本發(fā)明屬于光學(xué)超分辨顯微領(lǐng)域，特別涉及一種STED超分辨顯微技術(shù)中損耗光斑的高質(zhì)量光學(xué)重建方法，以實(shí)現(xiàn)厚生物組織樣本或者其他散射介質(zhì)條件下的超分辨顯微成像。
背景技術(shù)：
：超分辨顯微技術(shù)的誕生從原理上打破了原有光學(xué)遠(yuǎn)場(chǎng)衍射極限對(duì)光學(xué)系統(tǒng)極限分辨率的限制，能夠觀察到分子尺度的細(xì)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了分辨率達(dá)幾十納米的細(xì)胞成像。受激發(fā)射損耗顯微成像技術(shù)STED由StefanHell教授發(fā)明的，一種通過(guò)焦點(diǎn)調(diào)制從而獲得超分辨成像的方法，因而獲得2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。根據(jù)受激輻射淬滅消光能力、損耗光光強(qiáng)存在著非線性關(guān)系，利用受激福射選擇性消耗邊緣區(qū)域內(nèi)的激發(fā)態(tài)焚光分子，抑制其發(fā)光，從而壓縮的大小。光學(xué)顯微成像技術(shù)為生物醫(yī)學(xué)帶來(lái)了里程碑式的進(jìn)步。然而生物組織不是成像的理想結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈児鈱W(xué)性質(zhì)的不均勻性嚴(yán)重地影響了成像質(zhì)量。當(dāng)光線經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)和樣本時(shí)，理想的平面波前或球面波前將會(huì)引入扭曲的畸變，理想路徑的任何偏離都會(huì)導(dǎo)致光學(xué)畸變。光在傳播過(guò)程中發(fā)生的畸變，會(huì)降低信噪比與分辨率，使成像質(zhì)量降低。而且隨著成像深度的增加，分辨率迅速惡化。這些問(wèn)題一直困擾著光學(xué)工作者。深層的高分辨率成像技術(shù)已經(jīng)成為21世紀(jì)發(fā)展的最迅速和熱門的科學(xué)技術(shù)。自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)最早被用于天體物理。當(dāng)用望遠(yuǎn)鏡觀察遙遠(yuǎn)的天體時(shí)，大氣湍流會(huì)造成光學(xué)畸變，影響成像質(zhì)量。應(yīng)用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)的望遠(yuǎn)鏡可以很好地解決這個(gè)問(wèn)題。利用波前傳感器可以實(shí)時(shí)對(duì)畸變的波前進(jìn)行探測(cè)，然后通過(guò)變形鏡、空間光調(diào)制器等光學(xué)校正系統(tǒng)對(duì)畸變進(jìn)行補(bǔ)償。最終能夠很好地對(duì)天體進(jìn)行觀測(cè)?，F(xiàn)在自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)逐步應(yīng)用于超分辨顯微成像，以校正生物樣品深層成像時(shí)的光學(xué)畸變。受到像差和散射的影響，傳統(tǒng)STED顯微技術(shù)中，如何對(duì)樣品內(nèi)部深層成像時(shí)保持超分辨已經(jīng)成為一個(gè)難題。利用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)來(lái)糾正較厚生物組織樣品成像時(shí)出現(xiàn)的光學(xué)畸變現(xiàn)象可以極大改善組織成像質(zhì)量。因此研究將自適應(yīng)方法運(yùn)用于受激輻射淬滅(STED)顯微技術(shù)中損耗光斑由散射帶來(lái)的形狀變化及位置變化，并在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證該技術(shù)的可行性與可靠性就顯得尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決
背景技術(shù)：
中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種STED超分辨顯微技術(shù)中損耗光斑的高質(zhì)量重建方法，以實(shí)現(xiàn)厚生物組織樣本或者散射介質(zhì)條件下的超分辨光學(xué)顯微成像。本發(fā)明應(yīng)用于有一定尺寸大小的損耗空心光斑，在大深度條件下得到完整而良好的損耗光斑，可用于在活體、大深度條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)損耗光斑由散射帶來(lái)的形狀變化及位置變化的校正。本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟：1)不加載樣品時(shí)，光束先經(jīng)過(guò)均一相位的空間光調(diào)制器透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡聚焦，在焦平面位置得到理想損耗光斑；2)加載樣品時(shí)，光束先經(jīng)過(guò)均一相位的空間光調(diào)制器透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡聚焦，在位于散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面位置處得到畸變損耗光斑；3)光束經(jīng)過(guò)加載相位的空間光調(diào)制器透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡聚焦，在位于散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面位置處得到需校正損耗光斑，將需校正損耗光斑與步驟1)的理想損耗光斑進(jìn)行互相關(guān)計(jì)算和處理；4)重復(fù)步驟3)將光束經(jīng)過(guò)不同加載相位的空間光調(diào)制器進(jìn)行多次處理，完成校正重建。