本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)固相烷基化試劑，可應(yīng)用于細胞、組織、體液、毛發(fā)等提取蛋白質(zhì)中巰基的選擇性反應(yīng)及預(yù)處理。

背景技術(shù)：

在臨床上，為了對腫瘤進行確診，通常需要對病人進行穿刺獲得組織樣本，切片后再通過電子顯微鏡進行病理診斷，這種方法不僅耗時長(1-4天)，而且存在假陽性的風(fēng)險。利用分子分型方法對組織形態(tài)進行分類已經(jīng)引起廣泛的興趣，目前主要是通過mRNA轉(zhuǎn)錄表達譜或代謝組學(xué)方法。最近，Ruedi課題組結(jié)合壓力循環(huán)技術(shù)和SWATH技術(shù)發(fā)展了一種快速的、可重復(fù)性分析微量組織樣本的蛋白質(zhì)組分析方法，采用該方法分析9個腎癌病人的18種活體組織樣本，可重復(fù)定量2000多種蛋白質(zhì)，通過對獲得定量信息的蛋白質(zhì)進行分類可明顯區(qū)分來源于腫瘤的腎組織和健康的組織(Guo,T.,Kouvonen,P.,et al.Nat.Medicine.2015,doi:10.1038/nm.3807.)。

然而，由于該方法在樣本處理過程中由于難以去除，無法采用強的蛋白質(zhì)提取試劑(如SDS等表面活性劑)，因此難以實現(xiàn)蛋白質(zhì)組的深度覆蓋分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于蛋白質(zhì)預(yù)處理的固相烷基化試劑。該試劑不僅可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的高回收率捕獲，而且還能實現(xiàn)與其它小分子的快速分離，降低蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜程度。為了實現(xiàn)該目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

1)硅膠顆粒、無水甲苯、鹵代硅烷化試劑混合后，攪拌回流6-24小時，制備修飾ATRP引發(fā)劑的硅膠顆粒；

它們用量為：硅膠顆粒1-100g、無水甲苯10-600mL、鹵代硅烷化試劑0.1-12mL。鹵代硅烷化試劑可為溴代硅烷化試劑和/或氯代硅烷化試劑；

2)通過原子自由轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)(ATRP)在載體表面上引入甲基丙烯酸縮水甘油酯的反應(yīng)過程為：修飾ATRP引發(fā)劑的硅膠顆粒，甲醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯、ATRP催化劑及配體試劑混合后，除氣，回流反應(yīng)2-24小時制得含環(huán)氧基團的硅膠顆粒(Si-GMA)；

它們用量為：修飾ATRP引發(fā)劑的硅膠0.5-10g、甲基丙烯酸縮水甘油酯1-25mL、甲醇10-300mL，ATRP催化劑5-100mg、配體試劑0.01-0.3mL。ATRP催化劑可為鹵化亞銅(CuX)、鹵化亞鐵(FeX₂)或鹵化亞釕(RuX₂)中的一種或二種以上；配體試劑可為2,2’聯(lián)二吡啶(bpy)、N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亞乙基三胺、2-吡啶甲醛縮正丙胺或六甲基三乙基三胺中的一種或二種以上。

3)然后通過共價鍵合方式依次修飾上樹枝狀親水性化合物聚乙烯亞胺

(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的反應(yīng)過程為：

含環(huán)氧基團的硅膠顆粒(Si-GMA)表面引入親水活性反應(yīng)基團，具體步驟如下：

A.將Si-GMA分散于磷酸緩沖溶液中,加入PEI，攪拌反應(yīng)4-12小時；

其中采用PEI的終濃度范圍為1-100mg/mL；Si-GMA于磷酸緩沖溶液中的量為：Si-GMA 0.5-10g于磷酸緩沖溶液1-100mL中；

B.將碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶于甲醇和磷酸緩沖溶液混合體系中，加入修飾PEI的硅膠顆粒，室溫避光反應(yīng)6-12小時；

