酸的重要途徑，其 機制為受體介導的內吞效應，這種機制具有親和力尚、特異性強的特點，有良好的物質轉運 潛能。葉酸是包括DNA合成、DNA修復和細胞分裂在內的很多生物過程所需的一種必要維 他命。"正常"細胞表達數(shù)量相對較少的三個葉酸受體FRa、FRf3和FR丫，而它們在癌細胞 中普遍過度表達FRa和FR0。能夠過度表達葉酸受體的癌癥細胞包括卵巢癌、肺癌、腎癌、 子宮內膜癌、乳腺癌、腦癌、結腸癌和造血系骨髓細胞癌等。
[0007] 有文獻報道[Zhao,Y. , etal., Dendrimer-functionalizedelectrospun celluloseacetatenanofibersfortargetedcancercellcaptureapplications. JournalOfMaterialsChemistryB,2014. 2(42):p. 7384-7393.]，通過將葉酸與樹狀大分 子結合，并修飾到聚電解質自組裝納米纖維表面，對癌細胞特異性地捕獲。該方法操作復 雜，自組裝的步驟繁瑣，且成本昂貴。
[0008] 聚乙烯亞胺（PEI)表面含有大量氨基，易修飾，且成本低廉，檢索國內外相關文獻 和專利結果表明：通過運用聚乙烯亞胺（PEI)進行表面修飾，用于靶向捕獲癌細胞的葉酸 功能化納米纖維的制備方法，尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種用于靶向捕獲癌細胞的葉酸功能化納米 纖維的制備方法，該方法制備的靶向分子葉酸修飾的功能化靜電紡聚乙烯醇/聚乙烯亞胺 (PVA/PEI)納米纖維材料可用于特異性捕獲癌細胞；該發(fā)明制備的癌細胞捕獲材料具有制 備工藝簡單、特異性強、可短時間內靶向捕獲癌細胞等優(yōu)點，在癌癥的早期診斷方面具有很 好的應用前景。
[0010] 本發(fā)明的一種用于靶向捕獲癌細胞的葉酸功能化納米纖維的制備方法，包括：
[0011] ⑴以水為溶劑，聚乙烯醇PVA與聚乙烯亞胺PEI按照質量比為3:1配制紡絲液， 通過靜電紡絲制備得到PVA/PEI納米纖維膜；
[0012] (2)將步驟⑴中制備得到的PVA/PEI納米纖維膜與戊二醛溶液在干燥器中進行 交聯(lián)反應，得到不溶于水的交聯(lián)PVA/PEI納米纖維膜；
[0013] (3)以二甲基亞砜DMS0為反應溶劑，通過1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽EDC? HC1和N-羥基琥珀酰亞胺NHS活化葉酸FA的羧基，將活化后的FA加入到帶 有一端羧基和一端氨基的聚乙二醇NH2-PEG-C00H溶液中，進行酰胺化反應，然后透析，冷凍 干燥，得到 FA-PEG-C00H;
[0014] (4)用EDC?HC1和NHS活化步驟⑶中得到的FA-PEG-C00H的羧基，將活化后的 FA-PEG-C00H加入到步驟（2)中得到的納米纖維膜中，搖床反應3-5天，得到葉酸功能化修 飾的納米纖維，加入三乙胺和乙酸酐進行乙?；幚?，洗滌，干燥，即得葉酸功能化納米纖 維。
[0015] 所述步驟（1)中PVA的重均分子量^為88000,PEI的重均分子量M"為25000。
[0016] 所述步驟（1)中紡絲液中PVA的濃度為12wt%。
[0017] 所述步驟（1)中靜電紡絲技術的參數(shù)為：電壓為18. 6kv，流速設置為0.3ml/h，紡 絲距離設置為25cm，環(huán)境濕度為40-50%。
[0018] 所述步驟（2)中得到的交聯(lián)后納米纖維的表面顏色由交聯(lián)前的白色變?yōu)樽厣?br>[0019] 所述步驟⑶中NH2-PEG-C00H的^為2000。
[0020]所述步驟⑶中投料摩爾比為 FA:EDC? HC1:NHS:NH2_PEG-C00H=2. 5:2:2:1。
[0021] 所述步驟⑷中投料摩爾比為FA-PEG-COOH:EDC?HC1:NHS= 1:5:5。
[0022] 所述步驟⑷中乙酰化的條件為三乙胺和乙酸酐的摩爾量均為5倍于PEI的表面 氨基的摩爾量，反應時間為1天。
[0023] 所述步驟（4)中得到葉酸功能化納米纖維應用于表面高葉酸受體表達的癌細胞 的特異性捕獲。
[0024] 本發(fā)明中FA-PEG-COOH的制備過程：
[0025]NH2-PEG-COOH的]\^為2000;FA的分子量為 441. 4;EDC.HC1 的分子量為 191. 7;NHS 的分子量為 115. 09。稱取NH2-PEG-COOH79. 42mg，溶于 7ml的DMSO中。稱取FA43. 82mg， 溶于5mlDMSO中。EDOHC1和NHS分別為15. 22mg和9. 14mg各溶于lmlDMSO中。用 EDC*HC1和NHS活化FA羧基3小時后，加入到NH2-PEG-COOH中，在磁力攪拌器上混合反應 3天。
[0026] 反應結束后，將反應液放入截留分子量為1000的透析袋中，用夾子夾緊，在純水 中透析3天，讓未反應的小分子透出，盡可能地提高整個體系的純度。透析完成后，把反應 液轉移到50ml的離心管中，放入-80°C冰箱1小時，使其冷凍結冰。把冷凍好的樣品，快速 取出，放入凍干機中，凍干3天后，就可以得到粉末狀的FA-PEG-COOH。
[0027] 本發(fā)明以靶向分子葉酸功能化納米纖維為基質，通過培養(yǎng)葉酸受體高表達人腦膠 質瘤細胞（U87MG)和葉酸受體低表達小鼠成纖維細胞（L929)探宄其特異性捕獲癌細胞的 效果。
[0028] 本發(fā)明通過核磁共振（NMR)對FA-PEG-COOH的結合效率進行了表征。借助掃描電 鏡（SEM)對戊二醛交聯(lián)前后的納米纖維和靶向分子修飾后的纖維形貌進行表征，利用傅里 葉變換-紅外光譜（FTIR)對其結構進行表