所述步驟4)具體是指：4.1)將空間光調(diào)制器的像素點(diǎn)以n×n方式均勻分區(qū)，如12×12，每個(gè)分區(qū)包含i×i個(gè)像素點(diǎn)。光束經(jīng)過(guò)針對(duì)分區(qū)相位調(diào)制后的空間光調(diào)制器透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡聚焦，在位于散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面位置處得到需校正損耗光斑；4.2)將得到的需校正損耗光斑與理想損耗光斑進(jìn)行互相關(guān)計(jì)算，得到m個(gè)相關(guān)系數(shù)，如m＝100；4.3)記錄相關(guān)系數(shù)最大時(shí)分區(qū)的相位值，并以該相位值固定賦予到所對(duì)應(yīng)分區(qū)上；4.4)空間光調(diào)制器從第一個(gè)分區(qū)開(kāi)始到最后一個(gè)分區(qū)重復(fù)上述步驟，每個(gè)分區(qū)依次進(jìn)行相位變化，完成多次，獲得最終校正后的光斑，實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量重建。所述步驟4.1)中空間光調(diào)制器是采用以下方式調(diào)制：將一分區(qū)內(nèi)所有像素點(diǎn)從2π/m到2π進(jìn)行相位值的依次間隔變化，變化間隔為2π/m，其他分區(qū)的相位保持不變，每個(gè)相位值下進(jìn)行一次，從而獲得一組需校正損耗光斑。所述的散射介質(zhì)采用活體生物組織、離體生物組織、毛玻璃和帶非熒光小球的瓊脂。本發(fā)明的工作原理如下：本發(fā)明對(duì)STED超分辨顯微技術(shù)中損耗光斑進(jìn)行高質(zhì)量重建，通過(guò)理想損耗光斑與需校正損耗光斑進(jìn)行互相關(guān)計(jì)算，利用兩幅圖互相關(guān)系數(shù)最大作為調(diào)制信號(hào)，調(diào)整空間光調(diào)制器相位，使得需校正損耗光斑與理想損耗光斑擬合。并進(jìn)行多次迭代優(yōu)化，達(dá)到損耗光斑的最佳高質(zhì)量重建效果。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能重建有一定尺寸大小的損耗空心光斑，能夠在大深度下得到完整而良好的損耗光斑，擴(kuò)展了受激輻射淬滅(STED)顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍，提高系統(tǒng)的分辨率與信噪比，優(yōu)化成像質(zhì)量。本發(fā)明高質(zhì)量的成像指的是經(jīng)過(guò)校正的空心光斑與理想空心光斑的互相關(guān)系數(shù)和畸變空心光斑與理想空心光斑的互相關(guān)系數(shù)相比得到了提升，從而提高了系統(tǒng)的分辨率與信噪比，優(yōu)化了成像質(zhì)量。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明方法的示意圖；圖2為理想損耗光斑圖；圖3為經(jīng)過(guò)散射介質(zhì)的畸變損耗光斑圖；圖4為空間光調(diào)制器n×n均勻分區(qū)方式示意圖；圖5為經(jīng)過(guò)第一次校正的損耗光斑圖；圖6為經(jīng)過(guò)第二次校正的損耗光斑圖；圖7為經(jīng)過(guò)第三次校正的損耗光斑圖；表1為n＝12，m＝100情況下第一次校正第66個(gè)分區(qū)加載不同相位時(shí)得到的互相關(guān)系數(shù)；表2為未進(jìn)行矯正與第1.2.3次校正完成后的空心光斑與理想空心光斑的互相關(guān)系數(shù)。圖中：空間光調(diào)制器1、2π渦旋相位板2、物鏡3、散射介質(zhì)4和物鏡焦平面5。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例如下：如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施采用的光路系統(tǒng)包括空間光調(diào)制器1、2π渦旋相位板2、物鏡3、散射介質(zhì)4和物鏡焦平面5，空間光調(diào)制器1、2π渦旋相位板2和物鏡3同軸依次布置，物鏡焦平面5位于散射介質(zhì)4內(nèi)部，散射介質(zhì)為鼠腦。具體步驟如下：(1)不加載樣品時(shí)，光束先經(jīng)過(guò)均一相位的空間光調(diào)制器1透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板2透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡3聚焦，在焦平面位置5得到理想損耗光斑，如圖2所示；(2)加載樣品時(shí)，光束先經(jīng)過(guò)均一相位的空間光調(diào)制器1透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板2透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡3聚焦，在位于散射介質(zhì)鼠腦4內(nèi)部的焦平面位置5處得到畸變損耗光斑，如圖3所示；(3)將空間光調(diào)制器1進(jìn)行分區(qū)，如圖4所示，第一個(gè)分區(qū)的變化范圍為2π/m～2π，變化間隔為2π/m，其他分區(qū)相位保持不變；光束先經(jīng)