專(zhuān)利名稱(chēng)：：絲蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及絲蛋白，以及編碼此類(lèi)蛋白的核酸。本發(fā)明也涉及合成絲蛋白的重組細(xì)胞和/或有機(jī)體。本發(fā)明的絲蛋白可有多種用途，如用于生產(chǎn)個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、塑料制品、紡織品和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：絲是表現(xiàn)出特別強(qiáng)度和韌性的纖維狀蛋白質(zhì)分泌物，因此是廣泛研究的對(duì)象。超過(guò)30,000種蜘蛛和許多昆蟲(chóng)產(chǎn)絲。其中很少得到性質(zhì)描述，而大部分研究集中在家蠶(Sow^x的繭絲和織網(wǎng)蜘蛛棒絡(luò)新婦蛛(iV印/n7flc/"w》m)的拖絲上。在鱗翅目和蜘蛛中，絲心蛋白基因編碼的蛋白一般很大，在兩個(gè)末端都有顯著的親水末端結(jié)構(gòu)域，其間跨過(guò)疏水塊和親水塊交替出現(xiàn)的大范圍的區(qū)域(Bini等人，2004)。這些蛋白一般包括與e折疊、P螺旋((3-spirals)、a螺旋和無(wú)定形區(qū)松散關(guān)聯(lián)的e折疊層的晶列(crystallinearrays)的不同組合(見(jiàn)Craig和Riekel，2002年綜述)。由于絲纖維代表了一些己知最強(qiáng)的自然纖維，人們對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究，以期能重現(xiàn)其合成過(guò)程。然而，由于絲基因中存在重復(fù)核苷酸基序(motifs),它們會(huì)導(dǎo)致有害重組事件發(fā)生，而且絲基因很大，基因中每個(gè)氨基酸使用少數(shù)密碼子導(dǎo)致宿主細(xì)胞tRNA庫(kù)耗盡，上述因素的組合使得在許多不同重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)鱗翅目和蜘蛛絲心蛋白基因時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)低表達(dá)率的問(wèn)題。重組表達(dá)會(huì)導(dǎo)致翻譯過(guò)程中的困難，如由于密碼子偏愛(ài)和密碼子需求而導(dǎo)致翻譯中止，以及由于高重組率導(dǎo)致基因截?cái)?。至今為止，較短和較少的重復(fù)序列可以避免許多與絲基因表達(dá)有關(guān)的問(wèn)題。與對(duì)鱗翅目(特別是家蠶的繭絲)和蜘蛛(特別是棒絡(luò)新婦蛛的拖絲)所積累的廣泛知識(shí)相比，人們對(duì)其它昆蟲(chóng)絲的化學(xué)組成和分子組織所知甚少。在20世紀(jì)60年代早期，對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)唾液腺絲纖維的X射線(xiàn)衍射圖譜分析表明針尾類(lèi)膜翅目昆蟲(chóng)的絲具有a-螺旋結(jié)構(gòu)(Rudall，1962)。同時(shí)證明該絲是螺旋的，獲得的圖譜顯示了a-螺旋i連的巻曲螺旋(coiled-coil)系統(tǒng)(Atkins，1967)。來(lái)源于其它針尾類(lèi)物種包括黃蜂(wasp),^^"錄尸化/wm6oto)(Rudall，1962)和熊蜂(bumblebee),努^^蒂錄(5ow6zw/"coram)(Lucas和Rudall，1967)的繭絲顯示出相似的X射線(xiàn)衍射圖譜。與針尾類(lèi)絲中(x-螺旋結(jié)構(gòu)形成對(duì)比的是，與針尾類(lèi)相關(guān)的進(jìn)化枝上的姬蜂總科(Ichneumonoidea)的絲的特點(diǎn)是具有平行-P結(jié)構(gòu)。人們已經(jīng)對(duì)具有這種結(jié)構(gòu)的繭蜂科四例(粉蝶盤(pán)絨繭蜂，CofeH'a—^ewfeMs:」g/owerate,atew'fl(^4;7e"&fes:」go"opfcjg/j1,'jpe"fe/es//g"e〃/)禾口姬蜂禾斗三例(Diwcwfirsj9.;/Vzyto^fe,/^^p.，.Bra"c/n^/emorafc)的X射線(xiàn)衍射圖譜進(jìn)行了描述(Lucas和Rudall，1967)。此外已經(jīng)對(duì)一個(gè)繭蜂科(粉蝶盤(pán)絨繭蜂fCWe'ag/omemfe刀絲的序列進(jìn)行了描述(Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為AB188680;Yamada等人，2004)。這一部分的蛋白序列包括一個(gè)高度保守的28X-天冬酰胺重復(fù)(其中X為丙氨酸或絲氨酸)，并未預(yù)測(cè)到含有形成巻曲螺旋的七肽重復(fù)(heptadrepeats)。對(duì)繭蜂科繭絲氨基酸組成的廣泛分析表明小腹繭蜂亞科的絲具有高天冬酰胺和絲氨酸成分而與其它絲不同(Lucas等人，I960;Quicke等人，2004)。相關(guān)亞科產(chǎn)生具有顯著不同氨基酸組成的絲表明小腹繭蜂亞科在其亞科內(nèi)是特異進(jìn)化的(Yamada等人，2004)。使用根據(jù)分離繭絲蛋白內(nèi)部肽序列設(shè)計(jì)的PCR引物分離了粉蝶盤(pán)絨繭蜂的部分cDNA序列。根據(jù)這一部分序列預(yù)測(cè)的氨基酸組成和來(lái)源于該種的廣泛水洗絲(extensivelywashedsilk)氨基酸組成十分相似。其它非針尾類(lèi)細(xì)蜂亞目和其余的膜翅目昆蟲(chóng)(廣腰亞目)的絲是十分普通的平行-P折疊，葉蜂科產(chǎn)生類(lèi)膠原和多聚甘氮酸兩種絲(Lucas和Rudall，1967)。蜜蜂絲蛋白在末齡幼蟲(chóng)中期合成，可視為解聚絲蛋白的混合(Silva-Zacarin等人，2003)。隨著齡期的進(jìn)行，腺體中的水被去除，脫水導(dǎo)致絲蛋白聚合形成組織有序的絲標(biāo)記的類(lèi)晶團(tuán)聚體(SiWa-Zacarin等人，2003)。進(jìn)行性脫水導(dǎo)致類(lèi)晶團(tuán)聚體進(jìn)一歩重組織(Silva-Zacarin等人，2003)并可能在絲間形成新的絲間結(jié)合(Rudall,1962)。從蜜蜂絲腺分離的原纖維電鏡圖片顯示直徑約20-25埃的結(jié)構(gòu)(Flower和Kenchington，1967)。這一數(shù)值與3-、4-、5-股巻曲螺旋(coiledcoil)一致。Lucas和Rudall確定了不同針尾類(lèi)膜翅目種的絲的氨基酸組成(1967)，發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典絲心蛋白相比其包括高含量的丙氨酸、絲氨酸、酸性殘基、天冬氨酸、谷氨酸，以及低含量的甘氨酸。針尾類(lèi)膜翅目昆蟲(chóng)的絲的螺旋結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是由于低甘氨酸含量和高酸性殘基含量的結(jié)果(Rudall和Kenchington,1971)。人們對(duì)于草蜻蛉(lacewing，也稱(chēng)草蛉、草蛉蟲(chóng))(目脈翅目)幼蟲(chóng)的絲所知甚少。其繭包括兩層，一個(gè)內(nèi)層固體層和一個(gè)外層纖維層。以前該繭被描述為包括殼脂蛋白絲(Rudall和Kenchington,1971)，這一描述僅與內(nèi)層固體層有關(guān)。LaMunyon(1988)描述了一種構(gòu)成外層纖維的馬氏管分泌的物質(zhì)。這一層沉積之后，有大量絨毛的內(nèi)腔表皮細(xì)胞的分泌物構(gòu)成固體內(nèi)壁(LaMunyon，1988)。同樣已知的是草蜻蛉幼蟲(chóng)所有齡期都從馬氏管產(chǎn)生蛋白質(zhì)粘性物質(zhì)將幼蟲(chóng)粘到基質(zhì)上，將偽裝物粘到背上或使獵物陷入(Speilger，1962)。Zomam^a6BwtoAi&eJ屬的幼蟲(chóng)同時(shí)產(chǎn)生絲和粘性物質(zhì)，人們推定這它們很可能是相同物質(zhì)(Speilger，1962)。該粘性分泌物是高度可溶的，也被認(rèn)為與抵抗捕食者的防衛(wèi)有關(guān)(LaMunyon&Adams，1987)?？紤]到諸如膜翅目和脈翅目昆蟲(chóng)所產(chǎn)生絲的獨(dú)特屬性，有必要從這些生物中鑒定新的編碼絲蛋白的氨基酸。發(fā)明概述本發(fā)明已從昆蟲(chóng)中鑒定出數(shù)目眾多的絲蛋白。這些絲蛋白與其它已知絲蛋白在一級(jí)序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或氨基酸含量方面有驚人的差異。因此，本發(fā)明第一方面提供一種基本上純化的和/或重組的絲多肽，其中至少該絲多肽的一部分具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)己知多肽的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)具有特征性七肽重復(fù)序列，以共有序列(ak^e/g^"表示，其中"和t/位一般為疏水殘基，其余位置一般為極性殘基。令人吃驚的是，本發(fā)明多肽的七肽總體看來(lái)具有新穎的組成——在疏水七肽位置"和d位異乎尋常地富含丙氨酸。此外，在這些位置含有高水平的小的極性殘基。更進(jìn)一步而言，e位也有高水平的丙氨酸和小的疏水殘基。相應(yīng)地，在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列"k^e/g，并且至少25%的a和d位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列ak"A/g，并且至少25%的"、t/和e位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列Wafe/g，并且至少25%的"位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列ak^e/g，并且至少25%的d位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列Wafe/g，并且至少25%的e位氨基酸是丙氨酸殘基。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的至少I(mǎi)O拷貝的七肽序列是連續(xù)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少5拷貝的七肽序列Wafe/g，并且至少15%的a和i/位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少5拷貝的七肽序列ak:tfe/g，并且至少15%的"、d和e位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少5拷貝的七肽序列WcA/g，并且至少15%的"氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少5拷貝的七肽序列Wc血/g，并且至少15%的d位氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少5拷貝的七肽序列Wctfe/g，并且至少15%的e位氨基酸是丙氨酸殘基。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的至少5拷貝的七肽序列是連續(xù)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多肽包括選自下述的序列-i)SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:56以及SEQIDNO:57所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:56以及SEQIDNO:57中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多肽包括選自下述的序列i)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:58以及SEQIDNO:59所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:58以及SEQIDNO:59中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多肽包括選自下述的序列i)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:60以及SEQIDNO:61所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:60以及SEQIDNO:61中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多肽包括選自下述的序列i)SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:62以及SEQIDNO:63所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:62以及SEQIDNO:63中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多肽包括選自下述的序列i)SEQIDNO:72或SEQIDNO:73所提供的氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:72和/或SEQIDNO:73具有至少30%同源性的氨基酸序11列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。與本發(fā)明第一方面有關(guān)的更多絲蛋白已得到鑒定。這些蛋白其中之一(SEQIDNO:IO)被PR0Fsec預(yù)測(cè)為含有4P/。的a螺旋、8%的(3折疊和50%的環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而被歸入混合結(jié)構(gòu)蛋白一類(lèi)。對(duì)該蛋白的MARCOIL分析僅預(yù)測(cè)出一個(gè)短的七肽重復(fù)區(qū)，這是具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)蛋白的特征性結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，本發(fā)明第二方面提供一種基本上純化的和/或重組的絲多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO以及SEQIDNO:30所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO以及SEQIDNO:30具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。若不被理論所限，似乎第一方面的四種蛋白質(zhì)的螺旋軸相互平行地纏繞形成束，這些束沿軸向延長(zhǎng)形成原纖維。此外，據(jù)預(yù)測(cè)至少在象蜜蜂和熊蜂這樣的物種中，第二方面的蛋白起"膠"的作用，輔助將許多第一方面的巻曲螺旋蛋白束粘合在一起形成纖維蛋白復(fù)合體。然而，即使沒(méi)有第二方面的多肽，仍然可以形成絲纖維和共聚物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽可從膜翅目或脈翅目昆蟲(chóng)的物種中純化獲得，或是純化獲得的多肽的突變體。優(yōu)選地，膜翅目昆蟲(chóng)的物種為意大利蜂"p/s艦〃i/fem)、黃猄蟲(chóng)義(Oeco/7/^〃a駕aragti/朋)、牛頭犬蟲(chóng)義(Afy削ec/"》"'c"to)或授粉熊蜂(BowZ^few欲/5)。優(yōu)選地，脈翅目昆蟲(chóng)的物種為瑪草蛉(M〃atfa另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明多肽與至少一種其他多肽融合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的至少一種其他多肽選自提高本發(fā)明多肽穩(wěn)定性的多肽、輔助所述的融合蛋白純化的多肽或輔助本發(fā)明的多肽從細(xì)胞中分泌的多肽(例如從植物細(xì)胞中分泌)。另一方面，本發(fā)明提供編碼絲多肽的分離的和/或外源多核苷酸，其中該絲多肽至少一部分具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多核苷酸包括選自下述的序列-i)SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:64以及SEQIDNO:65所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:64以及SEQIDNO:65中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDN0:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:66以及SEQIDNO:67所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:66以及SEQIDNO:67中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:68以及SEQIDNO:69所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:68以及SEQIDNO:69中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到m)中任何一條雜交的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71以及SEQIDNO:76所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71以及SEQIDNO:76中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:74或SEQIDNO:75所提供的核苷酸序列；ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:74和/或SEQIDNO:75具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。另一方面，本發(fā)明提供分離的和/或外源多核苷酸，該多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDN0:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21以及SEQIDNO:39所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21以及SEQIDNO:39中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸可從膜翅目或脈翅目昆蟲(chóng)的物種中分離獲得，或是分離獲得的多核苷酸的突變體。優(yōu)選地，膜翅目昆蟲(chóng)的物種為意大禾U蜂(Jf、we//z/era)、黃猄蟲(chóng)義(6>ecop/z_y〃"5W<3rag<i/"")、牛頭犬蟲(chóng)義(踏rwec/a/on'cata)或授粉熊蜂(Bow&iw/erresfr/s)。優(yōu)選地，脈翅目昆蟲(chóng)的物種為瑪草蛉(Mx〃"6as/gato)。另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多核苷酸的載體。優(yōu)選地，該載體為表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多核苷酸和/或至少一種本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可為任何類(lèi)型的細(xì)胞，其例子包括但不限于細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞。本發(fā)明也提供制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，或本發(fā)明的載體，以及回收所表達(dá)的多肽?？上攵D(zhuǎn)基因植物在生產(chǎn)本發(fā)明多肽中特別有用。因此，另一方面，本發(fā)明提供包括包括外源多核苷酸，編碼至少一種本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)基因植物。另一方面，本發(fā)明提供包括外源多核苷酸，編碼至少一種本發(fā)明的多肽的非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多肽的絲纖維。優(yōu)選地，該多肽是一種重組多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少一些所述的多肽是交聯(lián)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少所述的多肽的一些賴(lài)氨酸殘基是交聯(lián)的。另一方面，本發(fā)明提供包括至少兩種本發(fā)明多肽的共聚物。優(yōu)選地，所述的多肽是重組多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的共聚物包括至少四種不同的第一方面的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的共聚物進(jìn)一步包括一種第二方面的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少一些所述的多肽是交聯(lián)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少所述的多肽的一些賴(lài)氨酸殘基是交聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解本發(fā)明多肽具有如所屬領(lǐng)域其它類(lèi)型絲蛋白一樣具有廣泛的己知的用途。因此，另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多肽，本發(fā)明絲纖維和/或本發(fā)明共聚物的產(chǎn)品。產(chǎn)品的例子包括但不限于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、紡織品、塑料制品和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多肽、本發(fā)明絲纖維和/或本發(fā)明共聚物，以及一種或一種以上可接受的載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的組合物進(jìn)一歩包括藥物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的組合物用作藥物、或者在醫(yī)療器械或化妝品中使用。