本案涉及石斛多糖領(lǐng)域，尤其涉及一種分離純化齒瓣石斛多糖的方法，以及對該多糖進行一級結(jié)構(gòu)鑒定的方法。

背景技術(shù)：

多糖是重要的生物活性大分子，有提高免疫力、抗炎、延緩衰老、抗氧化等功效。多糖所鏈接的大量親水性羥基，使其具有強吸水性、乳化性、高黏度性。

石斛為九大仙草之首，齒瓣石斛多糖有較好的提高免疫力、抗腫瘤等功效，其多糖含量豐富，高達35-42％。前期通過實驗發(fā)現(xiàn)，齒瓣石斛多糖與靈芝多糖相比，其抗腫瘤、提高免疫力功效更為顯著。目前石斛多糖的提取方法主要是采用水提法、回流提取法、超聲波/微波提取法、酶提取法、超高壓提取法等。但由于齒瓣石斛多糖粘性高，高活性多糖段分子量大，在分離純化以及結(jié)構(gòu)解析方面存在一定難度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分離提純齒瓣石斛均一多糖的方法，利用水提醇沉分離、凝膠柱純化等手段，能夠得到齒瓣石斛的均一多糖。

本發(fā)明的另一個目的，采用多光譜解析鑒定了齒瓣石斛均一多糖的骨架結(jié)構(gòu)。

為達上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

分離提純齒瓣石斛均一多糖的方法，將水提醇沉粗多糖先用分步醇沉方法進行分離，然后經(jīng)凝膠柱純化，得到齒瓣石斛的均一多糖。

其中采用分步醇沉方法進行分離包括：將粗多糖復(fù)溶于水，加酒精至50％進行乙醇醇沉，得到沉淀物，將該沉淀物去除，繼續(xù)加酒精至體系酒精70％，得到絮狀沉淀，該絮狀沉淀為50-70％醇沉粗多糖片段。50-70％醇沉粗多糖片段的純度在90％以上。

采用凝膠柱純化包括：將50-70％醇沉粗多糖片段復(fù)溶于水，用凝膠柱進行純化，用硫酸苯酚法跟蹤監(jiān)測收集，蒸發(fā)濃縮，透析，冷凍 干燥，得到凝膠柱分離純化過的均一多糖。其中優(yōu)選采用superdex-200凝膠柱進行純化；優(yōu)選收集對稱峰33-45管；優(yōu)選采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮時間40-80分鐘。

水提醇沉粗多糖可采用如下工藝：將齒瓣石斛在水中煎煮，并進行固液分離，所得液體為水提液；向水提液中加入乙醇醇沉，使體系內(nèi)乙醇濃度為70％-80％，得到粗多糖。

本發(fā)明還提供了一種齒瓣石斛均一多糖的一級結(jié)構(gòu)鑒定方法：

首先用HPGPC分析儀器、高效液相色譜儀、蒸發(fā)光散射檢測器ELSD測定均一多糖的分子量為1.94×10⁵Da；

然后將均一多糖甲基化衍生，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀與單糖標準品對照，測定單糖組成；單糖組成中甘露糖:葡萄糖的摩爾比為0.77:0.23；

最后通過核磁分析推斷糖苷鍵→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值為：1.46:1.74:1.00。核磁譜圖結(jié)構(gòu)分析如下：

根據(jù)碳譜信號，石斛多糖的異頭碳信號峰為δ101.3，通過de pt135圖譜，可以確定C6的信號峰為δ61.7；C2，C3，C4，C5的化學位移分布在δ70～80ppm區(qū)域內(nèi)；δ77.76信號峰應(yīng)歸屬于C4，由此推測出石斛多糖的鏈接方式可能為1,4-Man；

另外，在δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信號峰，應(yīng)歸屬于乙酸根的甲基和羰基信號，由此推斷在石斛多糖的多糖結(jié)構(gòu)中，C2，C3對應(yīng)的羥基可能由乙酸根取代；

在HSQC圖譜中可以看出，葡萄糖糖苷的異頭碳信號峰應(yīng)分布在101.2/4.7，而C4信號峰應(yīng)為79.1/4.07，其它C6的化學位分布著61-62.3ppm，C2，C3，C5的化學位移應(yīng)分布在70-77ppm之間，由此推斷石斛多糖存在→4)-Glc-(1→糖苷鍵；

對碳譜的δ99-103，δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信號峰進行積分，可以得到三個峰信號的積分比值為：1.02:1.12:3.22，由于δ99-103為異頭峰區(qū)域，積分值應(yīng)為→4)-man-(1→，→4)-2-o-acetyl-man-(1→和→4)-Glc-(1→糖苷鍵的總和，而δ20.3-21.0和δ172.9-173.9為→4)-2-o-acetyl-ma n-(1→糖苷鍵的特殊信號峰，且比值(1.02:1.12:)接近于1:1，而甘露糖 和葡萄糖的比例為0.77:0.23，因此可以推斷出糖苷鍵→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值應(yīng)為：1.46:0.74:1.00。

通過上述方法能夠純化得到純凈的均一多糖，分步醇沉完全可以代替纖維素柱分離，達到良好的效果，節(jié)省資源，省時省力；并且能夠?qū)υ摱嗵堑囊患壗Y(jié)構(gòu)準確鑒定，明確齒瓣石斛中的主要多糖為乙?；细事毒厶恰?/p>

