本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從云南松的樹皮中成分離提取原花青素的方法。
背景技術(shù)：
原花青素是黃烷-3-醇單體及其聚合體縮合而成的聚多酚類化合物，通常由兒茶素和表兒茶素這兩類原花青素單體組成。原花青素屬于羥基供體，它在植物組織中的主要作用是保護植物中易氧化的成分。20世紀(jì)80年代人們逐漸認識到清除自由基和抗氧化是營養(yǎng)保健的重要前提和基礎(chǔ)。而原花青素作為清除自由基能力最強的、其他抗氧化劑所無可比擬的抗氧化劑。
抗氧化性能主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
1、有效地清除超氧陰離子自由基O2.-，保護和穩(wěn)定維生素C。
原花青素是一種比VC和VE作用更強的自由基清除劑。
2、抑制脂質(zhì)氧化。原花青素通過參與脂質(zhì)代謝，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護脂質(zhì)不發(fā)生過氧化損傷。
3、和金屬Cu2+等螯合。原花青素能與金屬離子如鐵、鋁、鉬等螫合形成原花青素一金屬(Vc-Cu)復(fù)合物，它能穩(wěn)定存在于生物機體內(nèi)，與人類的生活和健康密切相關(guān)。
上述原花青素的抗氧化性能使其具備了醫(yī)用保健功能。由于其卓越的抗氧化能力，它可以清除人體內(nèi)致病的自由基，減緩細胞死亡和細胞膜變性，從而延緩衰老。而且花青素還能通過抑制酶的活性來降低血壓，達到防止中風(fēng)、偏癱的作用。并且原花青素能通過降低膽固醇水平，減少血管壁上的膽固醇沉積，通過提高血管壁彈性而達到降壓的功能。
有研究認為它還可運用于皮膚保健和美容方面。在歐美國家花青素享有“皮膚維生素”、“口服化妝品”的美譽其主要功效為：(I)它可以維護皮膚膠原合成，抑制彈性蛋白酶，從而減少皺紋產(chǎn)生；(2)原花青素可抑制絡(luò)氨酸酶活性，具有防曬美白的作用；(3)原花青素具有的多羥基結(jié)構(gòu)使它在空氣中易吸濕，且能與多糖(透明質(zhì)酸)、蛋白質(zhì)、脂類(磷脂)、多肽等復(fù)合，從而達到保濕收斂皮膚的效。
原花青素還可在食品中應(yīng)用。隨著科技的發(fā)展，人們對食品添加劑的安全性越來越重視，天然添加劑的開發(fā)利用已成為添加劑發(fā)展使用的總趨勢?；ㄇ嗨卦谑称分胁坏勺鳛闋I養(yǎng)強化劑，而且還可作為食品防腐劑代替苯甲酸等合成防腐劑，并且可作為食品著色劑應(yīng)用于平常飲料和食品，符合人們對食品添加劑天然、安全、健康的總要求。
我國作為一個植物資源大國，植物物種得天獨厚，但關(guān)于原花青素的研究起步較晚，這也導(dǎo)致了制約原花青素發(fā)展的瓶頸問題-原花青素的提取分離。
原花青素的提取是目前原花青素研究發(fā)展的熱點問題，也是原花青素生產(chǎn)、投入使用的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。近年來，在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)之上，一些憑借新技術(shù)或經(jīng)過改良后的提取方法也開始嶄露頭角。目前國內(nèi)外廣泛使用的提取方法如下：
1、有機溶劑萃取法這是目前國內(nèi)外廣泛使用的花青素的提取方法。多數(shù)選擇甲醇、乙酮、丙酮等混合溶劑對材料進行溶解過濾，通過調(diào)節(jié)溶液酸堿度萃取濾液中的花青素。有機溶劑萃取法的關(guān)鍵是選擇有效溶劑，要求既要對被提取的有效成分有較大溶解度，又要避免大量雜質(zhì)的溶解。該方法原理簡單，對設(shè)備要求較低，不足之處是大多數(shù)有機溶劑毒副作用大且產(chǎn)物提取率低。