另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多核苷酸，以及一種或一種以上可接受的載體的組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物、絲纖維、共聚物和/或產(chǎn)品不包括昆蟲(chóng)產(chǎn)生的王漿蛋白。另一方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防疾病的方法，該方法包括給予包括治療或預(yù)防該疾病的藥物和藥用載體的組合物，其中藥用載體選自至少一種本發(fā)明多肽、本發(fā)明絲纖維和/或本發(fā)明共聚物。另一方面，本發(fā)明提供至少一種本發(fā)明多肽、本發(fā)明絲纖維和/或本發(fā)明共聚物，以及藥物，在制備治療或預(yù)防疾病的藥物中的用途。另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種本發(fā)明多肽、至少一種本發(fā)明多核苷酸、至少一種本發(fā)明載體、至少一種本發(fā)明絲纖維和/或本發(fā)明共聚物的試劑盒。優(yōu)選地，所述的試劑盒進(jìn)一步包括使用該試劑盒的信息和/或說(shuō)明。很明顯，本發(fā)明一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特性也可用于本發(fā)明其他許多方面。整個(gè)說(shuō)明書(shū)中所用的詞語(yǔ)"包括(comprise)"或其變體"包括(comprises)"或"包括(comprising)",應(yīng)理解為是指含有所述的成分、整體或歩驟，或成分、整體或歩驟組成的組，但不排除任何其他成分、整體或歩驟，或成分、整體或步驟組成的組。下文中本發(fā)明通過(guò)下述非限定實(shí)施例并對(duì)附圖附有參考的方式進(jìn)行描述。圖l.下列絲的酰胺I區(qū)和II區(qū)的傅立葉變換紅外光譜1)蜜蜂絲，2)熊蜂絲，3)牛頭犬蟻(bulldogant)絲，4)織工蟻(weaverant)絲，5)草蜻蛉(lacewing)幼蟲(chóng)絲。上述所有的絲都具有光譜預(yù)期的螺旋蛋白。膜翅目昆蟲(chóng)的絲(螞蟻和蜜蜂)在1645-1646cm"具有光譜最大值(標(biāo)記的)，比典型a螺旋低，移動(dòng)10cm—1并變寬，這是典型的巻曲螺旋蛋白的特征(Heimburg等人，1999)。圖2.SDS洗滌過(guò)的蜜蜂巢房(broodcomb)絲氨基酸組成與Xenospira蛋白(即，Xenospira1、Xenospira2、Xenospira3、Xenospira4)(等摩爾數(shù)總計(jì)65%)及Xenosin氨基酸(35%)組成的比較。圖3.絲氨基酸組成與絲基因編碼蛋白預(yù)測(cè)的氨基酸組成的比較。圖4.蜜蜂絲蛋白巻曲螺旋區(qū)的預(yù)測(cè)。COILS是將一個(gè)序列與已知平行雙股巻曲螺旋數(shù)據(jù)庫(kù)比較的程序，并取得相似性得分。通過(guò)將該得分與球形和巻曲螺旋蛋白得分的分布相比較，程序計(jì)算該序列采取巻曲螺旋構(gòu)象的概率，如Lupas等人所述(1991)。使用窗口大小28，本程序預(yù)測(cè)下列每個(gè)蛋白的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域中存在下述殘基數(shù)目Xenospira3:77;Xenospira4:35;Xenospira1:28;Xenospira2:80。圖5.蜜蜂絲蛋白比對(duì)顯示形成巻曲螺旋的主要七肽的MARCOIL預(yù)測(cè)結(jié)果。七肽序列顯示在氨基酸上面，"位和d位的丙氨酸殘基突出顯示。圖6.Marciol預(yù)測(cè)的膜翅目昆蟲(chóng)(蜜蜂和螞蟻)絲蛋白巻曲螺旋區(qū)比對(duì)顯示七肽位置分配。Amd，蜜蜂；BB，熊蜂；BA，牛頭犬蟻；WA，織工蚊；Fl-4，絲心蛋白1-4。七肽序列顯示在氨基酸上面，"位、d位和e位的丙氨酸殘基突出顯示。圖7.瑪草蛉(MW/"cfow'gw"to)幼蟲(chóng)絲蛋白和膜翅目昆蟲(chóng)絲蛋白直系同源簇(orthologousclusters)的預(yù)測(cè)的巻曲螺旋區(qū)中七肽位置的氨基酸特征。圖8.晚末齡幼蟲(chóng)唾液腺蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在胰蛋白酶切后分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)組對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。通過(guò)安捷倫公司SpectmmMill軟件將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與從cDNA序列確定蛋白的預(yù)測(cè)蛋白序列相匹配，從而得到質(zhì)譜分析結(jié)果。該軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到的肽片段數(shù)據(jù)組與根據(jù)已有數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白序列產(chǎn)生的可能的預(yù)測(cè)片段之間的每個(gè)匹配的質(zhì)量給出得分。此處顯示的所有序列匹配的SpectrumMill軟件得分都大于20，而20的得分足以自動(dòng)的有把握的認(rèn)定一個(gè)有效的匹配。圖9.絲蛋白巻曲螺旋區(qū)簡(jiǎn)約性分析。四個(gè)巻曲螺旋蛋白的相關(guān)性暗示該基因在真針尾類(lèi)(Euaculeata)分化之前從共同的祖先進(jìn)化而來(lái)。虛線(xiàn)包圍的區(qū)域顯示在侏羅紀(jì)晚期螞蟻和蜜蜂(胡蜂總科)從蜜蜂(蜜蜂總科)分化之前所出現(xiàn)的變異(155myrs(百萬(wàn)年);Grimaldi和Engel,2005)。圖中給出了做1000次重復(fù)抽樣(iterations)之后，每個(gè)分支的自信自展值(bootstrapvalues)。圖10.A)對(duì)蜜蜂絲胰蛋白酶切產(chǎn)生的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定蜜蜂絲蛋白。陰影表示質(zhì)譜分析鑒定的肽。此處顯示的所有序列匹配的SpectrumMill軟件得分都大于20，而20的得分足以自動(dòng)的有把握的認(rèn)定一個(gè)有效的匹配。B)熊蜂、牛頭犬蟻、織工蟻和草蜻蛉絲蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列。圖11.編碼蜜蜂、熊蜂、牛頭犬蟻、織工蟻和草蜻蛉絲蛋白的開(kāi)放讀碼框(Openreadingframes)。圖12.編碼Xenosin的基因序列。提供了完整編碼序列，其中插入了一個(gè)內(nèi)含子(突出顯示處)。圖13.絲蛋白在煙草中的表達(dá)。對(duì)下列來(lái)源的蛋白進(jìn)行蛋白印跡分析(westernblotanalysis),檢測(cè)帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白1.空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(￡.co//)，2.包括AmelF4(Xenospira4)編碼區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(￡.co//)，3.空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的煙草，4.包括AmelF4編碼區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的煙草。圖14.重組蜜蜂絲蛋白制成的纖維表現(xiàn)出雙折射線(xiàn)。生物折射表明線(xiàn)中存在結(jié)構(gòu)。A-D每組顯示了不同的重組蜜蜂的線(xiàn)，E組中顯示了重組的草蜻蛉的線(xiàn)。序列表索引SEQIDNO:l-此處稱(chēng)為Xenospiral的蜜蜂絲蛋白(也稱(chēng)為AmelFl)(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:2-此處稱(chēng)為Xenospiral的蜜蜂絲蛋白。SEQIDNO:3-此處稱(chēng)為Xenospira2的蜜蜂絲蛋白(也稱(chēng)為AmelF2)(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:4-此處稱(chēng)為Xenospira2的蜜蜂絲蛋白。SEQIDNO:5-此處稱(chēng)為Xenospira3的蜜蜂絲蛋白(也稱(chēng)為AmelF3)(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:6-此處稱(chēng)為Xenospira3的蜜蜂絲蛋白。SEQIDNO:7-此處稱(chēng)為Xenospira4的蜜蜂絲蛋白(也稱(chēng)為AmelF4)(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:8-此處稱(chēng)為Xenospira4的蜜蜂絲蛋白。SEQIDNO:9-此處稱(chēng)為Xenosin的蜜蜂絲蛋白(也稱(chēng)為AmelSAl)(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:IO-此處稱(chēng)為Xenosin的蜜蜂絲蛋白。SEQIDNO:ll-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospiral的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:12-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospiral的核苷酸序列。SEQIDNO:13-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:14-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira2的核苷酸序列。SEQIDNO:15-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospim3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:16-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira3的核苷酸序列。SEQIDNO.17-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:18-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira4的核苷酸序列。SEQIDNO:19-編碼蜜蜂絲蛋白Xenosin的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:20-編碼蜜蜂絲蛋白Xenosin的核苷酸序列。SEQIDN0:21-編碼蜜蜂絲蛋白Xenosin的基因序列。SEQIDNO:22-此處稱(chēng)為BBF1的熊蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:23-此處稱(chēng)為BBF1的熊蜂絲蛋白。SEQIDNO:24-此處稱(chēng)為BBF2的熊蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:25-此處稱(chēng)為BBF2的熊蜂絲蛋白。SEQIDNO:26-此處稱(chēng)為BBF3的熊蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:27-此處稱(chēng)為BBF3的熊蜂絲蛋白。SEQIDNO:28-此處稱(chēng)為BBF4的熊蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:29-此處稱(chēng)為BBF4的熊蜂絲蛋白。SEQIDNO:30-此處稱(chēng)為BBSA1的熊蜂絲蛋白部分氨基酸序列。SEQIDNO:31-編碼熊蜂絲蛋白BBF1的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:32-編碼熊蜂絲蛋白BBF1的核苷酸序列。SEQIDNO:33-編碼熊蜂絲蛋白BBF2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:34-編碼熊蜂絲蛋白BBF2的核苷酸序列。SEQIDNO:35-編碼熊蜂絲蛋白BBF3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:36-編碼熊蜂絲蛋白BBF3的核苷酸序列。SEQIDNO:37-編碼熊蜂絲蛋白BBF4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:38-編碼熊蜂絲蛋白BBF4的核苷酸序列。SEQIDNO:39-編碼熊蜂絲蛋白BBSA1的部分核苷酸序列。SEQIDNO:40-此處稱(chēng)為BAF1的牛頭犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:41-此處稱(chēng)為BAF1的牛頭犬蟻絲蛋白。SEQIDNO:42-此處稱(chēng)為BAF2的牛頭犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:43-此處稱(chēng)為BAF2的牛頭犬蟻絲蛋白。SEQIDNO:44-此處稱(chēng)為BAF3的牛頭犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:45-此處稱(chēng)為BAF3的牛頭犬蟻絲蛋白。SEQIDNO:46-此處稱(chēng)為BAF4的牛頭犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:47-此處稱(chēng)為BAF4的牛頭犬蟻絲蛋白。SEQIDNO:48-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF1的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:49-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF1的核苷酸序列。SEQIDNO:50-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:51-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF2的核苷酸序列。SEQIDNO:52-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:53-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF3的核苷酸序列。SEQIDNO:54-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:55-編碼牛頭犬蟻絲蛋白BAF4的核苷酸序列。SEQIDNO:56-此處稱(chēng)為GAF1的織工蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:57-此處稱(chēng)為GAF1的織工蟻絲蛋白。SEQIDNO:58-此處稱(chēng)為GAF2的織工蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:59-此處稱(chēng)為GAF2的織工蟻絲蛋白。SEQIDNO:60-此處稱(chēng)為GAF3的織工蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:61-此處稱(chēng)為GAF3的織工蟻絲蛋白。SEQIDNO:62-此處稱(chēng)為GAF4的織工蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:63-此處稱(chēng)為GAF4的織工蟻絲蛋白。SEQIDNO:64-編碼織工蟻絲蛋白GAF1的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:65-編碼織工蟻絲蛋白GAF1的核苷酸序列。SEQIDNO:66-編碼織工蟻絲蛋白GAF2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:67-編碼織工蟻絲蛋白GAF2的核苷酸序列。SEQIDNO:68-編碼織工蟻絲蛋白GAF3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:69-編碼織工蟻絲蛋白GAF3的核苷酸序列。SEQIDNO:70-編碼織工蟻絲蛋白GAF4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:71-編碼織工蟻絲蛋白GAF4的核苷酸序列。SEQIDNO:72-此處稱(chēng)為MalFl的草蜻蛉絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQIDNO:73-此處稱(chēng)為MalFl的草蜻蛉絲蛋白。SEQIDNO:74-編碼草蜻蛉絲蛋白MalFl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū))。SEQIDNO:75-編碼草蜻蛉絲蛋白MalFl的核苷酸序列。SEQIDNO:76-對(duì)密碼子為植物表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化(在亞克隆到pET14b和pVEC8之前)的編碼此處稱(chēng)為Xenospira4蜜蜂絲蛋白核苷酸序列。SEQIDNO:77-為植物表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化的蜜蜂絲蛋白(Xenospira4)開(kāi)放讀碼框(無(wú)翻譯融合)。
發(fā)明內(nèi)容普通技術(shù)和定義除非另有特別定義，此處使用的所有科技術(shù)語(yǔ)應(yīng)與本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組化、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域)普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫技術(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)操作，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有描述和解釋?zhuān)鏙.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning(實(shí)用分子克隆指南)，JohnWiley禾nSons(1984)、J.Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)、T.A.Brown(編輯)，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach(基本分子生物學(xué)實(shí)用方法)，第1和第2巻，IRLPress(1991)、D.M.Glover和B.D.Hames(編輯)，DNACloning:APracticalApproach(DNA克隆實(shí)用方法)，1-4巻，IRLPress(1995和1996)以及F.M.Ausubel等人(編輯)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案)，GreenePub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括至今所有的更新)、EdHarlow禾口DavidLane(編輯)，Antibodies:ALaboratoryManual(抗體:實(shí)驗(yàn)指南)，ColdSpringHarbourLaboratory(1988)和J.E.Coligan等人(編輯)CurrentProtocolsinImmunology(現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方案)，JohnWiley&Sons(包括至今所有的更新)，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用合并于此。此處所用的術(shù)語(yǔ)"絲蛋白"和"絲多肽"是指能用來(lái)生產(chǎn)絲纖維和/或纖維狀蛋白復(fù)合體的纖維狀蛋白質(zhì)/多肽。自然存在的絲蛋白諸如蜜蜂等昆蟲(chóng)的巢房(broodcomb)絲是本發(fā)明的一部分，然而，如此處所述，如果在合適的昆蟲(chóng)中表達(dá)，可執(zhí)行同樣功能的這些蛋白質(zhì)的變體很容易生產(chǎn)出來(lái)。此處所用的"絲纖維"是指包括本發(fā)明蛋白質(zhì)可被織成不同物品如紡織品的絲。此處所用的"共聚物"是指包括兩種或兩種以上本發(fā)明絲蛋白的組合物。該術(shù)語(yǔ)不包括自然存在的如昆蟲(chóng)巢房之類(lèi)的共聚物。術(shù)語(yǔ)"植物"包括整個(gè)植物、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)(例如葉、莖)、根、花器官/結(jié)構(gòu)、種子(包括胚、胚乳和種皮)、植物組織(例如維管組織、基本組織之類(lèi))、細(xì)胞以及同類(lèi)的子代。"轉(zhuǎn)基因植物"是指包括未在同種、變種或栽培品種的野生型植物中發(fā)現(xiàn)的基因構(gòu)建物("轉(zhuǎn)基因")的植物。此處所指"轉(zhuǎn)基因"與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