附圖說明

圖1是樣品HPGPC圖；

圖2是單糖標準品譜圖；

圖3是樣品單糖組成圖；

圖4是樣品¹H NMR譜圖；

圖5是樣品¹³C NMR譜圖；

圖6是樣品HSQC譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和相關(guān)附圖來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1：通過以下步驟分離提純齒瓣石斛均一多糖：將齒瓣石斛在水中煎煮，并進行固液分離，得到水提液；在水提液中加入乙醇醇沉使體系內(nèi)乙醇濃度為70％，靜置過夜，得到粗多糖；將粗多糖復(fù)溶于水，使多糖完全溶解于水中，加酒精至50％進行乙醇醇沉，得到沉淀物，將該沉淀物去除，繼續(xù)加酒精至體系酒精70％，得到90％以上純度的50-70％醇沉粗多糖片段；將粗多糖片段復(fù)溶于水，用superdex-200進行純化，用硫酸苯酚法跟蹤監(jiān)測收集，收集對稱峰33-45管，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮50分鐘，透析，冷凍干燥，得到凝膠柱分離純化過的均一多糖。

實施例2：通過以下步驟分離提純齒瓣石斛均一多糖：將齒瓣石斛在水中煎煮，并進行固液分離，得到水提液；在水提液中加入乙醇醇沉使體系內(nèi)乙醇濃度為80％，靜置過夜，得到粗多糖；將粗多糖復(fù)溶于水，使多糖完全溶解于水中，加酒精至50％進行乙醇醇沉，得到沉淀物，將該沉淀物去除，繼續(xù)加酒精至體系酒精70％，得到90％以上純度的50-7 0％醇沉粗多糖片段；將粗多糖片段復(fù)溶于水，用superdex-200進行純化，用硫酸苯酚法跟蹤監(jiān)測收集，收集對稱峰35-42管，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮50分鐘，透析，冷凍干燥，得到凝膠柱分離純化過的均一多糖。

實施例3：通過以下步驟對所得均一多糖進行結(jié)構(gòu)解析：

分子量測定：用HPGPC分析儀器、高效液相色譜儀(美國A gilent1100series)、蒸發(fā)光散射檢測器ELSD測定，將樣品配制成2mg/ml，進樣量10ul。圖1是所得樣品的HPGPC圖。以不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖(Mw1270，5220，11600，48600，80900，147600，273000，409800)作為標準品，做出標準曲線，測定多糖的純度及相對分子質(zhì)量，最終得到均一多糖分子量為1.94×10⁵Da。

單糖組成測定：將均一多糖甲基化衍生，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀與單糖標準品對照，其中單糖標準品譜圖見圖2，樣品單糖組成圖見圖3，通過兩圖對照，得甘露糖:葡萄糖(摩爾比)為：0.77:0.23。

均一多糖甲基化衍生的具體工藝為：將多糖2mg用1ml的2M三氟乙酸水解90min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入2ml甲醇，蒸干，反復(fù)2次。殘基加入2ml雙蒸水，60mg硼氫化鈉還原8小時，加入冰醋酸中和，加入甲醇3ml，反復(fù)3次，旋蒸至粉末，110度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化。100℃反應(yīng)1h，冷卻，然后加入3mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4-5次，以除去多余的醋酐。將乙酰化后的產(chǎn)物用3mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分震蕩后，除去上層水溶液，如此重復(fù)4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10mL待GC-MS分析。

核磁分析：推斷出糖苷鍵→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值應(yīng)為：1.46:1.74:1.00。結(jié)合圖4-6，具體的核磁譜圖結(jié)構(gòu)分析如下：

根據(jù)圖5的碳譜信號，石斛多糖的異頭碳信號峰為δ101.3，通過dept135圖譜，可以確定C6的信號峰為δ61.7。C2，C3，C4，C5的化學位移分布在δ70～80ppm區(qū)域內(nèi)。δ77.76信號峰應(yīng)歸屬于C4，由于O-在C4發(fā)生取代而導致向低場遷移。因此，可以推測出石斛多糖的鏈接方式可能為1,4-Man。

另外，在δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信號峰，應(yīng)歸屬于乙酸根的甲基和羰基信號。因此可以推斷，在石斛多糖的多糖結(jié)構(gòu)中，C2，C3對應(yīng)的羥基可能由乙酸根取代。

由單糖組成結(jié)果可知，石斛多糖由甘露糖和葡萄糖組成(摩爾比為77:23)，由于葡萄糖占有的比例比較少，而在碳譜上很難觀察到葡萄糖糖苷鍵的信號，而在圖6的HSQC圖譜中，可以勉強看到一些信號，葡萄糖糖苷的異頭碳信號峰應(yīng)分布在101.2/4.7，而C4信號峰應(yīng)為79.1/4.07，其它C6的化學位分布著61-62.3ppm，C2，C3，C5的化學位移應(yīng)分布在70-77ppm之間。因此，可以推斷石斛多糖存在→4)-Glc-(1→糖苷鍵。

采用bruker Topspin3.0軟件，對碳譜的δ99-103，δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信號峰進行積分，可以得到三個峰信號的積分比值為：1.02:1.12:3.22，由于δ99-103為異頭峰區(qū)域，積分值應(yīng)為→4)-man-(1→，→4)-2-o-acetyl-man-(1→和→4)-Glc-(1→糖苷鍵的總和，而δ20.3-21.0和δ172.9-173.9為→4)-2-o-acetyl-man-(1→糖苷鍵的特殊信號峰，且比值(1.02:1.12:)接近于1:1，而甘露糖和葡萄糖的比例為0.77:0.23，因此可以推斷出糖苷鍵→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值應(yīng)為：1.46:0.74:1.00。