其中碘乙酸-N-琥珀酰胺酯加入量為硅膠加入質(zhì)量的1-1.5倍，溶劑體系中甲醇與磷酸緩沖溶液體積比為1/1-3/1。磷酸緩沖溶液濃度為0.01-0.1M,pH值為7-9。

4)將蛋白質(zhì)固相烷基化試劑應(yīng)用于細胞、組織、體液或毛發(fā)中一種或二種以上提取蛋白質(zhì)中巰基的選擇性反應(yīng)或預(yù)處理。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)對硅膠顆粒表面進行修飾，不僅可以提高活性單體的接枝容量，而且制備過程容易控制，重復(fù)性好；

2、采用PEI為改性試劑，不僅提高了顆粒表面的親水性，而且還可掩蓋雜化硅膠整體材料未反應(yīng)完的硅羥基；

3、采用碘乙酸-N-琥珀酰胺酯修飾表面基團，可以縮短修飾時間，提高制作通量；

4、制備的蛋白質(zhì)固相烷基化試劑，可以實現(xiàn)微量組織或細胞中蛋白質(zhì)原位預(yù)處理(包括烷基化、小分子干擾物去除、以及顆粒酶解)。

附圖說明

圖1、蛋白質(zhì)固相烷基化試劑的合成示意圖(a)及蛋白質(zhì)原位預(yù)處理示意圖(b)；

圖2、蛋白質(zhì)固相烷基化試劑的性能評價；

圖3、蛋白質(zhì)固相烷基化試劑應(yīng)用于微量細胞樣本的預(yù)處理；

圖4、蛋白質(zhì)固相烷基化試劑應(yīng)用于微量組織樣本的預(yù)處理。

具體實施方式

實施例1

1、ATRP引發(fā)劑的修飾：稱取4g硅膠，加入60mL甲苯和1.2mL 3-(三甲氧基硅烷基丙基)-2-溴代-2-甲基丙酯,混勻后，攪拌回流90℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，采用無水乙醇清洗3次。

2、環(huán)氧基團的修飾：稱取修飾ATRP引發(fā)劑的硅膠顆粒1.2g,加入28mL甲醇，2.65mL甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),0.0314mL N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亞乙基三胺,混勻后，通氮氣5min后，加入10mg CuCl和1.7mg CuCl₂，密封回流60℃反應(yīng)6h，制得Si-GMA顆粒。反應(yīng)完成后，分別采用甲醇，水清洗3次，然后加入過飽和EDTA溶液清洗至無色后，再用水、甲醇清洗，干燥后備用。

3、PEI的修飾：將制備的Si-GMA顆粒分散于50mM磷酸緩沖溶液(pH 8.0)中，加入1.0g PEI至終濃度為20mg/mL,50℃攪拌反應(yīng)4h后，分別用水和乙醇清洗5次，干燥備用。

4、稱取PEI修飾的硅膠顆粒10mg,加入1mg/mL碘乙酸-N-琥珀酰胺酯(溶劑為甲醇和磷酸緩沖溶液(pH 8.0)混合體系，溶劑體系中甲醇與磷酸緩沖溶液體積比為1/1)10mL,室溫避光振蕩反應(yīng)6h,然后分別用50mM磷酸緩沖鹽(pH 8.0)清洗3次，即制得蛋白質(zhì)固相烷基化試劑，即為試劑1

實施例2

1、ATRP引發(fā)劑的修飾：稱取10g硅膠，加入150mL甲苯和3mL 3-(三甲氧基硅烷基丙基)-2-溴代-2-甲基丙酯,混勻后，攪拌回流90℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，采用無水乙醇清洗3次。

2、環(huán)氧基團的修飾：稱取修飾ATRP引發(fā)劑的硅膠顆粒3g,加入50mL甲醇，5mL甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),0.1mL N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亞乙基三胺,混勻后，通氮氣5min后，加入50mg CuCl和8.5mg CuCl₂，密封回流60℃反應(yīng)6h，制得Si-GMA顆粒。反應(yīng)完成后，分別采用甲醇，水清洗3次，然后加入過飽和EDTA溶液清洗至無色后，再用水、甲醇清洗，干燥后備用。