正常的意思相同，包括通過(guò)重組DNA或RNA技術(shù)產(chǎn)生的或改變的基因序列，并被引入植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因可包括從植物細(xì)胞中獲得的序列。典型地，該轉(zhuǎn)基因通過(guò)諸如轉(zhuǎn)化之類(lèi)的人工操作引入植物中，但是該操作可以是任何所屬領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的方法。"多核苷酸"是指寡核苷酸、核酸分子或其任何片段?？梢允腔蚪M來(lái)源或合成的DNA或RNA，可以是雙鏈或單鏈的，可以結(jié)合糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或其他材料來(lái)行使此處限定的特定功能。此處所用的"可操作的連接"是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的核酸(例如DNA)片段之間的功能關(guān)系。典型地，是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件對(duì)所轉(zhuǎn)錄的序列之間的功能關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中促進(jìn)或調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與編碼序列之間是可操作的連接，該編碼序列可以是如此處所限定的多核苷酸之類(lèi)的序列。一般而言，可操作的連接到轉(zhuǎn)錄序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件與所轉(zhuǎn)錄的序列是實(shí)體上連續(xù)的，即它們是順式作用(&m>7g)。然而，有些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，如增強(qiáng)子，不必與它們所增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的編碼序列在實(shí)體上連續(xù)或位于其附近。術(shù)語(yǔ)"信號(hào)肽"是指成熟的分泌蛋白質(zhì)之前的氨基末端多肽。信號(hào)肽從蛋白質(zhì)中切除，因而并不出現(xiàn)在成熟蛋白質(zhì)中。信號(hào)肽具有指導(dǎo)和反式定位(trans-locating)分泌蛋白質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜的功能。信號(hào)肽也稱(chēng)為信號(hào)序列。此處所用的"轉(zhuǎn)化"是指細(xì)胞通過(guò)包括新的多核苷酸而獲得新的基因。此處所用術(shù)語(yǔ)"藥物"是指能被用來(lái)治療或預(yù)防特定疾病的任何化合物，可通過(guò)本發(fā)明的絲蛋白制成的藥物的例子包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸、抗腫瘤試劑、鎮(zhèn)痛藥、抗生素、抗炎化合物(類(lèi)固醇類(lèi)和非類(lèi)固醇類(lèi)都包括)、激素、疫苗、標(biāo)記物質(zhì)等等。多肽本發(fā)明所述"基本上純化的多肽"意思是指一般的從脂質(zhì)、核酸、其他多肽和其他污染分子諸如天然狀態(tài)下結(jié)合的蠟中分離的多肽。所述的基本上純化的多肽優(yōu)選地至少60%的游離，更優(yōu)選地至少75%的游離，更優(yōu)選地至少90%的游離于其天然結(jié)合的其他成分，上述限定不包括本發(fā)明的其他蛋白。在多肽的背景中使用的術(shù)語(yǔ)"重組"是指細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，與其天然狀態(tài)相比，通過(guò)改變產(chǎn)量或產(chǎn)率而產(chǎn)生多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的細(xì)胞是天然不產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞。然而，所述的細(xì)胞可以是包括導(dǎo)致該多肽產(chǎn)量改變，優(yōu)選地為增加該多肽產(chǎn)量的非內(nèi)源基因的細(xì)胞。本發(fā)明的重組多肽包括尚未從產(chǎn)生它的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其他成分中分離出來(lái)的多肽，以及在上述細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生而后從至少一些其他成分中純化出來(lái)的多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"一般可相互替換的使用，是指單多肽鏈，其可能通過(guò)添加非氨基酸基團(tuán)而修飾，也可能不修飾。此處所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"和"多肽"也包括此處所述的本發(fā)明的多肽的變異體、突變體、修飾物、模擬物和/或衍生物。多肽的％同源性(也稱(chēng)同一性，identity)通過(guò)GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)確定，其缺口產(chǎn)生罰分(gapcreationpenalty)=5，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)=0.3。査詢(xún)序列至少15個(gè)氨基酸長(zhǎng)，GAP分析在至少15個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，查詢(xún)序列至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)，GAP分析在至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，查詢(xún)序列至少100個(gè)氨基酸長(zhǎng)，GAP分析在至少I(mǎi)OO個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，21查詢(xún)序列至少250個(gè)氨基酸長(zhǎng)，GAP分析在至少250個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，GAP分析對(duì)兩條序列的全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)。此處所用"生物活性"片段是指本發(fā)明多肽的一部分，其保持了該全長(zhǎng)多肽的確定的活性，即用來(lái)產(chǎn)生絲的能力。生物活性片段可為任意長(zhǎng)度，只要它們保持了所述的確定的活性。對(duì)于所限定的多肽，應(yīng)理解比上述％同源性高的數(shù)值包括了優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，在適用的情況下，根據(jù)最低％同源性數(shù)值，所述的多肽包括的氨基酸序列，與相應(yīng)的指定SEQIDNO具有下述同源性?xún)?yōu)選地至少40%，更優(yōu)選地至少45%，更優(yōu)選地至少50%，更優(yōu)選地至少55%，更優(yōu)選地至少60%，更優(yōu)選地至少65%，更優(yōu)選地至少70%，更優(yōu)選地至少75%，更優(yōu)選地至少80%，更優(yōu)選地至少85%，更優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少91%，更優(yōu)選地至少92%，更優(yōu)選地至少93%，更優(yōu)選地至少94%，更優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少96%，更優(yōu)選地至少97%，更優(yōu)選地至少98%，更優(yōu)選地至少99%,更優(yōu)選地至少99.1%，更優(yōu)選地至少99.2%，更優(yōu)選地至少99.3%，更優(yōu)選地至少99.4%，更優(yōu)選地至少99.5%，更優(yōu)選地至少99.6%，更優(yōu)選地至少99.7%，更優(yōu)選地至少99.8%，更優(yōu)選地至少99.9%。本發(fā)明多肽的氨基酸序列突變體可通過(guò)向本發(fā)明的核酸中引入適當(dāng)?shù)母淖兊暮塑账岫苽?，或通過(guò)體外合成所需的多肽。所述的突變體包括，例如在氨基酸序列內(nèi)進(jìn)行殘基的刪除、插入或替換?？山M合運(yùn)用刪除、插入和替換來(lái)獲得最終的構(gòu)建物，只要最終的多肽產(chǎn)物具有所需的特性。突變(改變的)多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備。例如，可對(duì)本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行體外誘變。所述的體外誘變技術(shù)包括將該多核苷酸亞克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化該載體到"突變"株如大腸桿菌XL-1紅(Stratagene)，并使轉(zhuǎn)化的細(xì)菌繁殖適當(dāng)?shù)氖来?。另一個(gè)例子中，對(duì)本發(fā)明的多核苷酸使用DNA穿梭技術(shù)，該技術(shù)己被Harayama明白的描述(1998)。這些DNA穿梭技術(shù)可包括本發(fā)明的基因，并可能還有與本發(fā)明基因相關(guān)的基因，如來(lái)源于此處所述具體物種之外的其他膜翅目和脈翅目物種的絲基因。突變/改變的DNA獲得的產(chǎn)物可通過(guò)此處描述的技術(shù)容易得篩選確定它們能否用作絲蛋白。在涉及氨基酸序列突變體過(guò)程中，突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)依賴(lài)于將要修飾的性狀?？蓪?duì)突變的位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)修飾，或進(jìn)行一系列修飾，例如通過(guò)(1)首先進(jìn)行保守氨基酸替換，然后根據(jù)獲得的結(jié)果進(jìn)行更激進(jìn)的替換，(2)刪除目標(biāo)殘基，或(3)在該位點(diǎn)附近插入其他殘基。刪除的氨基酸序列一般在約1到15個(gè)殘基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地約1到10個(gè)殘基，典型地約1到5個(gè)連續(xù)殘基。替換突變中該多肽分子去除至少一個(gè)氨基酸殘基并在該位置插入一個(gè)不同殘基。最感興趣的替換誘變位點(diǎn)包括已鑒定為重要的功能位點(diǎn)。其他感興趣的位點(diǎn)是那些不同株或物種中特定殘基相同的位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可能對(duì)于生物活性是重要的。對(duì)這些位點(diǎn)，尤其是至少三個(gè)其他完全相同的保守位點(diǎn)，優(yōu)選地通過(guò)一種相對(duì)保守的方式進(jìn)行替換。這些保守的替換列在標(biāo)題為"典型的替換"的表l中。如上所述，一些本發(fā)明多肽的一部分具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)，多肽的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)特征為七肽重復(fù)，以一致序列"6c^/gJ"表示。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的部分包括至少10拷貝的七肽序列Wofe/g，并且至少25%的fl和d為氨基酸為丙氨酸殘基。表l.典型的替換<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的多肽包括至少12個(gè)連續(xù)拷貝，更優(yōu)選地至少15個(gè)連續(xù)拷貝，更優(yōu)選地至少18個(gè)連續(xù)拷貝的七肽。進(jìn)一歩的實(shí)施方式中，所述的具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的多肽含有達(dá)到至少28拷貝的七肽。典型地，該七肽的拷貝是串聯(lián)重復(fù)的(tandemlyrepeated)。然而，它們不一定必須是精確的串聯(lián)重復(fù)，例如，如圖5和圖6所示，可能在兩個(gè)七肽間發(fā)現(xiàn)一些氨基酸，或可能發(fā)現(xiàn)一些截?cái)嗟钠唠?例如，見(jiàn)圖5中Xenospiral)。圖5和圖6以及表6-]0提供了對(duì)具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的本發(fā)明多肽可進(jìn)行的氨基酸替換的指南。當(dāng)此處提供的基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)有用的氨基酸替換與表1提供的典型的替換有任何形式的沖突時(shí)，優(yōu)選地使用基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的替換。本發(fā)明多肽的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)具有高丙氨酸殘基含量，特別是在七肽的a、J和e氨基酸位。然而，6、c、/和g位也有高頻率的丙氨酸殘基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少15%的七肽的"、"和/或e位氨基酸是丙氨酸殘基是丙氨酸殘基，更優(yōu)選地至少25%，更優(yōu)選地至少30%，更優(yōu)選地至少40%，更優(yōu)選地至少50%。在進(jìn)一歩的優(yōu)選實(shí)施方式中，至少25%的七肽的《和d位氨基酸都是丙氨酸殘基，更優(yōu)選地至少30%，更優(yōu)選地至少40%，更優(yōu)選地至少50%。此外，優(yōu)選地至少15%的七肽6、c、/和g位氨基酸是丙氨酸殘基，更優(yōu)選地至少20%，更優(yōu)選地至少25%。典型地，該七肽不包括脯氨酸或組氨酸殘基。而且，該七肽中，下列殘基如果有，也是很少的(l或2個(gè))，這些殘基為苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸或色氨酸殘基。除了丙氨酸，該七肽中通常的(例如，多于5%，更優(yōu)選地多于10%)氨基酸包括亮氨酸(特別是在6和d位)、絲氨酸(特別是在6、e和/位)、谷氨酸(特別是在c、e和/位)、賴(lài)氨酸(特別是在6、c、d、/和g位)，以及g位的精氨酸。本發(fā)明的多肽(和多核苷酸)可從廣泛的膜翅目和脈翅目昆蟲(chóng)物種中純化(分離)獲得。膜翅目昆蟲(chóng)的例子包括但不限于細(xì)腰(Apocrita)亞目的任何種(蜜蜂、螞蟻和黃蜂)，其包括下列各科昆蟲(chóng)青蜂科(Chrysididae)(青蜂，cuckoowasps)、蟻科(Formicidae)(螞蟻，ants)、蟻蜂科(Mutillidae)(蟻蜂，velvetants)、蛛蜂科(Pompilidae)(蛛蜂，spiderwasps)、土蜂科(Scoliidae)、胡蜂科(Vespidae)(黃蜂，paperwasps、蜾贏(yíng)potterwasps、虎頭蜂hornets)、榕小蜂禾斗(Agaonidae)(榕小蜂，figwasps)、小蜂科(Chalcididae)(小蜂，chalcidids)、蟻小蜂科(Eucharitidae)(蟻小蜂，eucharitids)、旋小蜂科(Eupelmidae)(旋小蜂，eupelmids)、金小蜂科(Pteromalidae)(金小蜂，pteromalids)、旗腹姬蜂科(Evaniidae)(痩蜂，ensignwasps)、繭蜂禾斗(Braconidae)、姬蜂禾斗(Ichneumonidae)(姬蜂，ichneumons)、切葉峰科(Megachilidae)、蜜蜂科(Apidae)、分舌花蜂科(Colletidae)、集蜂科(Halictidae)和準(zhǔn)蜜蜂科(Melittidae)(集油蜜蜂，oilcollectingbees)。脈翅目昆蟲(chóng)的例子包括下列各科昆蟲(chóng)的種螳蛉科(Mantispidae)、草蛉科(Chrysopidae)(草蟲(chóng)青嶺，lacewings)、蟲(chóng)義嶺科(Myrmeleontidae)(奴卿antlions)和蝶角蛉科(Ascalaphidae)(梟蠅，owlflies)。這類(lèi)更多的多肽(和多核苷酸)可用此處描述的同樣程序從來(lái)源于授粉熊蜂(萬(wàn)om^^tore對(duì)r")、牛頭犬蟻(A^77nec/a/or/c"to)、黃猄蟻((9ecop/z>>〃fir5warag&wi！)和瑪草蛉(Afa//"tfaWg"ata)的絲中鑒定其特性。此外，如果需要，非自然存在的氨基酸或化學(xué)氨基酸類(lèi)似物可通過(guò)替代或加入而引入本發(fā)明的多肽中。這些氨基酸包括但不限于一般氨基酸的右旋體、2,4-二氨基丁酸、a-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸環(huán)己酯、P-丙氨酸、氟氨基酸、設(shè)計(jì)的氨基酸如p-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸以及一般的氨基酸類(lèi)似物。本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括在合成過(guò)程中或合成后進(jìn)行不同修飾的本發(fā)明多肽，例如，生物素化、芐基化、糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、己知保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白水解性裂解、結(jié)合抗體分子或其他細(xì)胞配基等。這些修飾可能起到增強(qiáng)本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性和/或生物活性的作用。本發(fā)明多肽可通過(guò)許多方法生產(chǎn)，包括自然多肽的生產(chǎn)和回收、重組多肽的生產(chǎn)和回收以及化學(xué)合成這些多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的本發(fā)明多肽通過(guò)在有效產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)所述的多肽的細(xì)胞，并回收該多肽而獲得。優(yōu)選的要培養(yǎng)的細(xì)胞為本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效的培養(yǎng)條件包括但不限于允許多肽生產(chǎn)的有效的培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧氣條件。有效的培養(yǎng)基是指用來(lái)培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明多肽細(xì)胞的任何培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基典型地包括含有可同化碳、氮和磷酸鹽來(lái)源，以及適當(dāng)?shù)柠}、礦物質(zhì)、金屬和其他營(yíng)養(yǎng)素如維生素的水性培養(yǎng)基。本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)傳統(tǒng)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微量滴定盤(pán)以及培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)可在適合重組細(xì)胞的溫度、pH和氧氣環(huán)境中進(jìn)行。該培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。多核苷酸所述的"分離的多核苷酸"，包括DNA、RNA或其組合、單鏈或雙鏈、正義鏈或反義鏈方向或其組合、dsRNA或其他，是指至少部分地從它天然狀態(tài)下結(jié)合或連接的多核苷酸序列中分離出來(lái)的多核苷酸序列。優(yōu)選地，分離的多核苷酸至少60%游離、優(yōu)選地至少75%游離、最優(yōu)選地至少90%游離于它們自然狀態(tài)下結(jié)合的其他成分。此外，此處使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"與術(shù)語(yǔ)"核酸"可相互替換。在多核苷酸語(yǔ)境中使用的術(shù)語(yǔ)"外源的"是指與其天然狀態(tài)相比以一種數(shù)量發(fā)生改變的方式出現(xiàn)在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的細(xì)胞是在天然狀態(tài)下不包括該多核苷酸的細(xì)胞。然而，所述的細(xì)胞可以是包括導(dǎo)致其編碼多肽的產(chǎn)量發(fā)生改變，優(yōu)選的為增加的非外源多核苷酸的細(xì)胞。本發(fā)明的外源多核苷酸包括尚未從存在該多核苷酸的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其他成分中分離出來(lái)的多核苷酸，以及在上述細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生而后從至少一些其他成分中純化出來(lái)的多核苷酸。多核苷酸的％同源性(identity)通過(guò)GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)確定，其缺口產(chǎn)生罰分(gapcreationpenalty)=5，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)=0.3。除非另有說(shuō)明，查詢(xún)序列至少45個(gè)核苷酸長(zhǎng)，GAP分析在至少45個(gè)核苷酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。優(yōu)選地，查詢(xún)序列至少150個(gè)核苷酸長(zhǎng)，GAP分析在至少150個(gè)核苷酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，査詢(xún)序列至少300個(gè)核苷酸長(zhǎng)，GAP分析在至少300個(gè)核苷酸的區(qū)域比對(duì)兩條序列。更優(yōu)選地，GAP分析對(duì)兩條序列的全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于所限定的多核苷酸，應(yīng)理解比上述％同源性高的數(shù)值包括了優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，在適用的情況下，根據(jù)最低％同源性數(shù)值，所述的多核苷酸包括的序列，與相應(yīng)的指定SEQIDNO具有下述同源性?xún)?yōu)選地至少40%，更優(yōu)選地至少45%，更優(yōu)選地至少50%，更優(yōu)選地至少55%，更優(yōu)選地至少60%，更優(yōu)選地至少65%，更優(yōu)選地至少70%，更優(yōu)選地至少75%，更優(yōu)選地至少80%，更優(yōu)選地至少85%，更優(yōu)選地至少90%,更優(yōu)選地至少91%，更優(yōu)選地至少92%，更優(yōu)選地至少93%，更優(yōu)選地至少94%，更優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少96%，更優(yōu)選地至少97%，更優(yōu)選地至少98%，更優(yōu)選地至少99%，更優(yōu)選地至少99.1%，更優(yōu)選地至少99.2%，更優(yōu)選地至少99.3%，更優(yōu)選地至少99.4%，更優(yōu)選地至少99.5%，更優(yōu)選地至少99.6%，更優(yōu)選地至少99.7%，更優(yōu)選地至少99.8%，更優(yōu)選地至少99.9%。