一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽及其制備方法和用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽及用途，其特征在于：該抗氧化肽為五肽化合物，氨基酸序列為T(mén)yr-Leu-Met-Ser-Arg，ESI-MS檢測(cè)給出分子量651.77Da（[M+H]+652.45Da）。該抗氧化肽制備方法包括勻漿、酶解、超濾和層析等步驟。制備得到的高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用。Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有顯著地抗氧化活性，可用作藥品、保健食品或食品添加劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物活性肽及其制備方法和用途，尤其涉及一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002]HjtXPseudosciBeim crocea),又名黃魚(yú)、大黃花魚(yú)，為我國(guó)傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”(大黃魚(yú)、小黃魚(yú)、帶魚(yú)、烏賊)之一，是我國(guó)近海名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。但因過(guò)度捕撈，野生資源破壞嚴(yán)重。近年來(lái)，隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的逐漸成熟，網(wǎng)箱、圍網(wǎng)與土池等多種養(yǎng)殖模式均在大黃魚(yú)養(yǎng)殖中得以應(yīng)用，大黃魚(yú)的產(chǎn)量逐年增加，大黃魚(yú)的精深加工技術(shù)受到日益重視。
[0003]但是， 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，以大黃魚(yú)魚(yú)肉為原料，利用酶解技術(shù)制備大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的工藝研究處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性魚(yú)肉抗氧化肽及其應(yīng)用更是未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽，該抗氧化肽活性強(qiáng)，安全無(wú)毒副作用，易于消化吸收，可有效清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用。
[0005]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的制備方法。
[0006]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明為解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為T(mén)yr-Leu-Met-Ser_Arg(SEQ N0.1D:1),ESI_MS檢測(cè)給出分子量為 651.77 Da ([M+H]+ 652.45 Da)。
[0008]本發(fā)明為解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
1)將大黃魚(yú)魚(yú)肉絞碎，按照料液比1g:8?12 mL加入蒸餾水，調(diào)pH值至6.5?7.5，于45?55°C保溫 10?15 min;
2)按照大黃魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)量的0.8?1.2%加入木瓜蛋白酶，于45飛5°C溫度下酶解3?5 h ；將上述酶解液調(diào)pH值至9.(Γ10.0，按照大黃魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)量的1.5^2.0%加入堿性蛋白酶，于45?55 °C溫度下酶解3?5 h ；
3)將酶解液加熱到90?95°C滅活10?15min, 5000^6000 r/min離心15?25 min，取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化肽。
[0009]作為改進(jìn)，所述步驟3)的超濾和層析的具體過(guò)程為:
超濾:將上清液調(diào)至pH 6.5?7.5，用截留分子量3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾處理，根據(jù)羥基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解物；
層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.45?0.55 mol/L和0.90?1.10 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成1(T20 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)凝膠柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化，根據(jù)羥基自由基清除活性得1個(gè)高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Argo
[0010]優(yōu)選，所述陰離子交換樹(shù)脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G_15。
[0011]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量15?20 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C-18column (4.6 X 250 mm);柱溫為30 °C Γ流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:(Tl00 min乙腈濃度從0勻速升至100% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。
[0012]本發(fā)明為解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的應(yīng)用，其特征在于Tyr-Leu-Met-Ser-Arg對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用；Tyr-Leu-Met-Ser-Arg具有顯著的抗氧化活性,可以作為藥品、保健食品和食品添加劑進(jìn)行應(yīng)用。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明選用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶作為酶解用酶，通過(guò)生物酶解法同時(shí)融合超濾分級(jí)和色譜精制，制得的多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性；與化學(xué)合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明制得的抗氧化肽具有抗氧化活性強(qiáng)、易于消化吸收和安全無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可用作藥品、保健食品或食品添加劑。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是本發(fā)明的大黃魚(yú)魚(yú)肉超濾酶解物的陰離子交換樹(shù)脂(DEAE-52纖維素)層析圖；
圖2是本發(fā)明的大黃魚(yú)魚(yú)肉酶解物陰離子交換層析分離組分(Fr.A、Fr.C和Fr.D)的羥基自由基清除率圖；
圖3是本發(fā)明的陰離子交換層析分離組分(Fr.C)的葡聚糖凝膠G-15層析圖；
圖4是本發(fā)明的凝膠層析所分離各組分的羥基自由基清除率圖；
圖5是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物(Fr.C_l)的RP-HPLC圖；
圖6是本發(fā)明的Tyr-Leu-Met-Ser-Arg的質(zhì)譜(ES1-MS)圖和結(jié)構(gòu)式；
圖7是本發(fā)明的Tyr-Leu-Met-Ser-Arg的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016]實(shí)施例1:一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:大黃魚(yú)魚(yú)肉〃酶解〃酶解物〃超濾〃離子交換層析〃凝膠過(guò)濾層析〃高效液相色譜制備〃抗氧化肽。