過(guò)加載相位的空間光調(diào)制器1透射，再經(jīng)過(guò)2π渦旋相位板2透射，然后經(jīng)過(guò)物鏡3聚焦，在位于散射介質(zhì)4內(nèi)部的焦平面位置5處得到需校正損耗光斑；(4)將理想損耗光斑與需校正損耗光斑進(jìn)行互相關(guān)計(jì)算，得到m個(gè)相關(guān)系數(shù)；(5)記錄相關(guān)系數(shù)最大時(shí)第一個(gè)分區(qū)的相位值，并將該相位值固定；(6)第一個(gè)分區(qū)固定相位值后，剩余每個(gè)分區(qū)依次按照步驟(3)的方式進(jìn)行相位變化，每次處理時(shí)其他固定的相位值保持不變，然后重復(fù)步驟(4)和(5)完成一次校正；n＝12，m＝100情況下第一次校正第66個(gè)分區(qū)加載不同相位時(shí)得到的互相關(guān)系數(shù)如表1所示；第一次校正結(jié)果如圖5所示，圖中可見(jiàn)損耗光斑開(kāi)始重建；表1實(shí)施例第一次校正第66個(gè)分區(qū)加載不同相位時(shí)得到的互相關(guān)系數(shù)相位值互相關(guān)系數(shù)相位值互相關(guān)系數(shù)相位值互相關(guān)系數(shù)1*2π/1000.762041*2π/1000.761881*2π/1000.76142*2π/1000.762042*2π/1000.761882*2π/1000.76143*2π/1000.762043*2π/1000.761883*2π/1000.76144*2π/1000.762044*2π/1000.761884*2π/1000.76145*2π/1000.762045*2π/1000.761885*2π/1000.76146*2π/1000.762046*2π/1000.761886*2π/1000.76137*2π/1000.762047*2π/1000.761887*2π/1000.76138*2π/1000.762048*2π/1000.761888*2π/1000.76139*2π/1000.761949*2π/1000.761889*2π/1000.761310*2π/1000.761950*2π/1000.761890*2π/1000.761411*2π/1000.761951*2π/1000.761891*2π/1000.761412*2π/1000.761952*2π/1000.761892*2π/1000.761513*2π/1000.761953*2π/1000.761893*2π/1000.761714*2π/1000.761954*2π/1000.761894*2π/1000.761915*2π/1000.761955*2π/1000.761895*2π/1000.762416*2π/1000.761956*2π/1000.761896*2π/1000.763317*2π/1000.761957*2π/1000.761797*2π/1000.765018*2π/1000.761958*2π/1000.761798*2π/1000.768419*2π/1000.761959*2π/1000.761799*2π/1000.775320*2π/1000.761960*2π/1000.76172π0.762221*2π/1000.761961*2π/1000.761722*2π/1000.761962*2π/1000.761723*2π/1000.761963*2π/1000.761724*2π/1000.761964*2π/1000.761725*2π/1000.761965*2π/1000.761726*2π/1000.761966*2π/1000.761727*2π/1000.761967*2π/1000.761628*2π/1000.761968*2π/1000.761629*2π/1000.761969*2π/1000.761630*2π/1000.761970*2π/1000.761631*2π/1000.761971*2π/1000.761632*2π/1000.761972*2π/1000.761633*2π/1000.761973*2π/1000.761634*2π/1000.761974*2π/1000.761635*2π/1000.761975*2π/1000.761536*2π/1000.761976*2π/1000.761537*2π/1000.761977*2π/1000.761538*2π/1000.761978*2π/1000.761539*2π/1000.761979*2π/1000.761540*2π/1000.761880*2π/1000.7615(8)重復(fù)步驟(3)-(7)，進(jìn)行第二次校正，結(jié)果如圖6所示，圖中可見(jiàn)損耗光斑形狀位置大致復(fù)原，呈圓環(huán)狀；再重復(fù)步驟(3)-(7)，進(jìn)行第三次校正，結(jié)果如圖7所示，圖中可見(jiàn)損耗光斑進(jìn)一步復(fù)原，中心圓環(huán)形狀位置進(jìn)一步優(yōu)化。隨著校正次數(shù)的增加，需校正損耗光斑與理想損耗光斑的擬合程度越來(lái)越高，使系統(tǒng)達(dá)到最佳高質(zhì)量的重建，具體互相關(guān)系數(shù)可見(jiàn)表2。表2實(shí)施例空心光斑與理想空心光斑的互相關(guān)系數(shù)互相關(guān)系數(shù)畸變空心光斑與理想空心光斑0.6277第一次校正空心光斑與理想空心光斑0.8661第二次校正空心光斑與理想空心光斑0.9324第三次校正空心光斑與理想空心光斑0.9482由此可見(jiàn)，本發(fā)明能重建有一定尺寸大小的損耗空心光斑，能夠在大深度下得到完整而良好的損耗光斑，擴(kuò)展了受激輻射淬滅(STED)顯微技術(shù)的應(yīng)用范圍，提高系統(tǒng)的分辨率與信噪比，具有高質(zhì)量的成像。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3