本發(fā)明的多核苷酸可包括與天然存在的分子相比具有一個(gè)或一個(gè)以上的核苷酸殘基缺失、插入或替換的突變。突變體可以是自然發(fā)生的(即，從自然來(lái)源分離的)，也可以是合成的(例如，在該核酸上進(jìn)行定向誘變)。本發(fā)明的寡核苷酸和/或多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與本發(fā)明的絲基因或所述的基因的側(cè)翼區(qū)雜交。此處所用的術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件"等是指本領(lǐng)域熟悉的參數(shù)，包括隨寡核苷酸長(zhǎng)度改變雜交溫度。核酸雜交參數(shù)可在編輯該方法的參考文獻(xiàn)中找到，如Sambrook等人(見(jiàn)前述)和Ausubd等人(見(jiàn)前述)。例如，此處所用的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件，可指在雜交緩沖液(3.5xSSC、0.02%聚蔗糖、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02。/。牛血清白蛋白(BSA)、2.5mMNaH2P04(pH7)、0.5%SDS、2mMEDTA)中65。C雜交，然后在50°C0.2xSSC,0.01%BSA中洗一次或一次以上。另外，核酸和/或寡核苷酸(也可稱(chēng)為"引物"或"探針")在核酸擴(kuò)增技術(shù)如PCR中使用的條件下與感興趣的昆蟲(chóng)基因組區(qū)雜交，如蜜蜂的基因組。本發(fā)明的寡核苷酸可為RNA、DNA或其衍生物。盡管術(shù)語(yǔ)多核苷酸和寡核苷酸的意思有重疊的地方，寡核苷酸典型地是指相對(duì)短的單鏈分子。該寡核苷酸的最小值為寡核苷酸與目標(biāo)核酸分子上的互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定雜交分子所需的大小。優(yōu)選地，該寡核苷酸至少有15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少有18個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少有19個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少有20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少有25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。一般而言，多核苷酸或寡核苷酸單體通過(guò)磷酸二酯鍵或其類(lèi)似連接連接形成從相對(duì)短的單體單元如12-18個(gè)到幾百個(gè)單體單元大小的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類(lèi)似連接包括磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷硒酰(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、硫代磷酸苯胺(phosphoroanilothioate)、磷酸苯胺(phosphoranilidate)、氨基磷酸酉旨(phosphoramidate)。本發(fā)明包括可用于鑒別核酸分子的探針或產(chǎn)生核酸分子的引物之類(lèi)的寡核苷酸。用作探針的本發(fā)明寡核苷酸典型地與放射性同位素、酶、生物素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光分子之類(lèi)的可檢測(cè)的標(biāo)記物相結(jié)合。重組載體本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括一種重組載體，該重組載體包括至少一種插入到任何能夠?qū)⒈景l(fā)明多核苷酸傳遞到宿主細(xì)胞的載體中的本發(fā)明的分離多核苷酸。所述的載體包括異源多核苷酸序列，即那些并不天然出現(xiàn)在本發(fā)明多核苷酸分子附近的多核苷酸序列，并且優(yōu)選地該多核苷酸序列來(lái)源于與本發(fā)明多核苷酸序列不同的物種。該載體可為RNA或DNA，原核的或真核的，且典型地為轉(zhuǎn)座子(諸如US5,792,294中所描述的)、病毒或質(zhì)粒。一種類(lèi)型的重組載體包括可操作的連接到表達(dá)載體的本發(fā)明的多核苷酸分子?？刹僮鞯倪B接是指將多核苷酸分子以轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中時(shí)該分子能夠表達(dá)的方式插入到表達(dá)載體中。此處所用的表達(dá)載體是指能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并能夠有效表達(dá)指定多核苷酸分子的DNA或RNA載體。優(yōu)選地，該表達(dá)載體也能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。表達(dá)載體可為原核的或真核的，典型地為病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括任何在本發(fā)明重組細(xì)胞中發(fā)揮功能(即指導(dǎo)基因表達(dá))的載體，包括在細(xì)菌、真菌、內(nèi)寄生物、節(jié)肢動(dòng)物、動(dòng)物和植物細(xì)胞中。本發(fā)明特別優(yōu)選的表達(dá)載體能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)基因表達(dá)。本發(fā)明的載體也能用于在無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生多肽，該系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的。特別地，本發(fā)明的表達(dá)載體包括如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起始點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列，以及其他與重組細(xì)胞相容的和控制本發(fā)明多核苷酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。特別地，本發(fā)明的重組分子包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄起始的序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和阻遏物序列。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄控制序列包括能夠在至少一種本發(fā)明重組細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。許多這樣的轉(zhuǎn)錄控制序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括在細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動(dòng)物、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的序列，如下所述但并不局限于此tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌體X、噬菌體T7、T71ac、噬菌體T3、噬菌體SP6、噬菌體SPOl、金屬硫蛋白、a交配因子、畢赤酵母乙醇氧化酶、a病毒亞基因組啟動(dòng)子(如Sindbis病毒亞基因組啟動(dòng)子)、抗生素抗性基因、桿狀病毒、玉米夜蛾昆蟲(chóng)病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒(如中間體早期啟動(dòng)子)、猿猴病毒40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肌動(dòng)蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)、勞氏肉瘤病毒、熱休克、磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)錄控制序列，以及其他能夠在原核或真核細(xì)胞中控制基因表達(dá)的序列。特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列為在植物中有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，可以是組成型的或階段和/或組織特異性的，取決于所用的植物或植物部分。植物啟動(dòng)子包括但不限于組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，葉特異性表達(dá)的，如二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因啟動(dòng)子，根特異性表達(dá)的，如谷氨酰胺合酶基因啟動(dòng)子，種子特異性表達(dá)的，如甘藍(lán)型油菜cmciferinA基因啟動(dòng)子，塊莖特異性表達(dá)的，如馬鈴薯I類(lèi)patatin基因啟動(dòng)子，以及果實(shí)特異性表達(dá)的，如番茄的多聚半乳糖醛酸酶(PG)啟動(dòng)子。本發(fā)明的重組分子也可包括(a)分泌信號(hào)(即信號(hào)片段核酸序列)，以使本發(fā)明的表達(dá)多肽從產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞分泌出來(lái)和/或(b)融合序列，以便以融合蛋白的形式表達(dá)本發(fā)明的核酸分子。信號(hào)片段的例子包括能夠指導(dǎo)本發(fā)明多肽分泌的任何信號(hào)片段。優(yōu)選的信號(hào)片段包括但不限于組織纖維蛋白溶酶原激活物(t-PA)、干擾素、白介素、生長(zhǎng)激素、病毒被膜糖蛋白信號(hào)片段、Nicotiananectarin信號(hào)肽(US5,939,288)、煙草伸展蛋白信號(hào)、大豆油質(zhì)蛋白油體結(jié)合蛋白信號(hào)、擬南芥液泡堿性幾丁質(zhì)酶信號(hào)肽，以及本發(fā)明多肽的天然信號(hào)序列。此外，本發(fā)明核酸分子可連接到指導(dǎo)所編碼的多肽到蛋白體(proteosome)的融合片段上，如泛素融合片段。重組分子也可包括本發(fā)明核酸序列周?chē)?或內(nèi)部插入的和/或非翻譯序列。宿主細(xì)胞本發(fā)明另外一個(gè)實(shí)施方式包括一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞包括一種或一種以上本發(fā)明重組分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或其子代細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)任何能夠?qū)⒍嗪塑账岱肿硬迦爰?xì)胞中的方法將多核苷酸分子轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、吸附和原生質(zhì)融合。重組細(xì)胞可保持為單細(xì)胞或長(zhǎng)成組織、器官或多細(xì)胞生物體。轉(zhuǎn)化的本發(fā)明多核苷酸分子可保持在染色體外，也可以保留表達(dá)能力的方式整合到被轉(zhuǎn)化(即重組)細(xì)胞染色體上的一個(gè)或一個(gè)以上的位點(diǎn)。適當(dāng)?shù)膶⒁M(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包括任何能用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明宿主細(xì)胞可為能夠產(chǎn)生本發(fā)明多肽的內(nèi)源的(即天然的)細(xì)胞，也可為通過(guò)至少一種本發(fā)明多核苷酸分子轉(zhuǎn)化后能夠產(chǎn)生所述的多肽的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可為任何能夠產(chǎn)生至少一種本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞，包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、動(dòng)物和植物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的例子包括沙門(mén)氏菌、埃希菌屬、桿菌、李斯特菌屬、酵母、夜蛾(Spodoptera)、分枝桿菌、Trichoplusia、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、CV-1胞、COS(例如COS-7)細(xì)胞和Vero細(xì)胞。更多的宿主細(xì)胞例子如大腸桿菌，包括大腸桿菌K-12衍生物；傷寒沙門(mén)氏菌；鼠傷寒沙門(mén)氏菌，包括減毒菌株；貪食夜蛾；粉紋夜蛾；以及非致瘤性小鼠生肌G8細(xì)胞(例如ATCCCRL1246)。其他適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括其他腎細(xì)胞系、其他成纖維細(xì)胞系(如人、鼠、雞胚成纖維細(xì)胞系)骨髓瘤細(xì)胞系、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、小鼠NIH/3T3細(xì)胞、LMTK細(xì)胞和/或HeLa細(xì)胞。t寺另'J優(yōu)選的宿主細(xì)胞是可從DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物收藏所)等處獲得的植物細(xì)胞。重組DNA技術(shù)可用來(lái)改善轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子的表達(dá)，通過(guò)操作如宿主細(xì)胞內(nèi)多核苷酸分子的拷貝數(shù)，多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄的效率、產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本翻譯的效率，以及翻譯后修飾的效率等?？捎糜谔岣弑景l(fā)明多核苷酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括但不限于多核苷酸分子可操作的連接到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒、多核苷酸分子整合到一個(gè)或一個(gè)以上的宿主細(xì)胞染色體中、向質(zhì)粒中加入載體穩(wěn)定性序列、替換或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)(如啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子)、替換或修飾翻譯控制信號(hào)(如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Shine-Dalgarno序列)、修飾本發(fā)明多核苷酸分子以符合宿主細(xì)胞使用的密碼子，以及刪除使轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的序列。轉(zhuǎn)基因植物術(shù)語(yǔ)"植物"是指整株植物、植物器官(如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞等等。本發(fā)明使用的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。目標(biāo)植物包括但不限于下列植物谷類(lèi)(小麥、大麥、黑麥、燕麥、稻、高粱和相關(guān)作物)；甜菜屬(甜菜和飼用甜菜)；梨果、核果和軟果(蘋(píng)果、梨、李子、桃、扁桃、櫻桃、草莓、覆盆子和黑莓)；豆科植物(豆類(lèi)、扁豆、豌豆、大豆)；油類(lèi)植物(油菜、芥菜、罌粟、橄欖、向R葵、椰子、蓖麻油類(lèi)植物、可可豆、落花生)；黃瓜植物(marrows、黃瓜、瓜類(lèi))；纖維植物(棉花、亞麻、大麻、黃麻)；柑橘類(lèi)水果(橙、檸檬、葡萄柚、蜜桔)；蔬菜(菠菜、萵苣、蘆筍、巻心菜、胡蘿卜、洋蔥、番茄、馬鈴薯、紅辣椒)；樟科(酪梨、肉桂、樟腦)；或如玉米、煙草、堅(jiān)果、咖啡、甘蔗、茶、藤、蛇麻花、草、香蕉和天然橡膠之類(lèi)的植物，以及觀(guān)賞植物(花、灌木、闊葉樹(shù)和常綠植物如松柏類(lèi)植物)。本發(fā)明文中限定的轉(zhuǎn)基因植物包括植物(即所述植物的部分和細(xì)胞)及其子代，其子代通過(guò)使用重組技術(shù)進(jìn)行基因修飾，以在所需的植物或植物器官中產(chǎn)生至少一種本發(fā)明的多肽。轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，如A.Slater等人在PlantBiotechnology-TheGeneticManipulationofPlants(植物生物技術(shù)-植物基因操作)，(OxfordUniversityPress(2003))，以及P.Christou和H.Klee在HandbookofPlantBiotechnology(植物生物技術(shù)手冊(cè))，JohnWileyandSons(2004))中廣泛描述的。本發(fā)明多核苷酸可在轉(zhuǎn)基因植物所有發(fā)育階段組成型表達(dá)。根據(jù)所用植物或植物器官，所述的多肽可通過(guò)階段特異性的方式表達(dá)。此外，所述的多核苷酸可組織特異性的表達(dá)。己知的或發(fā)現(xiàn)能夠使編碼感興趣多肽的基因在植物中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可用于本發(fā)明。對(duì)所用調(diào)節(jié)序列的選擇取決于感興趣的目標(biāo)植物和/或植物器官。所述的調(diào)節(jié)序列可取自植物或植物病毒，或可通過(guò)化學(xué)合成。所述的調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。組成型植物啟動(dòng)子是人們熟知的。除上述提到的啟動(dòng)子外，一些其他適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括但不限于胭脂堿合酶啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、核酮糖-1,5二磷酸羧化酶啟動(dòng)子、Adhl-basedpEmu、Actl、SAM合酶啟動(dòng)子、Ubi啟動(dòng)子以及葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動(dòng)子。另外可能需要轉(zhuǎn)基因以一種受調(diào)節(jié)的方式表達(dá)。通過(guò)將絲蛋白的編碼序列置于組織特異性、發(fā)育特異性或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，對(duì)多肽調(diào)節(jié)表達(dá)是可能的。已經(jīng)有一些植物中組織特異性的調(diào)節(jié)基因和/或啟動(dòng)子的報(bào)道。其包括編碼種子貯藏蛋白(如napin、cruciferin、P-conglycinin、大豆球蛋白和菜豆球蛋白)、玉米醇溶蛋白或油體蛋白(如油質(zhì)蛋白)、或涉及脂肪酸生物合成的基因(包括酰基載體蛋白、硬脂酰-ACP去飽和酶和脂肪酸去飽和酶(fad2-l))和其他胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的基因(如Bce4)。對(duì)種子特異性表達(dá)特別有用的為豌豆球蛋白啟動(dòng)子。其他用于成熟葉中表達(dá)的啟動(dòng)子是那些開(kāi)啟衰老起始的啟動(dòng)子，如擬南芥中SAG啟動(dòng)子)。US4,943,674討論了一類(lèi)在開(kāi)花期或在開(kāi)花期經(jīng)過(guò)果實(shí)發(fā)育，至少到開(kāi)始成熟的過(guò)程中果實(shí)特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。其他組織特異性啟動(dòng)子的例子包括在塊莖中(如patatin基因啟動(dòng)子)和纖維細(xì)胞中(一個(gè)受發(fā)育調(diào)節(jié)的纖維細(xì)胞蛋白的例子是E6纖維)指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。其他調(diào)節(jié)序列如終止子序列和多腺苷酸化信號(hào)包括任何在植物中發(fā)揮該功能的序列，其選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。由于終止區(qū)似乎是相對(duì)可相互替換的，因而主要根據(jù)方便選擇表達(dá)盒中使用的終止區(qū)。所用的終止區(qū)可能是與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然配套的、可能是與感興趣的多核苷酸序列天然配套的或者是來(lái)自于其他來(lái)源的。終止區(qū)可以是天然存在的，也可以是完全或部分合成的。方便的終止區(qū)可從農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)Ti質(zhì)粒中獲得，如章魚(yú)堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)，或從e菜豆球蛋白基因、化學(xué)誘導(dǎo)的lant基因pIN中獲得。一些技術(shù)可用于將包括編碼感興趣的多肽的核酸序列的表達(dá)構(gòu)建物引入目標(biāo)植物中。該技術(shù)包括但不限于用鈣/聚乙二醇方法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、電穿孔和顯微注射或(包被的)粒子轟擊。除了這些稱(chēng)為直接DNA轉(zhuǎn)化法之外，涉及載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是廣泛可得的，如病毒和細(xì)菌載體(例如來(lái)自于農(nóng)桿菌屬)。