2、水溶液提取法。有機溶劑萃取的花青素多有毒性殘留且生產(chǎn)過程環(huán)境污染大，有鑒于此，水溶液提取應(yīng)運而生。該方法一般將植物材料在常壓或高壓下用熱水浸泡.。它是Duncan等(1998)發(fā)明的提取花青素的方法，此方法設(shè)備要求簡單，但產(chǎn)品純度低。
3、超臨界流體萃取法。超臨界流體萃取是利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響進行提取。這種方法產(chǎn)品提取率高，對環(huán)境無污染，但設(shè)備成本過高。
4、微波提取法。微波提取法是利用在微波場中，吸收微波能力的差異使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離，進入到具有較小介電常數(shù)、微波吸收能力相對較差的萃取溶劑中。該技術(shù)選擇性好，萃取率高，速度快，操作簡單，廢液排放量少。
5、超聲波提取法。超聲波在20世紀(jì)50年代后逐漸應(yīng)用于化學(xué)化工生產(chǎn)過程之中，且主要集中在植物中藥用成分、多糖以及其它功能性成分的提取等研究領(lǐng)域。超聲波提取運用前景好、操作簡單、快速高效、生產(chǎn)過程清潔無公害。
6、微生物發(fā)酵提取法。此方法將生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于花青素的提取之中，是生物科學(xué)與化工生產(chǎn)之間的超強滲透與有效結(jié)合。微生物發(fā)酵法利用微生物或酶讓含有花青素的細胞胞壁降解分離，使細胞胞體內(nèi)花青素充分溶入到提取液中，從而增加提取的產(chǎn)率與速率。該方法的優(yōu)點是操作穩(wěn)定性及可靠性高，環(huán)境友好。
7、加壓溶劑萃取加壓溶劑萃取法是通過加壓提高溶劑的沸點，進而使被提取物在溶劑中的溶解度增加，從而獲得較高的萃取效率。該法的優(yōu)點是提取率高，但經(jīng)濟成本亦較高。
上述方法各有優(yōu)缺點，所以單一使用這些方法并不能達到從云南松的樹皮中提取原花青素最佳提取效果。
申請?zhí)朇N102924423A公布了一種從香蕉皮中提取花青素的方法。是采用超聲波輔助微生物發(fā)酵法從青香蕉皮中提取花青素，利用微生物發(fā)酵法通過黑曲霉代謝產(chǎn)物對香蕉皮細胞壁的破壞，再通過超聲波產(chǎn)生的空化作用，使得花青素充分釋放。但黑曲霉對松樹皮纖維處理效果差于纖維素酶，而且未對使用的超聲波功率和頻率進行詳細闡述。而且酶解液未運用有機溶液處理，使得部分高聚原花青素流失，影響了得率。
發(fā)明人楊磊，祖元剛等提出的中國專利申請CN104974124A一種從興安落葉松樹皮中提取原花青素的方法，其特征在于：將興安落葉松樹皮陰干后粉碎，加入溴化1-烯丙基-3-甲基咪唑離子液體溶液，超聲波輔助提取，得提取液，將提取液用大孔樹脂吸附，乙醇溶液解析，解析液濃縮后干燥即得到產(chǎn)品。該發(fā)明工藝選用溴化1-烯丙基-3-甲基咪唑離子液體溶液為提取劑，由于價格較高不適用于工業(yè)化生產(chǎn)原花青素。
發(fā)明人劉明提出的中國專利申請CN201510502133.3公開了一種制備云南松樹皮花青素的方法。該方法包括：1)將云南松樹皮粉碎后過篩，于溶劑中進行酶解輔助浸提，得到酶解液；2)將步驟1)所得酶解液依次進行膠磨均質(zhì)和高壓脈沖電場處理，再將所得產(chǎn)物離心，收集上層清液，濃縮得到花青素的粗提液；3)將步驟2)所得原花青素的粗提液純化，干燥而得。在該發(fā)明中，先將樹皮酶解，再通過高壓脈沖電場處理酶解液，以提高得率。該方法中高壓脈沖電場處理不能和酶解過程同時處理。