3、PEI的修飾：將制備的Si-GMA顆粒分散于50mM磷酸緩沖溶液(pH 8.0)中，加入1.0g PEI至終濃度為20mg/mL,50℃攪拌反應(yīng)4h后，分別用水和乙醇清洗5次，干燥備用。

4、稱取PEI修飾的硅膠顆粒10mg,加入1mg/mL碘乙酸-N-琥珀酰胺酯(溶劑為甲醇和磷酸緩沖溶液(pH 8.0)混合體系，溶劑體系中甲醇與磷酸緩沖溶液體積比為1/1)10mL,室溫避光振蕩反應(yīng)6h,然后分別用50mM磷酸緩沖鹽(pH 8.0)清洗3次，即制得蛋白質(zhì)固相烷基化試劑，即為試劑2

實施例3

其它條件同上實施例1，ATRP催化劑變?yōu)镕eCl₂/FeCl₃,制備蛋白質(zhì)固相烷基化試劑，即為試劑3

實施例4

稱取1mg BSA,采用質(zhì)量濃度4％SDS配置成0.1mg/mL,然后依次進行90℃熱變性10min,加入25μM TCEP(磷酸三氯乙酯)56℃反應(yīng)1.5h,然后加入1mg實施例1制備的蛋白質(zhì)固相烷基化試劑1反應(yīng)1h，離心5min,采用體積濃度50％甲醇和50mM磷酸緩沖鹽(pH 8.0)依次清洗顆粒以除去蛋白表面吸附的SDS，加入1μg Trypsin(胰蛋白酶)紫外光輔助下酶解15min,離心取上清液，進行LC-MS分析，如圖2所示，通過匹配數(shù)據(jù)庫，測得BSA的序列覆蓋率為32％。

實施例5

取20μg HeLa細胞提取蛋白質(zhì)，依次進行90℃熱變性10min,加入25μM TCEP(磷酸三氯乙酯)56℃反應(yīng)1.5h,然后加入1mg實施例1制備的蛋白質(zhì)固相烷基化試劑2反應(yīng)1h，離心5min,采用體積濃度50％甲醇和50mM磷酸緩沖鹽(pH 8.0)依次清洗顆粒，加入1μg Trypsin(胰蛋白酶)紫外光輔助下酶 解15min,離心取上清液，進行LC-MS分析，如圖3所示，通過數(shù)據(jù)庫匹配，共鑒定1700種蛋白質(zhì)。

實施例6

稱取1mg鼠腦組織，通過組織勻漿提取蛋白質(zhì)，離心取上清后，90℃熱變性10min,加入25μM TCEP(磷酸三氯乙酯)56℃反應(yīng)1.5h,然后加入1mg實施例1制備的蛋白質(zhì)固相烷基化試劑3反應(yīng)1h，離心5min,采用體積濃度50％甲醇和50mM磷酸緩沖鹽(pH 8.0)依次清洗顆粒，加入1μg Trypsin(胰蛋白酶)紫外光輔助下酶解15min,離心取上清液，進行LC-MS分析，如圖4所示，通過數(shù)據(jù)庫匹配，共鑒定1100種蛋白質(zhì)。

本發(fā)明試劑可選擇性與蛋白質(zhì)上的巰基反應(yīng)，具有穩(wěn)定性高，操作簡單、反應(yīng)快速等優(yōu)點。與傳統(tǒng)的烷基化試劑相比，采用該試劑，蛋白質(zhì)可與其它小分子(如糖、鹽、表面活性劑、脂類等)實現(xiàn)快速分離，提高蛋白質(zhì)的純度，顯著降低樣本復(fù)雜程度。由于試劑表面親水性較好，可顯著提高蛋白質(zhì)或酶解產(chǎn)物的回收率，因此，該試劑適合于細胞、組織、體液、毛發(fā)等提取蛋白質(zhì)中巰基的選擇性反應(yīng)及預(yù)處理。