本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種凍干原粉，具體涉及一種生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法。
背景技術(shù)：
IMF(Immune Metabolic Factors免疫代謝因子,簡稱IMF)是一類以蛋白質(zhì)、多肽峰物質(zhì)為主要成分，并有少量核酸組成的生命活性物質(zhì)。廣泛分布于天然動物、植物細胞中。
目前，已經(jīng)公開了從天然動物中提取IMF生命活性物質(zhì)的相關(guān)報道，如專利名稱：一種生物抗衰制劑的生產(chǎn)工藝(申請?zhí)枺?2127943.8，申請日：2002.11.29)。該專利制備的IMF生物抗衰制劑，雖然具有顯著的延長人體壽命之效果，可以通過肌肉注射、靜脈注射和皮下緩釋控釋包埋等使用方法，達到延長人體壽命的目的；但該專利方法獲得的IMF生命活性物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、分子活性不強等缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法，該IMF生物抗衰因子，屬于綠色、純天然制品，安全性高。并且可以通過注射、口服、化妝品方式應(yīng)用于人體，發(fā)揮其生物抗衰作用。IMF生命活性物質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、分子活性更強、生物抗衰老作用更全面。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法，包括以下步驟：
(1)將初生哺乳動物用無菌水沖洗干凈；
(2)加無熱源重蒸生理鹽水，高速勻漿；
(3)在-20℃條件下，沉降分離，去掉結(jié)締組織沉淀物；
(4)將上清液，在42℃、PH 4.5條件下，用4000單位/kg胰蛋白酶進行酶解90分鐘，得水解液；
(5)將水解液通過分子量50000D膜進行超濾，去掉酶活性未透過物質(zhì)，得透過液；
(6)將透過液用伯樂S-X3凝膠進行柱層析，用濃度2％磷酸氫二鈉洗脫，分別在25～30分鐘、45～50分鐘分段分別用紫外線吸收方法指示收取蛋白質(zhì)、多肽峰物質(zhì)，得IMF峰物質(zhì)；
(7)將各IMF峰物質(zhì)混合均勻，用分子烙印技術(shù)對IMF峰物質(zhì)進一步純化，去除大分子非活性蛋白質(zhì)，得純化提取液；
(8)在純化提取液中加入濃度75％乙醇，在5℃環(huán)境中存放過夜；目的在于保存IMF因子生物活性的同時，沉淀出IMF更高生物活性因子。
(9)次日離心收取沉淀物質(zhì)，冷凍干燥，即得IMF凍干原粉。
進一步地，所述紫外線吸收方法中使用的紫外線吸收劑為0.5％苯并三氮唑。
所述步驟(7)具體步驟如下：
a、模版IMF多肽MIP制備:
功能單體丙烯酰胺4mmol，模版IMF多肽0.6mmol，溶劑四氫呋喃7mmol，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯37mmol和引發(fā)劑偶氮二異丁腈20mg，置于玻璃試管中混和均勻，充氮氣，抽出真空排除氧氣后密封，60℃水浴恒溫，聚合24h，得棒狀體聚合物；將其粉碎，用75um篩分，用丙酮反復(fù)沉降，取下層粒度相近75um的顆粒，真空干燥，得IMF多肽MIP，備用；
b、高活性IMF多肽的提取:
稱取混合均勻的IMF峰物質(zhì)，與IMF多肽MIP以1:1重量比溶于5V、濃度25％甲醇，攪拌6h，加入20V丙酮，在5℃環(huán)境中存放過夜；次日離心收取沉淀物；沉淀物中加入5V、濃度5％冰醋洗脫吸附的IMF多肽，得純化提取液。
本發(fā)明生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法具有以下的有益效果：
1、本發(fā)明制備的生物抗衰IMF凍干原粉，可以制成各種劑型，通過注射、口服、化妝品方式應(yīng)用于人體，具有顯著的延長人體壽命之效果，達到延長人體壽命的目的。也可加入食品(飲料、酒)中發(fā)揮抗衰老作用。
2、本發(fā)明IMF生物抗衰因子，屬于綠色、純天然制品，無毒、無副作用，對人體安全性高。
3、本發(fā)明制備的IMF生命活性物質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定、分子活性更強、生物抗衰老作用更全面。