利用現(xiàn)有上述技術(shù)從云南松的樹皮中提取原花青素都存在一定不足，所以需要一種新的提取方法能以低成本高效地從云南松的樹皮中提取出花青素。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)對云南松樹皮中提取原花青素存在的不足，為了降低生產(chǎn)成本，縮短提取分離時間，提高產(chǎn)品率，本發(fā)明提供了一種提取云南松樹皮中原花青素的制備方法。為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，該方法包括：
(1)將烘干云南松樹皮粉碎后加入纖維素酶和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，進行酶解；
(2)酶解過程輔以超聲波處理；
(3)在酶解懸濁液中加入乙醇溶液，混合均勻后再次進行超聲波處理；
(4)對粗提液進行分離和純化，得到原花青素提取物。本發(fā)明的提取方法工藝簡單，操作方便，效率高，提高了原花青素的得率較普通溶劑提取法高15-25％，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的提取方法：
所述步驟(1)將烘干云南松樹皮原料粉碎后，經(jīng)過60-80目的篩網(wǎng)篩選，按料液重量比1∶5-20投入pH為4-5(優(yōu)選pH4.8)的纖維素酶和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(優(yōu)選1∶10-12)，溫度控制在35-38℃。所述纖維素酶的酶活為0.2-1.0U/mg。用量方面，隨著酶的濃度的升高，與底物的接觸面積增大，酶解反應(yīng)速率增大。但當(dāng)酶的濃度達到過飽和時，會對酶產(chǎn)生抑制作用，酶得不到充分利用，造成浪費。所以所述纖維素酶酶添加量為樹皮干重的0.1-0.5％。浸提出原花青素的溫度越高越好，但考慮纖維素酶的酶活性最適條件為30℃。所以所述纖纖維素酶和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液最佳溫度在35-38℃。
所述步驟(2)酶解過程輔以超聲波處理，超聲強度為6-12W/cm2，聲波頻率范圍為2-3MHz，時間為40-70分鐘。
超聲波是一種彈性機械振動波，能破壞植物的細胞，使溶媒滲透到植物細胞中，從而加速樹皮中花青素的溶解。在我的實驗探索中發(fā)現(xiàn)，超聲波參數(shù)(頻率、聲強度等)在超聲提取樹原皮花青素多次實驗中，使用不同頻率和聲強度等提取都會得到不同的結(jié)果。按照實驗中的發(fā)現(xiàn)，超聲強度為6-12W/cm2，聲波頻率范圍為2-3MHz，提取率最高。
所述步驟(3)在酶解懸濁液中加入乙醇溶液，混合均勻后再次進行超聲波處理。加入乙醇溶液體積為所述步驟(1)中醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的20-60％(35％最優(yōu))，溶液溫度提高到50-80℃，超聲強度為6-12W/cm2，聲波頻率范圍為2-3MHz，時間為15-30分鐘。
所述步驟(4)對粗提液進行分離和純化。該步驟采用傳統(tǒng)離心分離后濃縮，最后通過大孔樹脂吸附達到提純。
本發(fā)明同以往發(fā)明相比有以下優(yōu)點：
1.加入纖維素酶提高了原花青素從云南松樹皮的浸出率，同時還不需要傳統(tǒng)溶液提取法的高溫或高壓，節(jié)約了設(shè)備投入，減少了能耗運行成本。
2.輔以超聲波處理通過機械振動波產(chǎn)生空化效應(yīng)、機械效應(yīng)，破壞植物的細胞，使溶媒滲透到植物細胞中，從而加速樹皮中原花青素的溶解。相比僅以纖維素酶處理大大節(jié)約處理時間。