在選擇和/或篩選后，被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體、細(xì)胞或植物部分可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法再生成整株植物。轉(zhuǎn)化和/或再生技術(shù)的選擇對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不嚴(yán)謹(jǐn)。為證實(shí)轉(zhuǎn)基因存在與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物中，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或Southern印跡分析?？捎弥T多可用方法中的任何一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物，取決于產(chǎn)物的性質(zhì)，包括Western印跡和酶鑒定。一種定量蛋白表達(dá)及檢測(cè)不同植物組織中復(fù)制的特別有用的方法是應(yīng)用報(bào)告基因，如GUS。獲得轉(zhuǎn)基因植物后，可對(duì)其進(jìn)行栽培以產(chǎn)生具有所需表型的植物組織或植物部分?？墒崭钤撝参锝M織或植物部分，和/或采集種子。該種子可作為栽培具有所需性狀組織或部分的植物的來(lái)源。非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域所熟知的。對(duì)這一主題有用的全面的教科書(shū)是Houdebine的Transgenicanimals-GenerationandUse(轉(zhuǎn)基因云力物-產(chǎn)生禾口用途)(HarwoodAcademic,1997)。異源DNA可引入如哺乳動(dòng)物受精卵中。例如，全能或多能干細(xì)胞可通過(guò)顯微注射、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或其他方法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞引入胚胎中，胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在高度優(yōu)選的方法中，用含有所需DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育的胚胎，然后感染的胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然而，在最優(yōu)選的方法中，適當(dāng)?shù)腄NA共注射到胚胎的前核或胞質(zhì)中，優(yōu)選地在單細(xì)胞期，該胚胎發(fā)育成成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的另外一種方法涉及使用標(biāo)準(zhǔn)方法將核酸顯微注射到前核期卵中，然后在移植到假孕受者的輸卵管中之前培養(yǎng)注射的卵。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可通過(guò)核移植技術(shù)產(chǎn)生。在該方法中，使用包括在調(diào)節(jié)序列控制下的感興趣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合配偶體(bindingpartner)的編碼序列的質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染供者動(dòng)物的成纖維細(xì)胞。然后將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子與去核的卵母細(xì)胞融合，培養(yǎng)并移植到雌性受者中。絲的回收方法和生產(chǎn)本發(fā)明的絲蛋白可從重組細(xì)胞，如植物、細(xì)菌或酵母細(xì)胞中提取和純化，通過(guò)多種方法生產(chǎn)所述的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法涉及通過(guò)降低pH和加熱，然后采用硫酸銨分級(jí)分離從同質(zhì)化(homogenized)的細(xì)胞/組織/植物等中去除天然的細(xì)胞蛋白。簡(jiǎn)單的說(shuō)，通過(guò)同質(zhì)化細(xì)胞/組織/植物提取總可溶性蛋白。通過(guò)pH4.7沉淀然后6(TC處理去除天然蛋白。產(chǎn)生的上清液用40%飽和度的硫酸銨分級(jí)分離。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將具有95%級(jí)的純度。可通過(guò)常規(guī)的膠或親和層析獲得進(jìn)一歩的純化。在另外一個(gè)例子中，使用高濃度的酸，如HCl或丙酸降低pH到l-2—小時(shí)或一小時(shí)以上處理細(xì)胞裂解物，該處理將使絲蛋白溶解但使其他蛋白沉淀。當(dāng)?shù)鞍诐舛瘸^(guò)關(guān)鍵值時(shí)，本發(fā)明絲蛋白通過(guò)自發(fā)的自組裝從溶液中形成纖維狀聚集物。可按照O'Brien等人的方法收集該聚集物并將其機(jī)械紡織成肉眼可見(jiàn)的纖維(I.O'Brien等人"Design,SynthesisandFabricationofNovelSelf-AssemblingFibrillarProteins(新的自組裝纖維狀蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)、合成和組裝)"，SilkPolymers:MaterialsScienceandBiotechnology,pp.104-117,Kaplan,Adams,Farmer禾口Viney,eds.,c.1994,AmericanChemicalSociety,Washington,D.C)。根據(jù)巻曲螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的固有性質(zhì)，諸如Xeriospiral-4、BBF1-4、BAF1-4和GAFl-4在脫水時(shí)會(huì)自發(fā)形成巻曲螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如下所述，可通過(guò)對(duì)臨近31賴(lài)氨酸進(jìn)行酶或化學(xué)交聯(lián)增強(qiáng)巻曲螺旋的強(qiáng)度。本發(fā)明的絲纖維和/或共聚物對(duì)加工處理的要求不高。本發(fā)明的絲蛋白要求最小的加工處理，例如紡織形成強(qiáng)纖維，因?yàn)樗鼈冏园l(fā)形成強(qiáng)的巻曲螺旋，并可通過(guò)如賴(lài)氨酸交聯(lián)等交聯(lián)而進(jìn)一歩增強(qiáng)。這與家蠶和蜘蛛的重組絲多肽形成對(duì)比，后者需要復(fù)雜的紡織技術(shù)以獲得二級(jí)結(jié)構(gòu)(e-片層)和纖維的強(qiáng)度。然而，纖維可從具有液晶相特征屬性的溶液中抽出。能夠產(chǎn)生相變的纖維濃度取決于溶液中一種蛋白質(zhì)的組成或幾種蛋白質(zhì)的組合。相變可通過(guò)監(jiān)測(cè)溶液的透明度和雙折射來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)溶液具有半透明的表現(xiàn)并且通過(guò)交叉的偏振濾光片觀(guān)察時(shí)記錄有雙折射時(shí)，可檢測(cè)到液晶相的起始。在一種形成纖維的技術(shù)中，纖維可首先通過(guò)一個(gè)孔口(orifice)從蛋白溶液中拉出并進(jìn)入甲醇中，直到產(chǎn)生足夠使用機(jī)械裝置拾起的長(zhǎng)度。然后通過(guò)該機(jī)械裝置拉出纖維通過(guò)甲醇溶液，收集并干燥。拉拔纖維的方法被認(rèn)為是本領(lǐng)域熟知的。US2004/0170827和US2005/0054830描述了更多可用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明絲纖維和/或共聚物的方法的例子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明絲纖維和/或共聚物是交聯(lián)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的絲纖維和/或共聚物通過(guò)本領(lǐng)域己知的方法交聯(lián)到感興趣的表面/物品/產(chǎn)品等上。在另一個(gè)實(shí)施方式中(或與前面的實(shí)施方式結(jié)合)，絲纖維和/或共聚物中至少一些絲蛋白相互交聯(lián)。優(yōu)選地，絲蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)中的賴(lài)氨酸殘基交聯(lián)。該交聯(lián)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)和/或酶技術(shù)進(jìn)行。例如酶交聯(lián)可被賴(lài)氨酸氧化酶催化，而非酶交聯(lián)可通過(guò)糖化的賴(lài)氨酸殘基產(chǎn)生(Reiser等人，1992)?？贵w本發(fā)明也提供本發(fā)明多肽或其片段的單克隆或多克隆抗體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)本發(fā)明多肽的單克隆或多克隆抗體的方法。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合特異性"是指抗體結(jié)合至少一種本發(fā)明多肽而不是其他已知絲蛋白的能力。此處所用的術(shù)語(yǔ)"表位"是指被抗體結(jié)合的本發(fā)明多肽的區(qū)。表位可給予動(dòng)物以產(chǎn)生抗該表位的抗體，然而，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地在整個(gè)多肽的環(huán)境中特異性的結(jié)合表位區(qū)。如果需要多克隆抗體，使用本發(fā)明的免疫原性多肽免疫選定的哺乳動(dòng)物(小鼠、兔、山羊、馬等)。根據(jù)已知的程序收集和處理免疫動(dòng)物的血清。如果包括多克隆抗體的血清包括對(duì)其他抗原的抗體，該多克隆抗體可通過(guò)免疫親和層析進(jìn)行純化。生產(chǎn)和處理多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。為制造所述的抗體，本發(fā)明也提供本發(fā)明多肽或其片段作為半抗原連接到另外的多肽用作動(dòng)物中的免疫原。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以容易地生產(chǎn)抗本發(fā)明多肽的單克隆抗體。通過(guò)雜交瘤制作單克隆抗體的一般方法是人們熟知的。產(chǎn)生永生抗體的細(xì)胞系可通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生，也可通過(guò)其他技術(shù)如致癌DNA轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或EB病毒(Epstein-Barrvirus)轉(zhuǎn)染。可根據(jù)不同的特性篩選單克隆抗體組；即同種型和表位親和力。另外一種技術(shù)涉及篩選噬菌體展示庫(kù)，其中，例如噬菌體在其被膜上表達(dá)帶有大量多種互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的scFV片段。該技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。為本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"抗體"，除非有相反的說(shuō)明，包括保留了對(duì)目標(biāo)抗原結(jié)合活性的完整抗體片段。所述的片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及單鏈抗體(scFv)。此外，抗體及其片段可為人源化抗體，例如EP-A-239400中描述的。本發(fā)明的抗體可結(jié)合到固相支持物和/或同適當(dāng)?shù)脑噭?duì)照、說(shuō)明書(shū)之類(lèi)的一起裝入適當(dāng)?shù)娜萜靼b到試劑盒中。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體帶有可檢測(cè)的標(biāo)記。代表性的允許直接檢測(cè)抗體結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、熒光團(tuán)、染料、磁珠、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、膠體顆粒等等。允許直接測(cè)量結(jié)合的標(biāo)記的例子包括底物提供有色或熒光產(chǎn)物的酶。另外的代表性可檢測(cè)的標(biāo)記包括加入適當(dāng)?shù)孜锖竽芴峁┛蓹z測(cè)產(chǎn)物信號(hào)的共價(jià)結(jié)合的酶。用來(lái)結(jié)合的適當(dāng)?shù)拿傅睦影ɡ备^(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等等。若商業(yè)上不可獲得，所述的抗體-酶結(jié)合物可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的技術(shù)容易的生產(chǎn)。更多的代表性的可檢測(cè)的標(biāo)記包括對(duì)抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素有高親和力的生物素；可與熒光激活細(xì)胞分類(lèi)器一起使用的熒光色素(例如藻膽蛋白、藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白；熒光素和德克薩斯紅)；及其類(lèi)似物質(zhì)。優(yōu)選地，可檢測(cè)標(biāo)記允許在光度計(jì)盤(pán)中直接測(cè)量，例如生物素。所述的標(biāo)記抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)本發(fā)明的多肽。組合物本發(fā)明的組合物可包括"可接受的載體"，該可接受的載體的例子包括水、鹽水、任氏液、葡萄糖溶液、Hank's液，以及其他含水生理平衡鹽溶液。也可使用非水性載體，如不揮發(fā)油、麻油、油酸乙酯或甘油三酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，"可接受的載體"是"藥學(xué)上可接受的載體"。術(shù)語(yǔ)藥學(xué)上可接受的載體是指給予動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，更特別的是人的時(shí)候不產(chǎn)生過(guò)敏，毒性或不良反應(yīng)的分子實(shí)體或組合物。有用的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的例子包括但不限于不影響本發(fā)明多肽活性的溶劑、分散劑、包衣、穩(wěn)定劑、保護(hù)性膠體、粘合劑、增稠劑、搖溶劑、滲透劑、掩蔽劑和等滲和緩釋劑?？赏ㄟ^(guò)，例如使用包衣，如卵磷脂，在分散時(shí)維持所需的粒子大小以及使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。更普遍地，本發(fā)明多肽可通過(guò)相應(yīng)的通常使用的配制技術(shù)和任何無(wú)毒的固體或液體添加劑聯(lián)合使用。如此處概括的，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽、絲纖維和/或共聚物用作藥學(xué)上可接受的載體。下面描述了本發(fā)明多肽具體用途的其他適當(dāng)組合物，具有具體的參考資料。用途由于其特別的韌性和強(qiáng)度，絲蛋白可用于創(chuàng)造新的生物材料。然而，至今為止蜘蛛和昆蟲(chóng)的纖維狀蛋白質(zhì)是大蛋白(大于lOOKDa)，并由高度重復(fù)的氨基酸序列組成。這些蛋白質(zhì)由包括高度偏愛(ài)性的密碼子的大基因編碼，使他們特別難以在重組系統(tǒng)中生產(chǎn)。相比之下，本發(fā)明的絲蛋白是短的和非重復(fù)的。這些特性使得編碼這些蛋白的基因?qū)τ谕ㄟ^(guò)重組生產(chǎn)新的生物材料特別有吸引力。本發(fā)明的絲蛋白、絲纖維和/或共聚物在醫(yī)學(xué)、軍事、工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用等廣泛和多種領(lǐng)域中可以應(yīng)用。纖維可用于制造醫(yī)學(xué)用具如縫合、植皮、細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)、置換韌帶、外科修補(bǔ)網(wǎng)狀織物，以及用于工業(yè)和商業(yè)產(chǎn)品的廣泛領(lǐng)域，如線(xiàn)纜、繩、網(wǎng)、魚(yú)線(xiàn)、衣服織物、防彈背心、容器織物、背包、背囊、袋或錢(qián)包帶、粘性結(jié)合材料、非粘性結(jié)合材料、帶材料、帳篷織物、帆布、庫(kù)覆蓋物、車(chē)輛覆蓋物、圍墻材料、封閉劑、建筑材料、耐風(fēng)雨材料、韌性隔離材料、運(yùn)動(dòng)器材；以及事實(shí)上可用于任何需要高拉伸強(qiáng)度和彈性特性的纖維和織物中。本發(fā)明的絲蛋白、絲纖維和/或共聚物也可用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品組合物中，如化妝品、皮膚養(yǎng)護(hù)、護(hù)發(fā)和染發(fā)中；以及粒子的涂層，如色料。絲蛋白可用其天然形式或修飾成具有更有益效果的衍生物。例如，絲蛋白可通過(guò)結(jié)合反應(yīng)修飾成聚合物以降低變異原型，如US5,981,718禾nUS5,856,451所述。適當(dāng)?shù)男揎椌酆衔锇ǖ幌抻诰巯┗趸?polyalkyleneoxides)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol)、聚羧酸鹽(poly-carboxylates)、聚乙烯吡咯烷(poly(vinylpyrolidone))、和葡聚糖(dextrans)。在另外的例子中，絲蛋白的修飾可通過(guò)選擇性消化和剪切其他蛋白修飾物。例如，絲蛋白可通過(guò)提高溫度約6CTC酸處理切成更小的肽單位。有用的酸包括但不限于稀鹽酸、含硫和含磷酸。另外，絲蛋白的消化可通過(guò)堿處理完成，如氫氧化鈉，或可使用適當(dāng)?shù)牡鞍酌高M(jìn)行酶消化。所述的蛋白質(zhì)可通過(guò)進(jìn)一步修飾以提供在個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中具有有益的特別用途的性能特性。對(duì)用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的蛋白修飾是本領(lǐng)域所熟知的。例如，常用的方法在US6,303,752、US6,284,246和US6,358,501中有描述。修飾的例子包括但不限于乙氧基化以促進(jìn)水乳化的增強(qiáng)、硅氧基化(siloxylation)以提供親脂相容性、酯化以協(xié)助肥皂和洗滌劑組合物相容性。另外，絲蛋白可通過(guò)功能集團(tuán)產(chǎn)生衍生物，功能基團(tuán)包括但不限于胺、環(huán)氧乙烷、氰酸鹽、羧酸酯、硅酮多羥基化合物(siliconecopolyols)、硅氧烷酯、季銨化脂肪胺、氨基甲酸乙酯、聚丙烯酰胺、二羧酸酯和鹵代酯。絲蛋白也可通過(guò)和二亞胺酯反應(yīng)和形成金屬鹽產(chǎn)生衍生物。與上述對(duì)"多肽"(及"蛋白質(zhì)")的定義一致，所述的衍生物和/或修飾分子此處也概括的稱(chēng)之為"多肽"和"蛋白質(zhì)"。本發(fā)明絲蛋白可與其他類(lèi)型纖維紡在一起和/或成束或編織。其例子包括但不限于聚合纖維(如聚丙烯、尼龍、聚酯)、其他植物和動(dòng)物來(lái)源的纖維或絲(如棉、毛、家蠶或蜘蛛絲)和玻璃纖維。優(yōu)選的實(shí)施方式是絲纖維和10%的聚丙烯纖維編織。本發(fā)明包括可容易的用來(lái)增強(qiáng)任何想要特性的纖維組合的產(chǎn)物，例如外觀(guān)、柔軟性、重量、耐久性、抗水性、改善制造成本，這些可能是在制造和生產(chǎn)醫(yī)學(xué)、工業(yè)或商業(yè)應(yīng)用纖維過(guò)程中所一般尋求的性質(zhì)。個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品化妝品和皮膚養(yǎng)護(hù)組合物可為無(wú)水組合物，包括在化妝用介質(zhì)中有效量的絲蛋白。這些組合物的用途包括但不限于皮膚養(yǎng)護(hù)、皮膚清潔、化妝和抗皺紋產(chǎn)品。化妝品和皮膚養(yǎng)護(hù)組合物中有效量的絲蛋白此處定義為約10—4到約30%的重量比例，但優(yōu)選的從約10—3到15%重量，相對(duì)于組合物的總重量。該比例可根據(jù)化妝品或皮膚養(yǎng)護(hù)組合物的類(lèi)型成函數(shù)變化。US6,280,747中描述了化妝用介質(zhì)的適當(dāng)組合物。例如，化妝用介質(zhì)可包括一般從相對(duì)于組合物總重約10到約90%重量比例的脂質(zhì)，其中脂相包括至少一種液體、固體或半固體脂質(zhì)。脂質(zhì)包括但不限于油、蠟、樹(shù)膠和所謂的糊狀脂質(zhì)。另外，組合物可為穩(wěn)定分散的形式，如作為油包水或水包油乳狀液。此外，該組合物可包括一種或一種以上常規(guī)的化妝品或皮膚病學(xué)的添加劑或佐劑，包括但不限于抗氧化劑、保藏劑、賦形劑、表面活性劑、UVA和/或UVB遮光劑、芳香劑、增稠劑、濕潤(rùn)劑和陰離子、非離子或兩性聚合物，以及染料或色素。包括至少一種本發(fā)明絲蛋白的使用乳化材料的可生產(chǎn)的乳化化妝品和準(zhǔn)藥物包括，例如，清潔化妝品(美容香皂、潔面、香波、淋洗等)、護(hù)發(fā)產(chǎn)品(染發(fā)劑、美發(fā)劑之類(lèi))、基本化妝品(一般乳膏、乳液、剃毛膏、調(diào)節(jié)劑、科隆香水、修面液、美容油、面膜等等)、化妝美容用品(底、畫(huà)眉筆、眼膏、眼影、修眉液等等)、芳香化妝品(香水之類(lèi))、曬黑和防曬化妝品(曬黑和防曬霜、曬黑和防曬露、曬黑和防曬油等)、指甲化妝品(指甲油之類(lèi))、眼線(xiàn)化妝品(眼線(xiàn)膏之類(lèi))、唇化妝品(唇膏、唇霜之類(lèi))、口腔護(hù)理用品(牙刷之類(lèi))、洗浴用品(洗浴產(chǎn)品之類(lèi))等等?；瘖y品組合物也可以指甲護(hù)理產(chǎn)品的形式，如指甲油。此處指甲油定義為處理和染色指甲的組合物，包括化妝用介質(zhì)中有效量的絲蛋白。指甲油組合物中有效量的絲蛋白此處定義為相對(duì)于油總重約l(T4到約30。