4、本發(fā)明制備的生物抗衰IMF凍干原粉，工藝簡單、原材料來源廣泛，生產(chǎn)成本低，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施方式
實施例1
一種生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法，包括以下步驟：
(1)將初生的羊羔宰殺、去除皮毛及體內(nèi)垃圾后，用無菌水沖洗干凈；
(2)加6倍重量的無熱源重蒸生理鹽水，以12000rpm高速勻漿；
(3)在-20℃條件下，沉降分離，去掉結(jié)締組織沉淀物；
(4)將上清液，在42℃、PH 4.5條件下，用4000單位/kg胰蛋白酶進行酶解90分鐘，得水解液；
(5)將水解液通過分子量50000D膜進行超濾，去掉酶活性未透過物質(zhì)，得透過液；
(6)將透過液用伯樂S-X3凝膠進行柱層析，用濃度2％磷酸氫二鈉洗脫，分別在25～28分鐘、45～48分鐘分段分別用紫外線吸收方法指示收取蛋白質(zhì)、多肽峰物質(zhì)，得IMF峰物質(zhì)；
(7)將各IMF峰物質(zhì)混合均勻，用分子烙印技術(shù)對IMF峰物質(zhì)進一步純化，去除大分子非活性蛋白質(zhì)，得純化提取液；
(8)在純化提取液中加入濃度75％乙醇，在5℃環(huán)境中存放過夜；
(9)次日離心收取沉淀物質(zhì)，冷凍干燥，即得IMF凍干原粉。
進一步地，所述紫外線吸收方法中使用的紫外線吸收劑為0.5％苯并三氮唑。
所述步驟(7)具體步驟如下：
a、模版IMF多肽MIP制備:
功能單體丙烯酰胺4mmol，模版IMF多肽0.6mmol，溶劑四氫呋喃7mmol，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯37mmol和引發(fā)劑偶氮二異丁腈20mg，置于玻璃試管中混和均勻，充氮氣，抽出真空排除氧氣后密封，60℃水浴恒溫，聚合24h，得棒狀體聚合物；將其粉碎，用75um篩分，用丙酮反復(fù)沉降，取下層粒度相近75um的顆粒，真空干燥，得IMF多肽MIP，備用；
b、高活性IMF多肽的提取:
稱取混合均勻的IMF峰物質(zhì)，與IMF多肽MIP以1:1重量比溶于5V、濃度25％甲醇，攪拌6h，加入20V丙酮，在5℃環(huán)境中存放過夜；次日離心收取沉淀物；沉淀物中加入5V、濃度5％冰醋洗脫吸附的IMF多肽，得純化提取液。
實施例2
一種生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法，包括以下步驟：
(1)將初生的羊羔宰殺，去除皮毛、內(nèi)臟、體內(nèi)垃圾后，用無菌水沖洗干凈后切碎；
(2)加7倍重量的無熱源重蒸生理鹽水，以11000rpm高速勻漿；
(3)在-20℃條件下，沉降分離，去掉結(jié)締組織沉淀物；
(4)將上清液，在42℃、PH 4.5條件下，用4000單位/kg胰蛋白酶進行酶解90分鐘，得水解液；
(5)將水解液通過分子量50000D膜進行超濾，去掉酶活性未透過物質(zhì)，得透過液；
(6)將透過液用伯樂S-X3凝膠進行柱層析，用濃度2％磷酸氫二鈉洗脫，分別在28～30分鐘、45～50分鐘分段分別用紫外線吸收方法指示收取蛋白質(zhì)、多肽峰物質(zhì)，得IMF峰物質(zhì)；
(7)將各IMF峰物質(zhì)混合均勻，用分子烙印技術(shù)對IMF峰物質(zhì)進一步純化，去除大分子非活性蛋白質(zhì)，得純化提取液；
(8)在純化提取液中加入濃度75％乙醇，在5℃環(huán)境中存放過夜；
(9)次日離心收取沉淀物質(zhì)，冷凍干燥，即得IMF凍干原粉。
進一步地，所述紫外線吸收方法中使用的紫外線吸收劑為0.5％苯并三氮唑。
所述步驟(7)具體步驟如下：
a、模版IMF多肽MIP制備:
功能單體丙烯酰胺4mmol，模版IMF多肽0.6mmol，溶劑四氫呋喃7mmol，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯37mmol和引發(fā)劑偶氮二異丁腈20mg，置于玻璃試管中混和均勻，充氮氣，抽出真空排除氧氣后密封，60℃水浴恒溫，聚合24h，得棒狀體聚合物；將其粉碎，用75um篩分，用丙酮反復(fù)沉降，取下層粒度相近75um的顆粒，真空干燥，得IMF多肽MIP，備用；
b、高活性IMF多肽的提取:
稱取混合均勻的IMF峰物質(zhì)，與IMF多肽MIP以1:1重量比溶于5V、濃度25％甲醇，攪拌6h，加入20V丙酮，在5℃環(huán)境中存放過夜；次日離心收取沉淀物；沉淀物中加入5V、濃度5％冰醋洗脫吸附的IMF多肽，得純化提取液。
試驗過程：
將本發(fā)明實施例1IMF凍干原粉制成注射劑為例:
1、IMF生物抗衰因子注射劑注射小白鼠后對小白鼠壽命影響的試驗：
在無菌條件下，稱取IMF生物抗衰因子凍干原粉10克，用無熱源水1000毫升，除菌、過濾、分裝，得IMF生物抗衰因子注射劑。檢測其微生物指標、熱源物指標，其它全部安全檢測指標符合(中國藥典2010年版二部附錄IB注射劑項下規(guī)定)。取3月齡美國NIH小白鼠200支，隨機分實驗組、對照組各100支，在相同喂養(yǎng)條件下，每25天分別尾靜脈注射0.5毫升IMF生物抗衰因子注射劑和無菌生理鹽水。飼養(yǎng)三年1095天。
實驗結(jié)果:實驗組平均存活率727天，對照組平均存活率549天。IMF生物抗衰因子注射劑能夠顯著提高美國NIH小白鼠壽命，其半數(shù)延壽百分比為32.4％。(P<0.01)。
半數(shù)存活時間(MST)：
對照組MST＝549(d)
實驗組MST＝727(d)
半數(shù)延壽百分比＝(727-549)/549×100％＝32.4％(雌雄平均數(shù))
2、IMF生物抗衰因子注射劑注射小白兔的抗衰協(xié)同試驗：
取每只體重2.5公斤實驗用小白兔10只，隨機分實驗組、對照組各5只，在相同喂養(yǎng)條件下，每25天分別耳靜脈注射5毫升上述IMF生物抗衰因子注射劑，30、60、90天后分別取兔子耳靜脈血，化驗其SOD(超氧化物歧化酶)、LPO(過氧化脂質(zhì))，數(shù)據(jù)如表一所示。
表一 30、60、90天后兔子耳靜脈血的SOD、LPO數(shù)值
(測試方法：紅細胞SOD酶活性：丁克祥法。紅細胞LPO含量：大石誠子法。)
試驗結(jié)論：
一、IMF生物抗衰因子注射劑具有很好的抗衰協(xié)同作用。主要體現(xiàn)在IMF生物抗衰因子注射劑對提高機體的免疫、代謝等項指標。即能維持機體的免疫平衡，同時提高細胞代謝水平，從而發(fā)揮其抗病、抗衰作用。
二、機體SOD酶活性的升高與LPO的降低，是可相互驗證的指標，它從機體代謝的不同側(cè)面，同時驗證了IMF生物抗衰因子注射劑有明顯提高機體的代謝水平的能力(P<0.01)。
3、IMF生物抗衰因子注射劑對人胚肺二倍體成纖維細胞傳代試驗：
1.材料與方法
1.1 培養(yǎng)細胞(為人胚肺二倍體成纖維細胞2BS株，第10代，北京中科院生物制品研究所)；IMF生物抗衰因子注射劑；氫化可的松注射液(規(guī)格5mg/ml，北京第三制藥廠)。
1.2 培養(yǎng)液：用Eagle’s TCM199作為基礎(chǔ)配制培養(yǎng)液，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺、抗生素(青霉素K100μ/ml、硫酸慶大霉素50μ/ml、鏈霉素100μ/ml)，用5.6％NaHCO3，調(diào)pH7.2～7.4。
1.3 培養(yǎng)方法
1.3.1 IMF生物抗衰因子注射劑最佳濃度篩選：用側(cè)面積為24cm的培養(yǎng)瓶將第10代人胚肺二倍體成纖維細胞2BS株分為10瓶(細胞起始濃度為6.63×104個/ml)，按照表二所示分為空白對照、陽性對照(氫化可的松注射液，用培養(yǎng)液稀釋為5μg/ml)、試驗組，在37℃、相對濕度85％的條件下培養(yǎng)。在此期間不換培養(yǎng)液，當pH值下降時，用5.6％NaHCO3調(diào)節(jié)使培養(yǎng)液的PH保持在7.2～7.4之間。
表二 IMF生物抗衰因子注射劑最佳有效濃度篩選(n＝8)
*培養(yǎng)第五天的細胞數(shù)量。存活時間(天)。使用濃度單位：ng/ml。
1.3.2 IMF生物抗衰因子注射劑對人胚肺二倍體成纖維細胞傳代試驗：將細胞分別接種到空白對照、陽性對照、試驗組培養(yǎng)液中，使其細胞密度為5×104～10×104個/ml，然后均分為5瓶，置于37℃，相對濕度為85％的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用5.6％NaHCO3調(diào)節(jié)使培養(yǎng)液的PH保持在7.2～7.4之間。接種2～4天細胞成片，形成致密單層，即傳代一次。然后棄去培養(yǎng)液，用0.2％胰酶消化5分鐘后，用新培養(yǎng)液輕輕吹打，使細胞分散，計數(shù)，并稀釋成5×104～10×104個細胞/ml，置于37℃，相對濕度為85％的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復(fù)培養(yǎng)，直到細胞停止傳代。