[0017]1)將大黃魚(yú)魚(yú)肉絞碎，按照料液比1 g:12 mL加入蒸餾水，調(diào)pH值至7.0，于50°C保溫10 min。
[0018]2)按照大黃魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)量的1.0%加入木瓜蛋白酶，于50°C酶解4 h ;將上述酶解液調(diào)pH值至9.5，按照大黃魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)量的2.0%加入堿性蛋白酶，于50°C酶解4 h。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證，其酶解產(chǎn)物成分穩(wěn)定，具有很高的重復(fù)性。
[0019]3)將酶解液加熱到90°C滅活10 min,6000 r/min離心15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化肽。
[0020]①超濾:將上清液調(diào)至pH 7.0，采用截留分子量3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾處理，根據(jù)羥基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解物；
②DEAE-52纖維素陰離子交換層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成25mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物(Fr.C)(圖1和圖2)；
③凝膠層析:將上述離子交換層析酶解物(Fr.C)用雙蒸水配成15 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠G15柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物(Fr.C-1)(圖3和圖4);
④高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物(Fr.C-1)用雙蒸水配成50 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化(條件:進(jìn)樣量20 μ L ;色譜柱為Zorbax SBC-18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);柱溫為30°C ;流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0-100 min乙腈濃度從0勻速升至100% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，根據(jù)羥基自由基清除活性得1個(gè)高活性抗氧化肽(圖5)；
⑤結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集羥基自由基清除活性最高的1個(gè)抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定氨基酸序列為T(mén)yr-Leu-Met-Ser-Arg，ES1-MS檢測(cè)給出分子量為651.77 Da ([M+H] +652.45 Da)(見(jiàn)圖 6)。
[0021]將上述制得的大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、輕基自由基清除實(shí)驗(yàn)、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)、超氧陰尚子自由基清除實(shí)驗(yàn)和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Tyr-Leu-Met-Ser_Arg對(duì)DPPH自由基(EC5Q 1.35 mg/mL)、輕基自由基(EC5Q 1.92 mg/mL) > ABTS自由基(EC5。0.31 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5Q0.45 mg/mL)具有良好的清除作用；同時(shí)，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg亦顯示出良好的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用(圖7)。
[0022]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種大黃魚(yú)肉肉抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為T(mén)yr-Leu-Met-Ser-Arg, ES1-MS 檢測(cè)分子量為 651.77 Da。
2.一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將大黃魚(yú)魚(yú)肉絞碎，按照料液比Ig:8?12 mL加入蒸餾水，調(diào)pH值至6.5?7.5，于45?55°C保溫 10?15 min ； 2)按照大黃魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)量的0.8?1.2%加入木瓜蛋白酶，于45飛5°C酶解3?5 h ;將上述酶解液調(diào)pH值至9.(Γ10.0，按照大黃魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)量的1.5?2.0%加入堿性蛋白酶，于45飛5°C酶解3?5 h ； 3)將酶解液加熱到90?95°C滅活10?15min, 5000^6000 r/min離心15?25 min，取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾和層析的具體過(guò)程為: 超濾:將上清液調(diào)至PH 6.5?7.5，采用分子量3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾處理，根據(jù)羥基自由基清除活性，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解物； 層析:將上述超濾酶解物用雙蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.45?0.55 mol/L和0.90?1.10 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成1(T20 mg/mL的溶液，經(jīng)過(guò)凝膠柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用羥基配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化肽Tyr-Leu-Met-Ser-Arg0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換樹(shù)脂為DEAE-52纖維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15 ;所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量15?20 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C-18 column ;柱溫為30°C ;流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:(Tl00 min乙腈濃度從O勻速升至100% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。
5.一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽的用途,其特征在于:Tyr-Leu-Met-Ser-Arg用于藥品、保健食品或食品添加劑對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基的清除；或者，Tyr-Leu-Met-Ser-Arg用于藥品、保健食品或食品添加劑起到脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用的用途。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104250285SQ201410368760
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】王斌, 馬路凱, 遲長(zhǎng)鳳, 李濤 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院