/。的重量比例。US6,280,747描述了指甲油化妝用介質(zhì)的組成。指甲油典型的包括溶劑和膜形成物質(zhì)，如纖維素衍生物、聚乙烯衍生物、丙烯酸脂聚合物或共聚物、乙烯共聚物或聚酯聚合物。該組合物也可包括有機(jī)或無(wú)機(jī)色素。護(hù)發(fā)組合物此處定義為處理頭發(fā)的組合物，包括但不限于香波、調(diào)節(jié)劑、洗液、氣霧劑、凝膠劑和奶油凍劑，其中在化妝用介質(zhì)中包括有效量的絲蛋白。護(hù)發(fā)組合物中有效量的絲蛋白此處定義為相對(duì)于該組合物總重約10-2到約90%的重量比例。US2004/0170590、US6,280,747、US6,139,851和US6,013,250中描述了護(hù)發(fā)組合物中化妝用介質(zhì)的組成。例如護(hù)法組合物可為水、醇或水醇溶液，對(duì)于水醇溶液，醇優(yōu)選地為乙醇或異丙醇，相對(duì)于總重約1-約75%的重量比例。此外，護(hù)發(fā)組合物可包括一種或一種以上常規(guī)的化妝品或皮膚病學(xué)的添加劑或佐劑，如上所述。染發(fā)組合物此處定義為著色、染色、脫色的組合物，包括在化妝用介質(zhì)中有效量的絲蛋白。染發(fā)組合物中有效量的絲蛋白此處定義為相對(duì)于該組合物總重約l(T4到約60%的重量比例。US2004/0170590、US6,398,821和US6,129,770中描述了染發(fā)組合物中化妝用介質(zhì)的組成。例如，染發(fā)組合物一般包括無(wú)機(jī)過(guò)氧化染料氧化劑和可氧化著色劑。過(guò)氧化染料氧化劑最通常的是過(guò)氧化氫。氧化染發(fā)劑通過(guò)氧化偶聯(lián)初級(jí)中間物(例如對(duì)苯二胺、對(duì)氨基苯酚、對(duì)二氨基嘧啶、羥基口引哚、吲哚胺、胸腺嘧啶胺或青色苯酚(cyanophenols)與次級(jí)中間物(例如苯酚、間苯二酚、m-氮基苯酚、m-苯二胺、萘酚、吡哇酮、羥基B引哚、兒茶酚或吡唑)而形成。另外，染發(fā)組合物可包括氧化酸、多價(jià)螯合劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、緩沖載體、表面活性劑、溶劑、抗氧化劑、聚合物、非氧化染料和調(diào)節(jié)劑。絲蛋白也可用來(lái)包被色素和化妝品顆粒，以改善該顆粒的分散性，用于化妝品和包被組合物?；瘖y品顆粒此處定義為化妝品組合物中應(yīng)用的如色素或惰性粒子之類(lèi)的粒狀物質(zhì)。適當(dāng)?shù)纳睾突瘖y品顆粒包括但不限于無(wú)機(jī)有色色素、有機(jī)色素和惰性粒子。無(wú)機(jī)有色色素包括但不限于二氧化鈦、氧化鋅、以及鐵、鎂、鈷、鋁氧化物。有機(jī)有色色素包括但不限于D&C紅No.36、D&C橙No.17、D&C紅Nos.7,11,31和34鈣色淀、D&C紅No.12鋇色淀、D&C紅No.13鍶色淀、FD&C黃No.5鋁色淀和炭黑粒子。惰性粒子包括但不限于碳酸鈣、硅酸鋁、硅酸鈣、硅酸鎂、云母、滑石、硫酸鋇、硫酸鈣、粉末尼龍(powderedNylon)、全氟化烴和其他惰性塑料。絲蛋白也可用于牙線(xiàn)(例如，見(jiàn)US2005/0161058)。該線(xiàn)可為單絲線(xiàn)或多絲線(xiàn)，纖維可以扭曲也可以不扭曲。牙線(xiàn)可包裝成單個(gè)或包裝成帶有切割工具可切割成任意長(zhǎng)度的巻。牙線(xiàn)可提供成除絲狀之外的許多形狀，例如但不限于貼或片之類(lèi)。該線(xiàn)可包被不同的材料，例如但不限于蠟、牙線(xiàn)用聚四氟乙烯單纖絲。絲蛋白也可用于肥皂(如，見(jiàn)US2005/0130857)。色素和化妝品粒子包被用于色素和化妝品粒子包被有效量的絲蛋白此處定義為相對(duì)于干重粒子的約10—4到約50%，但優(yōu)選地從約0.25到約15%的重量比例。所用的最優(yōu)絲蛋白量取決于要包被色素或化妝品粒子的類(lèi)型。例如無(wú)機(jī)有色色素的絲蛋白用量?jī)?yōu)選地在約0.01%到20%重量之間。對(duì)于有機(jī)色素，優(yōu)選的絲蛋白量在約1%到約15%重量，而對(duì)于惰性粒子，優(yōu)選的量在約0.25%到約3%重量。US5,643,672中描述了制備包被色素和粒子的方法。這些方法包括在攪拌混合的同時(shí)加入絲蛋白水溶液，形成絲蛋白和該粒子的漿并千燥，噴霧干燥絲蛋白溶液到粒子上或低壓凍干絲蛋白和粒子漿。包被的色素和化妝品顆?？捎糜诨瘖y品組分、油漆、墨水之類(lèi)。生物醫(yī)學(xué)絲蛋白可用于包被繃帶以促進(jìn)傷口愈合。為此，繃帶材料用有效量的絲蛋白包被。對(duì)于傷口愈合繃帶的目的，有效量的絲蛋白此處定義為相對(duì)于繃帶材料重量的約1(T4到約30%的重量比例。要包被的材料可為任何柔軟的、生物惰性的、多孔的布或纖維。例子包括但不限于棉、絲、人造絲、醋酸鹽、丙烯酸樹(shù)脂、聚乙烯、聚酯及其組合。布或纖維的包被可通過(guò)許多本領(lǐng)域已知的方法完成。例如，被包被的材料浸入含有絲蛋白的水溶液中。另外，包括絲蛋白的溶液也可使用噴槍噴灑到要包被材料的表面上。此外，包括絲蛋白的溶液也可通過(guò)滾動(dòng)包被印刷方法包被到表面上。傷口繃帶可包括其他添加劑，包括但不限于消毒劑如碘、碘化鉀、碘化聚烯吡酮、利凡諾、過(guò)氧化氫、芐垸銨氯化物、醋酸氯己啶；加速治愈劑如尿囊素、鹽酸狄布卡因和蘋(píng)果酸氯化苯胺；收縮血管劑如鹽酸萘甲唑啉；收斂劑如氧化鋅；和結(jié)痂劑如硼酸。本發(fā)明絲蛋白也能以薄膜的形式用作傷口敷料。US6,175,053描述了絲蛋白以無(wú)定形薄膜的形式用作傷口敷料。無(wú)定形薄膜包括結(jié)晶度低于10%的致密無(wú)孔且包括有效量絲蛋白的膜。對(duì)于創(chuàng)傷護(hù)理的膜，有效量絲蛋白此處定義為約1到99%重量比例。該膜也可包括其他成分包括但不限于其他蛋白如絲膠蛋白和消毒劑、加速治愈劑、收縮血管劑、收斂劑和結(jié)痂劑，如上面所述。其他蛋白如絲膠蛋白可包括1到99%組合物重量。所列其他物質(zhì)的總量?jī)?yōu)選地低于約30%重量，更優(yōu)選地在約0.5到20%組合物重量。傷口敷料薄膜可通過(guò)在水溶液中溶解上述材料，通過(guò)過(guò)濾或離心去除不溶物，將溶液澆鑄到光滑固體表面如丙烯酸盤(pán)，然后干燥。本發(fā)明絲蛋白也可用于縫合(如，見(jiàn)US2005/0055051)。該縫合的特征是用超高分子量纖維和絲纖維做成編織套。聚乙烯提供強(qiáng)度。聚酯纖維和高分子量的聚乙烯編織在一起而提供了改良的拴系特性。該絲可用對(duì)比色以提供改良的縫合識(shí)別和鑒定痕跡。絲比其他纖維更能和組織的相適應(yīng)，允許在靠近打結(jié)的地方剪掉末端而不必?fù)?dān)心縫合末端和周?chē)M織的有害相互作用。高強(qiáng)度縫合線(xiàn)的處理特性也可通過(guò)使用不同材料包被縫合線(xiàn)而得到增強(qiáng)。該縫合線(xiàn)有利具有Ethibond5號(hào)線(xiàn)的強(qiáng)度，而其直徑、感覺(jué)和拴系能力和2號(hào)縫合線(xiàn)一樣。因此，該縫合線(xiàn)對(duì)于大部分整形外科操作，如旋轉(zhuǎn)套修復(fù)術(shù)、跟骨腱修復(fù)術(shù)、髕韌帶修復(fù)術(shù)、ACL/PCL重建、肩臀重建操作，以及代替用于縫合錨中以及和縫合錨一起使用的縫合線(xiàn)來(lái)說(shuō)是理想的。該縫合線(xiàn)可不包被，或用蠟(蜂蠟、石油蠟、聚乙烯蠟或其他)、硅酮(DowCorning硅酮流體202A或其他)、硅酮橡膠、PBA(聚丁酸)、乙基纖維素(Filodel)或其他包被物包被，以改善編織物的潤(rùn)滑性、結(jié)安全性或耐磨性等等。本發(fā)明絲蛋白也可用于支架(如，見(jiàn)US2004/0199241)。例如，支架移植物包括管腔內(nèi)支架和移植物，其中支架移植物包括絲。該絲誘導(dǎo)接受支架移植物的宿主的應(yīng)答，而該應(yīng)答能使絲支架移植物與接近絲支架移植物的絲的組織之間的粘連增強(qiáng)。所述的絲可通過(guò)多種方法中的任何一種結(jié)合到移植物上，例如，通過(guò)將絲交織到移植物上或通過(guò)附著到移植物上(例如通過(guò)粘合劑或縫合的方法)。絲的形式可以為線(xiàn)、穗帶、片層、粉末等等。對(duì)于絲在支架移植物上的位置，可僅附著到支架的表面，和/或附著到支架移植物的遠(yuǎn)端區(qū)，以協(xié)助遠(yuǎn)端區(qū)固定在宿主中的鄰近組織。在本發(fā)明的背景中可使用多種支架移植物，取決于所需治療的位置和性質(zhì)。支架移植物可以是，例如分叉的或管狀移植物、圓柱狀或逐漸變細(xì)、可自展或球形展開(kāi)的、單片或組件等等。除了絲以外，支架移植物可在一些或所有絲上進(jìn)行包被，其中該包被在支架移植物插入宿主時(shí)降解，因此該包被延緩絲和宿主之間接觸的時(shí)間。適當(dāng)?shù)陌话ǘ幌抻诿髂z、可降解聚酯(例如PLGA、PLA、MePEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA及其共聚物和摻和物)、纖維素和纖維素衍生物(例如羥丙基纖維素)、多糖(例如透明質(zhì)酸、葡聚糖、硫酸葡聚糖、殼聚糖)、脂質(zhì)、脂肪酸、糖脂、核酸酯、聚酐、多正酯類(lèi)和聚乙烯醇(PVA)。含絲的支架移植物可包括生物活性劑(藥物)，其中該制劑從支架移植物中釋放而后誘導(dǎo)增強(qiáng)的細(xì)胞應(yīng)答(例如，細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)沉淀)和/或插入支架移植物宿主的纖維變性反應(yīng)。本發(fā)明絲蛋白也可用于體外生產(chǎn)韌帶和腱的基質(zhì)中(例如，見(jiàn)US2005/0089552)。多能細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)種植在絲纖維基質(zhì)中。生物工程韌帶或腱的有利特點(diǎn)是在應(yīng)用機(jī)械力方向上的細(xì)胞定向和/或基質(zhì)巻曲模式，以及若施加了機(jī)械力，沿著該機(jī)械力或刺激所產(chǎn)生的機(jī)械負(fù)荷的軸上產(chǎn)生的韌帶和腱特異性標(biāo)記包括膠原i型、膠原m型和纖連蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的韌帶或腱的特點(diǎn)是螺旋組織排列的纖維束。一些能夠生產(chǎn)的韌帶或腱的例子包括前十字韌帶、后十字韌帶、回旋肌腱群、肘和膝的內(nèi)側(cè)副韌帶、手的屈肌腱、踝的外側(cè)韌帶以及頜和顳頜關(guān)節(jié)的腱和韌帶。本發(fā)明可生產(chǎn)的其他組織包括軟骨(關(guān)節(jié)和半月板都包括)、骨、肌肉、皮膚和血管。本發(fā)明絲蛋白也可用于水凝膠(例如，見(jiàn)US2005/0266992)。絲心蛋白水凝膠具有開(kāi)孔結(jié)構(gòu)特征，使它們可在細(xì)胞培養(yǎng)、傷口和燒傷敷料、軟組織替代物、骨賦形劑中用作組織工程支架和底物，以及藥學(xué)或生物學(xué)活性化合物的支持物。所述的絲蛋白也可用于皮膚病學(xué)組合物(例如，見(jiàn)US2005/0019297)。此外，本發(fā)明絲蛋白及其衍生物也可用于持續(xù)釋放組合物(例如，見(jiàn)US2004/0005363)。紡織本發(fā)明絲蛋白也可用于纖維表面而后用于紡織中。這將在纖維上提供單層蛋白膜而產(chǎn)生光滑產(chǎn)品。US6,416,558和US5,232,611描述了加入抹光包被到纖維上。這些揭示中描述的方法提供了多種抹光纖維以提供良好感覺(jué)和光滑表面的例子。用于這種用途時(shí)，使用有效量絲蛋白包被纖維。為用于紡織中包被纖維的目的，有效量絲蛋白此處定義為相對(duì)于纖維材料重量的約1到約99%重量比例。纖維材料包括但不限于棉紡織纖維、聚酯如人造絲和LycraTM、尼龍、毛織物和其他天然纖維包括土絲。適合將絲蛋白用于纖維上的組合物可包括助溶劑如乙醇、異丙醇、己莉醇(hexafluoranols)、異硫代氰酸鹽(isothiocyanouranates)和其他能夠和水混合形成溶液或微乳化液的極性溶劑。包括絲蛋白的溶液可噴到纖維上或?qū)⒗w維浸到溶液中。盡管不是必須的，包被材料優(yōu)選地進(jìn)行快速干燥。另一種方案是將絲蛋白組合物應(yīng)用到編織纖維上。該應(yīng)用理想的實(shí)施方式為將絲蛋白用于包被可伸展的編織物如用于長(zhǎng)襪。復(fù)合材料絲纖維可加入到聚氨酯、其他樹(shù)脂或熱塑性填充物中制備面板和其他建筑材料或替代木材和顆粒板用模型器具和臺(tái)階頂(benchtop)。該復(fù)合材料也可用于建筑和汽車(chē)制造特別是屋頂和門(mén)板。絲纖維增強(qiáng)樹(shù)脂使該材料更強(qiáng)且允許與其他顆粒板和組合材料相比相同或更高強(qiáng)度而重量輕的構(gòu)造。絲纖維可分離并加入合成的形成復(fù)合材料的樹(shù)脂中或與從植物中獲得的蛋白質(zhì)、淀粉和油聯(lián)合使用以生產(chǎn)生物復(fù)合材料。JP2004284246、US2005175825、US4,515,737、JP47020312和WO2005/017004描述了生產(chǎn)這種材料的方法。紙?zhí)砑游锉景l(fā)明的絲的纖維性質(zhì)可增加造紙的強(qiáng)度和品質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)棉漿中斑紋絲線(xiàn)制作的絲紙，以制備超平滑手工紙，可用于禮品包裝、筆記本封面、紙袋中。JP2000139755中一般描述了生產(chǎn)包括本發(fā)明絲蛋白紙制品的方法。高級(jí)材料本發(fā)明的絲具有相當(dāng)?shù)捻g性，并且變濕的時(shí)候在維持這些性質(zhì)方面與其他絲不同(Hepburn等人，1979)。服裝紡織工業(yè)的技術(shù)和智能紡織領(lǐng)域具有實(shí)質(zhì)性的增長(zhǎng)。對(duì)健康、高功能值、環(huán)境友好型和個(gè)人化的織品需求越來(lái)越多。如本發(fā)明所述的纖維在變濕的時(shí)候不改變其性質(zhì)，特別是維持了它們的強(qiáng)度和伸展性，可用于運(yùn)動(dòng)休閑的功能性服裝以及工作服和保護(hù)服裝中。武器和監(jiān)視技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了個(gè)人防護(hù)設(shè)備和戰(zhàn)場(chǎng)相關(guān)系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新。除了可滿(mǎn)足常規(guī)需要，如長(zhǎng)時(shí)間暴露的耐用性、重型服裝和對(duì)外部環(huán)境的保護(hù)之外，本發(fā)明絲織品可加工成抗發(fā)射物沖擊、火和化學(xué)品的織品。WO2005/045122和US2005268443描述了生產(chǎn)上述材料的方法。實(shí)施例實(shí)施例l-晚末齡幼蟲(chóng)唾液腺cDNA的制備和分析在真針尾類(lèi)和脈翅目昆蟲(chóng)(意大利蜂,〃z>ra)、授粉熊蜂。om6Mtore血、)、牛頭犬蟲(chóng)義(Jl^T匿c/fl/or/cato)、黃猄蟲(chóng)義(Oeo/^〃as腿rag(i/ra)、瑪草蛉(M"http://^toWg"ato))絲中發(fā)現(xiàn)的蛋白通過(guò)將胰蛋白酶消化該絲，獲得多肽的離子阱連續(xù)質(zhì)譜(MS/MS)片段模式與從晚末齡幼蟲(chóng)唾液腺中分離的cDNA編碼蛋白的預(yù)測(cè)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配來(lái)鑒定。為確定通過(guò)這種方法對(duì)蜜蜂進(jìn)行分析時(shí)不39遺漏任何蛋白，肽質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)也和蜜蜂基因組計(jì)劃預(yù)測(cè)的，以及Amd3蜜蜂基因組序列所有六個(gè)讀碼框翻譯的意大利蜂U/^mW/^ra)蛋白質(zhì)的虛擬胰蛋白酶消化產(chǎn)物相比較。蜜蜂意大利蜂幼蟲(chóng)從馴養(yǎng)蜂房中得到。以前研究表明意大利蜂絲的產(chǎn)生限制在末齡幼蟲(chóng)后半段時(shí)的唾液腺中(Silva-Zacarin等人，2003)。在此階段，RNA在該腺的后端更豐富(Flower和Kenchington,1967)。從浸在磷酸鹽緩沖鹽水中晚五期蜜蜂幼蟲(chóng)中分離50個(gè)唾液腺的立方形細(xì)胞區(qū)。分離唾液腺的后端立即放入RNA/afer(Ambion,Austin,TX,USA)中以穩(wěn)定mRNA，然后保存在4°C。使用Ambion(Austin,TX,USA)公司PCR試劑盒RNAqueous從晚末齡幼蟲(chóng)唾液腺中分離總RNAG5pg)。使用Invitrogen(Calsbad,CA,USA)Micro-FastTrack2.0mRNA分離試劑盒按制造商說(shuō)明從總RNA中分離信使RNA，分離的mRNA洗脫到10pi無(wú)RNAse水中。使用Invitrogen(Calsbad,CA,USA)CloneMinercDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒用從蜜蜂幼蟲(chóng)中分離的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行下述修改第一條鏈合成，6pmol.nl"生物素-attB2-Oligo(dT)引物0.5pl及每種2mMdNTPs加入到%1mRNA中。65°C溫育5min然后45。C2min，加入2^15x第一條鏈緩沖液，lpl0.1MDTT，以及0.5pl200U.^r1SuperscriptIIRT。對(duì)于第二條鏈合成，所有試劑的總體積減半，乙醇沉淀后，用5plDEPC處理水重懸浮cDNA。aatBl接頭(lpl)在總體積10^1中連接，其中5plcDNA，2pl5x接頭緩沖液，lpl0.1MDTT以及1^1T4DNA連接酶(lU41r1)，在16。C連接48hrs，16小時(shí)候額外加入0.5plT4DNA連接酶(1U.W1)。按照制造商說(shuō)明根據(jù)cDNA大小進(jìn)行分選，對(duì)300-50(^1樣品進(jìn)行洗脫，乙醇沉淀，重懸浮并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10BtmTl抗噬菌體細(xì)胞中，如推薦的那樣。cDNA文庫(kù)包括大約1,200,000集落形成單位(cfu)，帶有大約1%原載體。平均插入大小為1.3±1.4kbp。隨機(jī)挑選82個(gè)集落，使用GenomeLabDTCSQuickstart試劑盒(BeckmanCoulter,FullertonCAUSA)在CEQ8000Biorad測(cè)序儀上測(cè)序。其聚類(lèi)到54個(gè)組(表2)。編碼絲蛋白的cDNA的鑒定如下所述。其他物種使用Ambion(Austin,TX,USA)公司PCR試劑盒RNAqueous從晚末齡幼蟲(chóng)唇腺中從下述物種中分離總RNA:4熊蜂(授粉熊蜂，萬(wàn)0m6ra^reW&)(2嗎RNA)、4牛頭犬蟻(Mjrwec/a/w/cato)(3昭腦A)約100織工蟻(黃猄蟻，Oecop/^〃aswamgt/!'ra)(0.4嗎RNA)和約50綠草蜻蛉(瑪草蛉，7Vfa//WaWg"ato)。使用Invitrogen(Calsbad,CA,USA)Micro-FastTrack2.0mRNA分離試劑盒從總RNA中分離mRNA，溶入終體積10|al水中。使用Invitrogen(Calsbad,CA,USA)CloneMinercDNA試劑盒用從mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行下述修改第一條鏈合成，3pmo1生物素-attB2-01igo(dT)引物及l(fā)nmol每種dNTPs加入到1(^1mRNA中。65。C溫育5min然后45°C2min，加入2pl5x第一條鏈緩沖液，50nmolDTT，以及100USuperscriptIIRT。表2.蜜蜂末齡唾液腺cDNA以及SDS處理巢房絲胰蛋白酶消化肽的MS離子阱片段模式<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>對(duì)于第二條鏈合成，所有試劑的總體積根據(jù)制造商推薦量減半，乙醇沉淀后，用5|alDEPC處理水重懸浮cDNA。aatBl接頭(1W)在總體積10|al中連接，其中5|ilcDNA，2pl5x接頭緩沖液，50nmolDTT，以及1UT4DNA連接酶，在16。C連接12hrs。cDNA文庫(kù)包括大約2.4x107(熊蜂)，5.0,7(牛頭犬蟻)和6000(綠螞蟻)集落形成單位(cfu)，帶有對(duì)于牛頭犬蟻和熊蜂文庫(kù)低于1%以及在綠螞蟻文庫(kù)中大于80%原載體。文庫(kù)中平均插入大小為1.3Kbp。序列數(shù)據(jù)從熊蜂和牛頭犬蟻cDNA文庫(kù)中多于100個(gè)隨機(jī)克隆、蜜蜂82個(gè)克隆及草蜻蛉60個(gè)克隆中獲得。從綠螞蟻(大約lmm長(zhǎng))中獲得唾液腺存在技術(shù)困難，降低了該物種文庫(kù)的效率，因而僅檢查了40條序列。表3提供了所鑒定的絲蛋白的總結(jié)。表3.真針尾類(lèi)絲蛋白的鑒定和特性<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*此處也分別稱(chēng)為Xenospiral-4和Xenosin，**PROFsec預(yù)測(cè)，***MARCOIL以90%閾值預(yù)測(cè)實(shí)施例2土絲的制備和蛋白分析去除幼蟲(chóng)后的蜜蜂巢房、去除幼蟲(chóng)后的熊蜂繭、去除幼蟲(chóng)后的的牛頭犬蟻繭或織工蟻絲層在溫水中廣泛洗三次去除水溶性污染物，然后在用氯仿廣泛洗三次除蠟。通過(guò)蒸餾水淋洗除氯仿，保留一團(tuán)所述的絲用于分析。一團(tuán)膜翅目昆蟲(chóng)(螞蟻和蜜蜂)絲樣品進(jìn)一步在0.05%煮沸碳酸鈉溶液中洗滌30分鐘，這是蠶繭絲脫膠的標(biāo)準(zhǔn)程序，然后用蒸餾水淋洗。草蜻蛉絲僅用蒸鎦水淋洗。一團(tuán)草蜻蛉絲樣品通過(guò)在0.05%碳酸鈉溶液煮沸30分鐘脫膠。一團(tuán)蜜蜂材料在2%SDS9^C浸濕過(guò)夜，然后用蒸餾水淋洗三次。熱SDS溶液提取溶解了大部分蛋白，但絲層保持了其構(gòu)象。清潔的絲通過(guò)液相層析，然后通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS)分析，如下所述。清潔的絲團(tuán)放在Millipore'zipplate'96孔微滴定板的孔中，該板的每個(gè)孔包括通過(guò)該孔底部的C18反相層析介質(zhì)栓塞，并在其中加入20pl25mM含有160ng測(cè)序級(jí)純胰蛋白酶(Promega)的碳酸氫銨溶液。然后該板在3(TC增濕塑料袋中溫育過(guò)夜。通過(guò)在每個(gè)孔的邊上吸入乙腈(lOpl)潤(rùn)濕C18材料，在37"保溫該板15分鐘。每孔中加入甲酸溶液(130^1，l%v/v)，30分鐘后，通過(guò)逐漸降低真空從板底緩慢抽吸每個(gè)孔的溶液收獲C18材料上的消化蜜蜂蛋白的肽。