2.試驗結(jié)果
2.1 由表二可知，IMF生物抗衰因子注射劑生命源注射劑對人胚肺二倍體成纖維細胞傳代試驗的最佳有效濃度為30×103ng/ml。
2.2 空白對照組：48代前，5組細胞成片時間為2～3天，細胞形態(tài)無明顯區(qū)別。59代后開始出現(xiàn)衰老象征，細胞層變?。?4代時傳代終止(培養(yǎng)15天仍未出現(xiàn)細胞單層)。
2.3 陽性對照組：55代前，5組細胞成片時間為2～3天，細胞形態(tài)無明顯區(qū)別。65代后開始出現(xiàn)衰老象征，細胞層變??；71代時傳代終止。
2.4 IMF生物抗衰因子注射劑組：76代前，5組細胞成片時間為2～3天，細胞形態(tài)無明顯區(qū)別。92代后開始出現(xiàn)衰老象征，細胞層變??；98代時傳代終止。
3.結(jié)論
試驗結(jié)果：IMF生物抗衰因子注射劑使細胞傳代終止時間由64代延長到98代，延長率為53.1％，統(tǒng)計結(jié)果P<0.01，具有非常顯著差異，提示IMF生命源注射液對人類具有顯著的延長壽命的功效。
4、IMF生物抗衰因子注射劑進行人體靜脈注射試驗：
近幾年來，對100例自愿接受IMF生物抗衰因子注射劑進行人體靜脈注射實驗(50ml×5次)，用藥前，有嚴懲衰老體征；體弱多病，面黃肌瘦，長期咳嗽，患有慢性支氣管炎，食欲、睡眠差，神經(jīng)衰弱，怕過冬季。使用IMF生物抗衰因子注射劑源靜脈注射劑(50ml×5次)后，一個月檢測，食欲、睡眠、視力、聽力明顯改善，精神變好，皮膚有光澤、彈性增強、咳嗽、哮喘遇冷也未復(fù)發(fā)，在短時間內(nèi)恢復(fù)了健康體質(zhì)。平均血液SOD酶活性用藥前為1850u/gHb，用藥后為3610u/gHb，增高率為95.0％(P<0.01)。其它異常生化指標均能轉(zhuǎn)為正常。一年后隨訪，上述抗衰老表現(xiàn)穩(wěn)定，抗衰作用持久。與上述動物、細胞學(xué)實驗研究結(jié)果一致。
5、應(yīng)用MIT技術(shù)(分子烙印技術(shù))進一步純化IMF多肽活性的試驗：
對照組：未采用分子烙印技術(shù)純化的IMF凍干原粉的制備方法獲得的IMF凍干原粉(簡稱Y-IMF)；
試驗組：采用分子烙印技術(shù)的本發(fā)明生物抗衰老IMF凍干原粉的制備方法獲得的IMF凍干原粉(簡稱F-IMF)；
應(yīng)用人胚肺二倍體成纖維細胞2BS株細胞傳代試驗評價IMF多肽活性的試驗：
5.1材料與方法
5.1.1 培養(yǎng)細胞(為人胚肺二倍體成纖維細胞2BS株，第10代，北京中科院生物制品研究所)；IMF生物抗衰因子注射劑；氫化可的松注射液(規(guī)格5mg/ml，北京第三制藥廠)。
5.1.2 培養(yǎng)液：用Eagle’s TCM199作為基礎(chǔ)配制培養(yǎng)液，加入10％小牛血清、1％谷氨酰胺、抗生素(青霉素K100μ/ml、硫酸慶大霉素50μ/ml、鏈霉素100μ/ml)，用5.6％NaHCO3，調(diào)pH7.2～7.4。
5.1.3 培養(yǎng)方法
5.1.3.1 比較兩種IMF生物抗衰因子生物活性方法：用側(cè)面積為24cm的培養(yǎng)瓶將第10代人胚肺二倍體成纖維細胞2BS株分為10瓶(細胞起始濃度為6.63×104個/ml)，按照表三所示分為Y-IMF檢測用量5μg/ml、F-IMF檢測用量5μg/ml，在37℃、相對濕度85％的條件下培養(yǎng)。在此期間不換培養(yǎng)液，當pH 值下降時，用5.6％NaHCO3調(diào)節(jié)使培養(yǎng)液的PH保持在7.2～7.4之間。
表三 比較兩種IMF生物抗衰因子生物活性檢測
5.2.試驗結(jié)果
5.2.1 由表三可知，相同使用濃度下F-IMF對細胞的生長、發(fā)育、形態(tài)、傳代等生理指標明顯高于Y-IMF。經(jīng)過MIT技術(shù)制備的IMF多肽由于其生物活性、純度等指標的大大提高，用來生產(chǎn)的IMF多肽注射劑產(chǎn)品，其安全性，有效性也相應(yīng)的提高。
以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。