3.在纖維素酶處理后，通過乙醇加入改變?nèi)軇O性，能最大極限將原花青素從松樹皮中溶解出。前期通過纖維素酶，超聲波處理后使得乙醇用量和浸提時間相比有機溶劑萃取法都大幅減少很多。
4.通過纖維素酶，超聲波，有機溶劑組合使用除大幅降低浸提時間，降低了浸提溫度，還能最大極限使各聚合度的原花青素浸出。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明不限于以下實施例。
實施例1
稱取100g過60目的粉碎云南松樹皮原料，按料液重量比1∶10投入預(yù)先配制好的pH為4.8的纖維素酶和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。所用纖維素酶的酶活為0.2-1.0U/mg，重量為云南松樹皮原料的0.3％。溶液溫度控制在35-38℃，持續(xù)攪拌40分鐘，并輔以超聲強度為6-12W/cm2，聲波頻率范圍為2MHz的超聲波。
40分鐘酶解結(jié)束后，向混合溶液中按醋酸-醋酸鈉緩沖溶液體積的35％加入95％的乙醇溶液，溫度提高到70℃，輔以超聲強度為6-12W/cm2，聲波頻率范圍為2MHz的超聲波，持續(xù)攪拌15分鐘。
最后對提取液進行傳統(tǒng)分離提純。提取液離心分離，所述離心在轉(zhuǎn)速3000-6000rpm下離心5-15min得上清液，經(jīng)過過濾濃縮后的濃縮液再經(jīng)大孔樹脂吸附，樹脂可以是LSA-10、HPD-400或者AB-8，該實施例中采用AB-8，吸附溫度為40℃，吸附時間為4h。最后進行洗脫并得到洗脫液，再濃縮，干燥制得成品3.8g，原花青素含量74.5％。
色譜檢測條件：
1.色譜柱：ODS C18，5μm，250mm×4.6mm
2.流動相A：9％乙腈，0.1％甲酸(水溶液)
流動相B：40％乙腈(水溶液)
3.流速：0.8ml/min
4.檢測波長：280nm
5.柱溫：40℃
實施例2
醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH值調(diào)整為3.8代替4.8，重復(fù)實施例1的制備步驟。得成品3.4g，原花青素含量75.3％。
實施例3
酶解液溫度調(diào)整為50℃代替35-38℃，重復(fù)實施例1的制備步驟。得成品3.3g，原花青素含量72.5％。
實施例4
超聲強度調(diào)整為20W/cm2代替6-12W/cm2，重復(fù)實施例1的制備步驟。得成品3.2g，原花青素含量70.8％。
實施例4
酶解后不再加入乙醇溶液，直接分離提純，重復(fù)實施例1的制備步驟。得成品3.5g，原花青素含量77.1％。
比較例1
稱取100g過60目的粉碎云南松樹皮原料，按料液重量比1∶10投入70％乙醇溶液。80℃，持續(xù)攪拌40分鐘。
最后對提取液進行傳統(tǒng)分離提純。提取液離心分離，所述離心在轉(zhuǎn)速3000-6000rpm下離心5-15min得上清液，經(jīng)過過濾濃縮后的濃縮液再經(jīng)大孔樹脂吸附，樹脂可以是LSA-10、HPD-400或者AB-8，該實施例中采用AB-8，吸附溫度為40℃，吸附時間為4h。最后進行洗脫并得到洗脫液，再濃縮，干燥制得成品2.8g，原花青素含量73.5％。
比較例2
稱取100g過60目的粉碎云南松樹皮原料，按料液重量比1∶10投入70％乙醇溶液。80℃，持續(xù)攪拌40分鐘，并輔以超聲強度為6-12W/cm2，聲波頻率范圍為2MHz的超聲波。
最后對提取液進行傳統(tǒng)分離提純。提取液離心分離，所述離心在轉(zhuǎn)速3000-6000rpm下離心5-15min得上清液，經(jīng)過過濾濃縮后的濃縮液再經(jīng)大孔樹脂吸附，樹脂可以是LSA-10、HPD-400或者AB-8，該實施例中采用AB-8，吸附溫度為40℃，吸附時間為4h。最后進行洗脫并得到洗脫液，再濃縮，干燥制得成品3.4g，原花青素含量70.5％。