通過(guò)抽吸lOOpl甲酸溶液兩次洗滌C18材料。通過(guò)直接加入C18材料中6pl1%甲酸加入70%甲醇后立即離心，將肽通過(guò)C18栓塞洗脫到下面的微滴定板中。該板置入真空中，直到通過(guò)蒸發(fā)每孔中的體積降低約2倍。每孔中加入甲酸溶液(10^U),并將該板轉(zhuǎn)移到Agilent1100毛細(xì)管液相層析系統(tǒng)的孔板取樣器中。絲提取物中的肽(8u1)結(jié)合到AgilentZorbaxSB-C185fim150x0.5mm柱中，以0.1%甲酸/5%乙腈2(^1.1^11-|1分鐘然后用逐漸增加乙腈濃度到0.1%甲酸/20%乙腈的梯度5pl.min—^先脫超過(guò)1分鐘，然后到0.1%甲酸/50%乙腈超過(guò)28分鐘，然后到0.1%甲酸/95%乙腈超過(guò)1分鐘。該柱子通過(guò)0.1%甲酸/95%-100%乙腈以20pl.min—1洗超過(guò)5分鐘，并下一孔樣品肽上樣前以0.1%甲酸/5%乙腈重平衡7分鐘。柱中的洗脫物通過(guò)儀器的電噴霧離子源微噴霧器引.入AgilentXCT離子阱質(zhì)譜儀中。簡(jiǎn)單的說(shuō)，當(dāng)肽從柱中洗脫時(shí)，離子阱收集全譜陽(yáng)性離子掃描(100-2200m/z)，然后兩次MS/MS掃描在全譜掃描中觀(guān)察到的離子，避免選擇帶有單電荷的離子。當(dāng)選定進(jìn)行MS/MS分析的離子后，所有其他離子都從離子阱排除，選定的離子根據(jù)儀器推薦的"SmartFrag"和"PeptideScan"設(shè)置片段化。一旦收集到任何特定m/z值的兩個(gè)片段譜，其在另外30秒被排除在選定的分析外，以避免收集冗余數(shù)據(jù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)組使用Agilent'sSpectrumMill軟件分析，與從cDNA文庫(kù)中預(yù)測(cè)的蛋白序列數(shù)據(jù)匹配。軟件產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到的肽片段質(zhì)量組與根據(jù)提供的數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白序列可能產(chǎn)生的預(yù)測(cè)片段之間每個(gè)匹配質(zhì)量的得分值。此處報(bào)告所有序列匹配的得分大于20，這是自動(dòng)有把握接受有效匹配的缺省設(shè)置。本分析鑒定出五種唇腺中高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)與來(lái)源于每個(gè)蜜蜂種同源的絲匹配(如表2和表3所示)，以及四種唇腺中到水平表達(dá)的蛋白質(zhì)與來(lái)源于每個(gè)螞蟻種同源的絲匹配(如表3所示)。幼蟲(chóng)唇腺中編碼這些蛋白的信使RNA豐度與所產(chǎn)生蛋白的豐度一致(信使的豐度如表3所示)。為保證通過(guò)這種鑒定方法沒(méi)有遺漏任何蜜蜂絲蛋白，我們也將蜜蜂絲胰蛋白酶肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)與一組公眾可獲得的蜜蜂基因組計(jì)劃預(yù)測(cè)的蛋白序列相比較，其通過(guò)計(jì)算機(jī)算法為努力識(shí)別蜜蜂全部基因組DNA序列中可轉(zhuǎn)錄的基因而產(chǎn)生。此外，我們根據(jù)蜜蜂基因組計(jì)劃提供的每個(gè)連續(xù)的基因組DNA序列的六個(gè)可能的讀碼框產(chǎn)生翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)(Amel3公布)。這些翻譯的DNA序列呈現(xiàn)到SpectrumMill軟件，如同它們是非常大的蛋白質(zhì)序列一樣。匹配MS/MS肽數(shù)據(jù)鑒定出編碼部分分離的蜜蜂蛋白質(zhì)的基因組序列內(nèi)的開(kāi)放讀碼框，而不必首先預(yù)測(cè)基因的組織。通過(guò)這種方法沒(méi)有鑒定出絲中另外的蛋白。實(shí)施例3-土絲的結(jié)構(gòu)分析土絲樣品如實(shí)施例2描述的進(jìn)行制備。絲樣品通過(guò)帶有PikeMiracle鉆石衰減全反射附件的BrukerTensor37傅立葉變換紅外光譜儀檢查。對(duì)蜜蜂、熊蜂、綠螞蟻、牛頭犬蟻和草蜻蛉幼蟲(chóng)絲(圖1)的酰胺I區(qū)、n區(qū)光譜分析表明所有這些絲都有主要的a螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)。真針尾類(lèi)的絲具有在FT-IR光譜1645-1646cm—1處的優(yōu)勢(shì)峰，比經(jīng)典的a螺旋信號(hào)向下移動(dòng)大約lOcm"并加寬。這種a螺旋信號(hào)的移動(dòng)是典型的巻曲螺旋蛋白(Heimburg等人，1999)。脫膠樣品的光譜沒(méi)有發(fā)生變化。實(shí)施例4-土絲的氨基酸組成與鑒定的絲蛋白十分相似土絲的氨基酸組成通過(guò)使用AustralianProteomeAnalysisFacilityLtd(MacquarieUniversity,Sydney)的WatersAccQTag化學(xué)ll(TC氣相水解24小時(shí)后確定。測(cè)得的SDS洗滌絲的氨基酸組成與鑒定的絲蛋白序列預(yù)測(cè)的相似(圖2和3)。實(shí)施例5-絲蛋白結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)的分泌肽一.如對(duì)絲蛋白預(yù)期的一樣，使用兩個(gè)模型鑒定信號(hào)肽的SignalP3.0信號(hào)預(yù)測(cè)程序(Bendtsen等人，2004)預(yù)測(cè)所有鑒定的編碼蛋白的絲基因包括將它們從細(xì)胞中定向分泌的信號(hào)肽(數(shù)據(jù)未示)。該多肽預(yù)測(cè)的切割位點(diǎn)如下Xenospiral(AmelFl)-在pos19和20(ASA-GL)之間，Xenospira2(AmelF2)-在pos19禾tl20(AEG-RV)之間，Xenospira3(AmelF3)-在pos19禾卩20(VHA-GV)之間，Xenospim4(AmelF4)-在pos19禾口20(ASG-AR)之間，Xenosin(AmelSAl)-在pos19和20(VCA-GV)之間，BBF1-在pos19和20(ASA-GQ)之間，BBF2-在pos20禾Q21(AEG-HV)之間，BBF3-在pos19禾tl20(VHA-GS)之間，BBF4-在pos19和20(ASA-GK)之間，BAF1-在pos19和20(ASA-SG)之間，BAF2-在pos19禾B20(ASG-RV)之間，BAF3-在pos19和20(ASG-NL)之間，BAF4-在pos19和20(VGA-SE)之間，GAF1-在pos19和20(ADA-SK)之間，GAF2-在pos19和20(ASG-GV)之間，GAF3-在pos19和20(ASG-GV)之間，GAF4-在pos19和20(VGA-SE)之間，MalFl-在pos26和27(SST-AV)之間。螞蟻所有的四種和蜜蜂五種絲蛋白中的四種絲蛋白是螺旋的并具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)。蛋白模型和模式識(shí)別算法的結(jié)果證實(shí)大部分鑒定的蜜蜂絲蛋白是形成巻曲螺旋的螺旋蛋白。PROFsec(Rost禾卩Sander,1993)和NNPredict(McClelland和Rumelhart，1988;Kndler等人，1990)算法被用于研究鑒定的絲基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些算法鑒定出Xenospiral[GB12184陽(yáng)PA](SEQIDNO:l)、Xenospira2[GB12348-PA](SEQIDIDNO:7)是高度螺旋蛋白，具有76-85%之間的螺旋結(jié)構(gòu)(表4)。Xenosin[GB15233-PA](SEQIDNO:10)具有顯著少的螺旋結(jié)構(gòu)。表4.PROFsec(Rost和Sander，1993)預(yù)測(cè)的意大利蜂絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示螺旋、延伸片層和環(huán)的百分?jǐn)?shù)蛋白質(zhì)螺旋伸展片層環(huán)PROFsecNNPredictPROFsecNNPredictPROTsecNNPredictXenospira37770362027Xenospira48582261416Xenospiral8073141926Xenospira27769252129Xenosin4141895150更多的蛋白模型和模式識(shí)別算法的結(jié)果證實(shí)大部分鑒定的蜜蜂絲蛋白是形成巻曲螺旋的螺旋蛋白。PredictProtein(Rost等人，2004)算法被用來(lái)研究鑒定絲基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些算法鑒定出Xenospiral(SEQIDNO:l)、Xenospira2(SEQIDNO:3)、Xenospira3(SEQIDNO:5)、Xenospira4(SEQIDNO:7)、BBFl(SEQIDNO:22)、BBF2(SEQIDNO:24)、BBF3(SEQIDNO:26)、BBF4(SEQIDNO:28)、BAFl(SEQIDNO:40)、BAF2(SEQIDNO:42)、BAF3(SEQIDNO:44)、BAF4(SEQIDNO:46)、GAF1(SEQIDNO:56)、GAF2(SEQIDNO:58)、GAF3(SEQIDNO:60)、GAF4(SEQIDNO:62)和MalFl(SEQIDNO:72)是高度螺旋蛋白，具有69-88%之間的螺旋結(jié)構(gòu)(表3)。AmelSAl[GB15233-PA](Xenosin)(SEQIDNO:10)和BBSA1(SEQIDNO:30)具有顯著少的螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋蛋白的超螺旋(巻曲螺旋)來(lái)自于一般記為k^fe/g入的特征性七肽重復(fù)序列，"和d位殘基一般為疏水殘基，剩余位置一般為帶電或極性殘基。模式識(shí)別程序(MARCOIL(Delorenzi和Speed,2002)、COILS(Lupas等人，199l))在Xenospiral[GB12184-PA](SEQIDNO:l)、Xenospira2[GB12348-PA](SEQIDNO:3)、Xenospira3[GB17818-PA](SEQIDNO:5)和Xenospira4[GB19585-PA](SEQIDNO:7)(MARCOIL:表5，COILS:圖4)，以及BBF1(SEQIDNO:22)、BBF2(SEQIDNO:24)、BBF3(SEQIDNO:26)、BBF4(SEQIDNO:28)、BAFl(SEQIDNO:40)、BAF2(SEQIDNO:42)、BAF3(SEQIDNO:44)、BAF4(SEQIDNO:46)、GAF1(SEQIDNO:56)、GAF2(SEQIDNO:58)、GAF3(SEQIDNO:60)、GAF4(SEQIDNO:62)和MalFl(SEQIDNO:72)(MARCOIL:表3)中鑒定出無(wú)數(shù)的巻曲螺旋典型的七肽重復(fù)。蜜蜂絲蛋白中一種新的巻曲螺旋序列的鑒定在Xenospiral[GB12184-PA]、Xenospira2[GB12348-PA]、Xenospira3[GB17818-PA]、Xenospria4[GB19585-PA]序列中鑒定出的七肽氨基酸殘基重復(fù)每個(gè)都高度指示一種巻曲螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)(置信水平見(jiàn)表5)。發(fā)現(xiàn)的七肽數(shù)目眾多并且連續(xù)暗示該蛋白采取一種非常規(guī)則的結(jié)構(gòu)。在兩種蜜蜂蛋白中鑒定出了重疊的多肽Xenospiral的主要巻曲螺旋區(qū)包括有3個(gè)殘基偏移的重疊七肽，接著有5個(gè)殘基的空隙，然后是4個(gè)連續(xù)的七肽；Xenospira2整個(gè)巻曲螺旋區(qū)有多個(gè)重疊七肽，有一個(gè)單個(gè)偏移和4個(gè)殘基偏移(相當(dāng)于3個(gè)殘基偏移)。主要七肽不同位置的氨基酸組成顯示在表6的第一欄，重疊七肽的位置顯示在鄰近的欄里。表5.MARCOIL(Delorenzi和Speed，2002)模式識(shí)別算法預(yù)測(cè)的鑒定絲蛋白中以巻曲螺旋存在的殘基百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>令人驚奇的是當(dāng)集中起來(lái)看時(shí)主要七肽具有新穎的組成——在"疏水"七肽位a和c/具有非同尋常高含量的丙氨酸(見(jiàn)表6和圖5)。另外，很大比例的七肽在同一個(gè)七肽內(nèi)部的a和d兩個(gè)位置都是丙氨酸(Xenospiral[GB12184-PA]中33%;Xenospira2[GB12348-PA]中36%;Xenospira3[GB17818-PA]中27%以及Xenospira4[GB19585-PA]中38%;見(jiàn)表6和7)。表6.蜜蜂絲蛋白巻曲螺旋區(qū)不同七肽位置每種氨基酸殘基數(shù)目的總結(jié)。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表7.蜜蜂絲蛋白七肽中丙氨酸殘基的總結(jié)。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>PROFsec預(yù)測(cè)，NNPredict的預(yù)測(cè)顯示在括號(hào)中。圖6和圖7總結(jié)了膜翅目絲巻曲螺旋區(qū)中不同七肽位置的氨基酸組成。如上所述，七肽內(nèi)的位置具有新穎的組成——蜜蜂和螞蟻絲的"疏水"七肽位置"和"包括非常高水平的丙氨酸(平均58%)以及高水平的極性殘基(平均21%)，相對(duì)于其他巻曲螺旋來(lái)說(shuō)。此外，e位非同尋常的小并疏水(表8、圖7)。該位置在七肽地形上位于"位殘基鄰近。a和"位殘基的組成相似性暗示該絲采取每個(gè)a螺旋三個(gè)核心殘基的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)。核心中三個(gè)殘基核心比兩個(gè)殘基貢獻(xiàn)更大的疏水界面(Deng等人，2006)——這一特征將有助于巻曲螺旋的形成和穩(wěn)定性。此外，集中看來(lái)七肽內(nèi)6、c、e、/和g位比以前確定的蛋白巻曲螺旋區(qū)一般更為疏水，極性更小且?guī)щ姼?見(jiàn)圖7，表8和9)。因此，盡管歷史上認(rèn)為有刺的膜翅目昆蟲(chóng)絲的螺旋含量是甘氨酸含量降低和酸性殘基成分的增加導(dǎo)致的(RudallandKenchington,1971)，我們發(fā)現(xiàn)并非甘氨酸/酸性殘基決定了新穎的絲結(jié)構(gòu)，而是多肽鏈中丙氨酸殘基的位置決定的。表8.直系同源膜翅目絲蛋白和綠草蜻蛉絲蛋白(MalFl)的每個(gè)七肽位的平均大小和疏水性顯示a、d和e位(核心)比其他位置更小且更疏水。有些例子中，b位(部分浸水)也小且疏水。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實(shí)施例6-蜜蜂絲蛋白似乎是廣泛交聯(lián)的蜜蜂絲蛋白都包括高含量的賴(lài)氨酸(6.5%-16.3%)。比較測(cè)定的蜜蜂絲氨基酸組成和鑒定的絲蛋白的序列顯示賴(lài)氨酸殘基數(shù)目的大量不匹配，在絲中檢測(cè)到的賴(lài)氨酸比預(yù)期的要少很多(圖2和3)。這暗示絲中賴(lài)氨酸殘基被修飾了，所以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸分析不能鑒定出來(lái)。已知賴(lài)氨酸形成多種交聯(lián)或者被賴(lài)氨酸氧化酶催化的酶交聯(lián)，或者糖化賴(lài)氨酸殘基產(chǎn)生的非酶交聯(lián)(Reiser等人，1992)。蜜蜂和熊蜂絲氨基酸分析中賴(lài)氨酸的低代表性與存在的賴(lài)氨酸交聯(lián)一致。表9.絲蛋白巻曲螺旋區(qū)不同七肽位置每類(lèi)氨基酸中殘基的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>共價(jià)交聯(lián)的蛋白SDS聚丙烯酰胺膠電泳(PAGE)預(yù)期交聯(lián)復(fù)合體的分子量遷移。我們對(duì)晚末齡蜜蜂唇腺蛋白SDSPAGE并測(cè)量相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記的絲蛋白遷移。每個(gè)鑒定的絲蛋白單體都觀(guān)察到了相應(yīng)的帶，然而含有這些蛋白的高分子量帶也存在，如在交聯(lián)系統(tǒng)中所預(yù)期的那樣(圖8)。如上所述，蜜蜂唇腺包括有組織和無(wú)組織絲蛋白的混合物。觀(guān)察到的交聯(lián)蛋白可能相應(yīng)于該腺的前端區(qū)蛋白群，該絲即從那里擠出。有理由推測(cè)細(xì)胞外蜜蜂絲包括大量高比例交聯(lián)蛋白，比在所有階段唾液腺絲蛋白異源混合物中觀(guān)察到的比例要高。鍵似乎不是半胱氨酸交聯(lián)，因?yàn)檫€原性處理對(duì)該絲沒(méi)有影響，且鑒定的絲蛋白中包括很少或沒(méi)有半胱氨酸殘基。實(shí)施例7-真針尾類(lèi)絲蛋白與其他絲蛋白顯著不同真針尾類(lèi)絲與其他所描述的絲基因在氨基酸組成(表10)、涉及蛋白的分子量、二級(jí)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)(表11和12)方面顯著不同。鱗翅類(lèi)絲主要由小氨基酸殘基丙氨酸、絲氨酸和甘氨酸組成(例如家蠶，表io)，并且支配性的二級(jí)結(jié)構(gòu)是廣泛的e片層。粉蝶盤(pán)絨繭蜂(。to"g/o縦rato)含有大量天冬酰胺和絲氨酸-大量的后一殘基是鱗翅目絲膠蛋白(絲膠)的特征(表IO)。粉蝶盤(pán)絨繭蜂(Coto/"g/omerato)的絲蛋白模型并沒(méi)有在二級(jí)結(jié)構(gòu)中鑒定出螺旋或巻曲螺旋。相比之下，蜜蜂、螞蟻和草蜻蛉的絲富含丙氨酸(表IO)，包括形成巻曲螺旋的高水平的螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)。表10.不同昆蟲(chóng)絲的氨基酸組成，最多的殘基以黑體顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表ll.昆蟲(chóng)絲之間的不同<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>四種膜翅目物種絲蛋白巻曲螺旋區(qū)支序分析(圖9)暗示該基因在真針尾類(lèi)從寄生蜂分化前由共同的袓先進(jìn)化而來(lái)。該絲的序列廣泛分化，我們僅能比對(duì)組成每個(gè)蛋白巻曲螺旋區(qū)的210個(gè)氨基酸。此處提供的每個(gè)絲蛋白巻曲螺旋區(qū)之間的氨基酸序列同源性顯示在表13，且相應(yīng)區(qū)的DNA同源性顯示在表14。盡管所述的蛋白質(zhì)氨基酸含量(特別高水平的丙氨酸)和三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，主要氨基酸序列的同源性非常低。事實(shí)上，編碼瑪草蛉絲蛋白的基因是獨(dú)立進(jìn)化的，因此絲蛋白序列不能和膜翅目序列相比對(duì)。這表明氨基酸的同源性可出現(xiàn)相當(dāng)大的變化，而不影響該蛋白的生物功能。支序分析預(yù)測(cè)真針尾蜂的絲包括螞蟻和蜜蜂絲相關(guān)蛋白，盡管這些蛋白與此處描述的蛋白有相似的組成和結(jié)構(gòu)，它們具有高度分化的主序列。此處提供的絲蛋白氨基酸序列(圖10)和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，然而，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有合理水平序列同源性的(例如絲蛋白序列長(zhǎng)度上不大于30%同源性)任何現(xiàn)有技術(shù)蛋白。表13.螞蟻和蜜蜂中纖維蛋白巻曲螺旋區(qū)蛋白序列間同源性百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表14.螞蚊和蜜蜂中纖維蛋A編碼巻曲螺旋區(qū)核苷酸序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>編碼這些絲蛋白(圖ll所提供的)的開(kāi)放讀碼框按上述方法進(jìn)行相似的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。鑒定出的僅有的相關(guān)分子是作為蜜蜂基因組計(jì)劃的一部分發(fā)表的(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/bee)。蜜蜂基因組計(jì)劃已經(jīng)預(yù)測(cè)了開(kāi)放讀碼框，然而并沒(méi)有提示編碼蛋白的功能。此外，對(duì)于任何這些分子，沒(méi)有證據(jù)表明曾經(jīng)產(chǎn)生過(guò)包括該mRNA開(kāi)放讀碼框的多核苷酸。編碼Xenospiral、Xenospira2、Xenospira3和Xenospira4的基因包括一個(gè)覆蓋整個(gè)單開(kāi)放讀碼框的外顯子，而編碼Xenosin的基因包括至少一個(gè)內(nèi)含子(見(jiàn)圖12)。實(shí)施例8-絲蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)編碼本發(fā)明絲蛋白的植物表達(dá)載體可由置于包括卡那霉素抗性基因(NptII)的雙元載體骨架中CaMV35S啟動(dòng)子下游的編碼所述蛋白的重組核酸分子(例如SEQIDNO's:11到21、31到39、48到55、64到71、74或75所提供的任何一條多核苷酸)組成。對(duì)于包括SEQIDNO's11、13、15、17、19、31、33、35、37、48、50、52、54、64、66、68、70或74中任一條的多核苷酸，構(gòu)建物可進(jìn)一歩包括信號(hào)肽編碼區(qū)，如擬南芥液泡堿性幾丁質(zhì)酶信號(hào)肽，其置于編碼該絲蛋白序列的框架內(nèi)或上游。在轉(zhuǎn)化到擬南芥中前通過(guò)電穿孔將載有編碼多肽絲蛋白的構(gòu)建物分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。下胚軸轉(zhuǎn)化法可用于轉(zhuǎn)化擬南芥，其可在包括卡那霉素培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基上選擇存活植株。重生體中根形成后，轉(zhuǎn)移到土壤中建立一代轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化過(guò)程的驗(yàn)證可通過(guò)PCR篩選完成。多核苷酸的摻入和表達(dá)通過(guò)PCR、Southern印跡分析和/或胰蛋白酶切表達(dá)蛋白的LC/MS測(cè)定。同一載體可提供兩種或兩種以上不同絲蛋白編碼構(gòu)建物，或每個(gè)編碼一種不同蛋白的許多不同載體可轉(zhuǎn)化到植物中。作為植物表達(dá)的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例，啟動(dòng)子優(yōu)化版的AmelF4(Xenospira4)(SEQIDNO:76)克隆到pET14b(Novagen)產(chǎn)生pET14b-6xHis:F4op，形成蛋白N端帶有6x組氨酸的框內(nèi)翻譯融合蛋白。編碼蛋白"6x組氨酸:F4op"的序列克隆到pVEC8(Wang等人，1992)，置于CaMV35S啟動(dòng)子和ocs多腺苷酸化調(diào)節(jié)元件的控制之下，產(chǎn)生pVEC8-35S-6xHis:F4op-ocs。pET14b-6xHis:F4op轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)E.coli中，且pVEC8-35S-6xffis:F4叩通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。從抗生素抗性co//(誘導(dǎo)表達(dá))和煙草葉中獲得的蛋白分離并使用四組氨酸抗體(Qiagen,Karlsrule,Germany)進(jìn)行western印跡分析檢測(cè)?？蛰d體pET14b和pVEC8-35S-ocs用于相應(yīng)的宿主背景中作為負(fù)對(duì)照。如圖13所示，這些實(shí)驗(yàn)獲得了能產(chǎn)生Xenospira4(AmelF4)蛋白的植物。實(shí)施例9-絲蛋白的發(fā)酵和純化蜜蜂基因AmelFl-F4(分別為Xenospiral到4)和草蜻蛉MalFl基因通過(guò)PCR擴(kuò)增并克隆到pET14b表達(dá)載體(Novagen,Madison,WI)后構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建物。產(chǎn)生的表達(dá)質(zhì)粒電穿孔到E.coliBL21(DE3)Rosetta細(xì)胞中并在含有氨節(jié)青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。單集落接種到包括氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基然后在37。C生長(zhǎng)過(guò)夜。通過(guò)離心收集細(xì)胞并用洗滌劑(Bugbuster,Novagen)溶解。包涵體廣泛洗滌并重溶入6M胍鹽中。該過(guò)程產(chǎn)生95%以上純度的蜜蜂蛋白混合物和50%以上純度的草蜻蛉MalFl蛋白混合物。通?？色@得達(dá)到50%產(chǎn)量的濕重大腸桿菌細(xì)胞片狀沉淀，表明通過(guò)這種方法可容易的表達(dá)該蛋白。溶解的蜜蜂重組蛋白加到按制造商說(shuō)明制備的Talon樹(shù)脂柱上。然后通過(guò)100mMTris.HCL，150mMpH8咪唑洗脫。實(shí)施例10-絲蛋白加工成線(xiàn)蜜蜂和草蜻蛉絲蛋白通過(guò)多種方法(見(jiàn)圖14)使用下述歩驟很容易制作成線(xiàn)。晚末齡意大利蜂唾液腺前段在磷酸緩沖鹽溶液中分離并移到一滴緩沖液中的平面內(nèi)。用鑷子夾住該段的兩端。一端以恒定的速率抬離緩沖液并和另一端分離。這樣可以拉出很好的迅速在空氣中固化的線(xiàn)。蜜蜂和草蜻蛉幼蟲(chóng)重組絲蛋白脫水或濃縮后形成線(xiàn)或片層。例如，通過(guò)將可溶蛋白滴入丁醇溶液中或通過(guò)在Talon樹(shù)脂柱上濃縮。線(xiàn)的獲得也可通過(guò)蜜蜂或草蜻蛉重組絲蛋白和有機(jī)溶劑(如己垸)混合以在界面上以正確的構(gòu)象濃縮，然后加入試劑從界面上排除(如丁醇)。通過(guò)這一過(guò)程形成的線(xiàn)與土絲具有相似的FT-IR光譜，表明它們包括相同的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)。此處描述的其他物種的絲蛋白也可通過(guò)這一程序加工。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明可進(jìn)行許多改變和/或修飾，如具體實(shí)施方式中所示的，而并不脫離本發(fā)明的精神或范圍，如此處廣泛描述的。因此，本實(shí)施方式應(yīng)全面理解，作為說(shuō)明而不是限制。所有上述討論的出版物都完整的并入此處。本說(shuō)明書(shū)包括的任何所討論的文件、文字記錄、材料、裝置、物品之類(lèi)的目的僅是提供本發(fā)明的上下文環(huán)境。并不因?yàn)槠浯嬖谟诒旧暾?qǐng)每項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前而被當(dāng)作承認(rèn)這些事項(xiàng)的任何一項(xiàng)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公知常識(shí)。9S:ra八j3Sipress3"asppv3問(wèn)onis[OOO。TP朋.￡>八BptpB入"3ISO66S-l78S:Z￡ZA§op!g呵tw3iow.f(￡661)'0"PubSpire'g}soh'6i7廿乙-6Et^:9IBwno〖叫工(Z66I)'3'"Hw^ptra'5p!uucooj^'J3s!9"aA[MBqs'TTCIsp!n。.￡^-￡17^樸"I。詔.f(0i6I)'(TO'qosun叢puB.g.s'ireuraip39NVIM鄉(xiāng)!罕。'ss3Jdjj]A[79￡-81￡dd力i。a_gu!ss3。owpqnqpis!al叩B:redmsu0pEK)idx3(8861).3.<3諷qpunrapuB'了fpueipicPI^'i79lH9n:ZSZ9，。s(1661)'〖WSPTO'W一auB八"vsb—'urep鄉(xiāng)iuv早ss但6"-S"dd,p八(hz柳sptrewuphold'p3)yCxjs!uiOTpoyg[。Aysu9tp;iduio;3iq(厶961),PNT^SIIBPn"HPUB'JsBoni.61^-6￡￡:乙.10!3T(0961).D.S朋iuspire.g'j;r叢BqsSB3tr['808寸08:08Boysuivjo《岡oos同3。iouio呵叫}josiBuuy(乙g61)surepyp朋i，uo人u噴Bi'60乙40S:S6巧3人sd(8861)'AV'3uoAim，，.ZSH厶r巾k.p舊1。w,f(0661)M3§p!jSubipire.33u叫oo"9.a岡I9U^99:6,山3tpo!gpssiq(6乙61)'"H'WJJ0P!ABaP現(xiàn).a'H"raiP加to""H'HmnqdsH卞an-"ZXI:8￡^i岡uiaipo！8(6661).JS["is!30priB'"q3叢"fmreui3umps'工3mqtupH"qo9p舊spu3j工(站61)'SBUiBifereHamj。n^s(900。'IA[nqpire'^'nqoBqu3nB2"aJ9Z叩g"。3usqz"〖nn"人3xraag[:jjBc[A3oio!s/Cqtipirny(^s!ui3iioo!g9八卩WBdiuo;3(zoo乙)'OPub'i';3§!8.13'0tr厶乙:SK'R8'p]Ai〖(K)OZ)'TCIuBdr^puB'd'cn^FX"31W-6n:Wio舊PPN[r(A96I)'工'a'3suppvRudallK.M.(1962)InComparativeBiochemistry(Ed.ByFlorkinMandMasonHS)Vol4,pp.297-435.AcademicPress,NewYork.RudallK.M.andKenchingtonW.(1971)AnnualReviewsinEntomology16:73-96.Silva-ZacarinE.C.M.,SilvaDeMoraesR丄.M.andTabogaS.R.(2003)J.Biosci.6:753-764.SpeilgerP.E.(1962)AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica,55:69-77.WangM.B.,LiZ.Y.etal.(1998).ActaHort.461:401-407.YamadaH.,ShigesadaK.,IgarashiY.,TakasuY.,TsubouchiK.andKatoY.(2004)Int.J.WildSilkmothandSilk9:61-66.權(quán)利要求1、一種基本上純化的和/或重組的絲多肽，其中至少該絲多肽的一部分具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列ak^e/g，并且其中至少25%的"和d位氨基酸是丙氨酸殘基。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的該多肽部分包括至少10拷貝的七肽序列Wafe/g，并且至少25%的fl、d和e位氨基酸是丙氨酸殘基。4、根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)所述的多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:56以及SEQIDNO:57所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:56以及SEQIDNO:57中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。5、根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)所述的多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:58以及SEQIDNO:59所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:58以及SEQIDNO:59中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。6、根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)所述的多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:60以及SEQIDNO:61所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:60以及SEQIDNO:61中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。7、根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)所述的多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:62以及SEQIDNO:63所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:62以及SEQIDNO:63中任何一條或多條具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。8、根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)所述的多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:72或SEQIDNO:73所提供的氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:72和/或SEQIDNO:73具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。9、一種基本上純化的和/或重組的絲多肽，其包括選自下述的序列i)SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO以及SEQIDNO:30所提供的任何一條氨基酸序列；ii)與SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO以及SEQIDNO:30具有至少30%同源性的氨基酸序列；以及iii)i)或ii)的生物活性片段。10、根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項(xiàng)所述的多肽，其可從膜翅目昆蟲(chóng)或脈翅目昆蟲(chóng)的一個(gè)物種中純化獲得。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述的膜翅目昆蟲(chóng)的物種為意大利蜂jp/sme〃i/^ra、黃《京蟲(chóng)義(9gcop/zy〃as附fln3gtft"a、牛頭犬蟲(chóng)義il^r附ec/a/on'cata或授^b乂熊蜂萬(wàn)owZwsfm"e欲&。12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述的脈翅目昆蟲(chóng)的物種為瑪草蛉13、根據(jù)權(quán)利要求1到12中任何一項(xiàng)所述的多肽，其與至少一種其他多肽融14、一種編碼絲多肽的分離的和/或外源多核苷酸，其中至少絲多肽的一部分具有巻曲螺旋結(jié)構(gòu)。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:64以及SEQIDNO:65所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼如權(quán)利要求1到4或10到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:64以及SEQIDNO:65中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。16、根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:66以及SEQIDNO:67所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼如權(quán)利要求1到3、5或10到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:66以及SEQIDNO:67中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。17、根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:68以及SEQIDNO:69所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼如權(quán)利要求1到3、6或10到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:68以及SEQIDNO:69中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。18、根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71以及SEQIDNO:76所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼如權(quán)利要求1到3、7或10到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71以及SEQIDNO:76中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。19、根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其中該多核苷酸包括選自下述的序列i)SEQIDNO:74或SEQIDNO:75所提供的核苷酸序列；ii)編碼如權(quán)利要求1到3、8或10到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:74和/或SEQIDNO:75具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。20、一種分離的和/或外源多核苷酸，該多核苷酸包括選自下述的序列-i)SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21以及SEQIDNO:39所提供的任何一條核苷酸序列；ii)編碼如權(quán)利要求1到3或9到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列，iii)與SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21以及SEQIDNO:39中任何一條或多條具有至少30%同源性的核苷酸序列，以及iv)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與i)到iii)中任何一條雜交的序列。21、包括至少一種如權(quán)利要求14到20中任何一項(xiàng)所述的多核苷酸的載體。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體為表達(dá)載體。23、包括至少一種如權(quán)利要求14到20中任何一項(xiàng)所述的多核苷酸，和/或至少一種如權(quán)利要求21或22所述的載體的宿主細(xì)胞。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母或植物細(xì)胞。25、制備如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的方法，該方法包括在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求23或24所述的宿主細(xì)胞，或者如權(quán)利要求22所述的載體，以及回收所表達(dá)的多肽。26、包括外源多核苷酸，編碼至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物。27、包括外源多核苷酸，編碼至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。28、特異性結(jié)合如權(quán)利要求1到12中任何一項(xiàng)所述的多肽的抗體。29、包括至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的絲纖維。30、根據(jù)權(quán)利要求29所述的絲纖維，其中至少一些所述的多肽是交聯(lián)的。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的絲纖維，其中至少所述的多肽的一些賴(lài)氨酸殘基是交聯(lián)的。32、包括至少兩種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽的共聚物。33、根據(jù)權(quán)利要求32所述的共聚物，其包括如權(quán)利要求4所述的多肽，如權(quán)利要求5所述的多肽，如權(quán)利要求6所述的多肽，以及如權(quán)利要求7所述的多肽。34、根據(jù)權(quán)利要求33所述的共聚物，其進(jìn)一歩包括如權(quán)利要求9所述的多肽。35、根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的共聚物，其中至少一些所述的多肽是交聯(lián)的。36、根據(jù)權(quán)利要求35所述的共聚物，其中至少所述的多肽的一些賴(lài)氨酸殘基是交聯(lián)的。37、包括至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽，如權(quán)利要求29到31中任何一項(xiàng)所述的絲纖維和/或如權(quán)利要求32到36任何一項(xiàng)所述的共聚物的產(chǎn)品。38、根據(jù)權(quán)利要求37所述的產(chǎn)品，其中該產(chǎn)品選自個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、紡織品、塑料制品或生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品組成的群組。39、包括至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽，如權(quán)利要求29到31中任何一項(xiàng)所述的絲纖維和/或如權(quán)利要求32到36任何一項(xiàng)所述的共聚物，以及一種或一種以上可接受的載體的組合物。40、根據(jù)權(quán)利要求39所述組合物進(jìn)一步包括藥物。41、用作藥物、或者在醫(yī)療器械或化妝品中使用的如權(quán)利要求39所述組合物。42、包括至少一種如權(quán)利要求14到20任何一項(xiàng)所述的多核苷酸，以及一種或一種以上可接受的載體的組合物。43、一種治療或預(yù)防疾病的方法，該方法包括給予包括治療或預(yù)防該疾病的藥物和藥用載體的組合物，其中所述的藥用載體選自至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽，如權(quán)利要求29到31中任何一項(xiàng)所述的絲纖維和/或如權(quán)利要求32到36任何一項(xiàng)所述的共聚物。44、至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽，如權(quán)利要求29到31中任何一項(xiàng)所述的絲纖維和/或如權(quán)利要求32到36任何一項(xiàng)所述的共聚物，以及藥物，在制備治療或預(yù)防疾病的藥物中的用途。45、包括至少一種如權(quán)利要求1到13中任何一項(xiàng)所述的多肽，至少一種如權(quán)利要求14到20任何一項(xiàng)所述的多核苷酸，至少一種如權(quán)利要求21或22所述的載體，至少一種如權(quán)利要求29到31中任何一項(xiàng)所述的絲纖維和/或如權(quán)利要求32到36任何一項(xiàng)所述的共聚物的試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供絲蛋白，以及編碼這些蛋白的核酸。本發(fā)明也提供合成絲蛋白的重組細(xì)胞和/或有機(jī)體。本發(fā)明的絲蛋白可有多種用途，如用于生產(chǎn)個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、塑料制品、紡織品和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。文檔編號(hào)C07H21/04GK101321777SQ200680045666公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2006年10月4日優(yōu)先權(quán)日2005年10月5日發(fā)明者A·斯里斯坎瑟,H·特魯曼,P·M·坎貝爾,S·韋斯曼,T·D·薩瑟蘭,V·S·哈里托斯申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)工業(yè)研究組織