本發(fā)明與微生物有關(guān)，具體而言，與發(fā)酵菌劑有關(guān)，進(jìn)一步來說，涉及秸稈的發(fā)酵菌劑。
技術(shù)背景
作物秸稈的有機(jī)質(zhì)含量高，富含農(nóng)作物生長所需的營養(yǎng)元素，幾乎不含雜質(zhì).是有機(jī)肥較佳的原料，由其生產(chǎn)的產(chǎn)品具有較高的農(nóng)用價(jià)值。然而，秸稈類的含碳量較高、c/n比值高，并不適合單獨(dú)作為有機(jī)肥的原材料，而需要與含碳量較低、c/n比值低的糞便類配合使用。一般軟質(zhì)作物秸稈的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量相對較低，較易腐熟，如水稻、小麥、油菜、玉米等。而硬質(zhì)秸稈，如谷殼、木屑和樹皮的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量較高、c/n在100以上，不易分解，降解時(shí)間長，能較長期保持原有的形態(tài)。但黃豆、棉花、煙草等的桿，一般作為水分含量高、c/n比值低的污泥、畜禽糞尿的輔料，需要控制用量，物料粒徑要小，顆粒越細(xì)，才能加快降解速度。
對于不同種類的秸稈，要使其加快降解變?yōu)榉柿?，傳統(tǒng)的方法就是通過將秸稈發(fā)酵。有機(jī)肥發(fā)酵過程會發(fā)生兩個主要變化，一個是把復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)(纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等)分解為簡單的無機(jī)化合物，這是養(yǎng)分有效化的過程，稱之為礦質(zhì)化過程；另一個是有機(jī)物礦質(zhì)化過程中形成的中間產(chǎn)物，再合成為比原來更為復(fù)雜的腐殖質(zhì)，稱之為腐殖化過程。眾所周知，發(fā)酵是一個微生物的生化過程，需要使用細(xì)菌。不同硬度的秸稈，使用的菌種也不一樣。
經(jīng)檢索，中國專利數(shù)據(jù)庫中涉及發(fā)酵菌或菌劑的專利申請件不很多，檢索到的有zl2006101461458號《栓菌ah28－2固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法》、2011104132326號《一種大腸埃希氏菌rb3菌株及用它液態(tài)發(fā)酵制備乙酰酯酶的方法》、2014100753519號《一種西瓜用防病高產(chǎn)em菌劑發(fā)酵復(fù)合肥料》、2014100752658號《一種西瓜種植用em菌劑發(fā)酵復(fù)合肥料》、2015103288138號《一種鴿糞em菌發(fā)酵法》等，這些發(fā)酵菌劑并不能用于秸稈的發(fā)酵。適用于秸稈發(fā)酵的專利申請件有2011102578402號《一種秸稈發(fā)酵復(fù)合菌劑及其應(yīng)用》，系由枯草芽孢桿菌、黃綠木霉、釀酒酵母、米曲霉、擴(kuò)張青霉、綠色木霉復(fù)合而成。目前尚無用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑的專利申請件。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑的配制方法，用以提高硬質(zhì)秸稈的發(fā)酵速度，從而用于制造有機(jī)肥料，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。
發(fā)明人提供的用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑的配制方法包括以下步驟：
第一步，選定菌種：以真菌白腐菌和細(xì)菌枯草芽孢桿菌作為配制用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑的原料菌種；所述真菌白腐菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，真菌白腐菌對纖維素降解能力較強(qiáng)；所述細(xì)菌枯草芽孢桿菌自行篩選和培養(yǎng)的。
對于選用的原料菌種，都需要通過常規(guī)的手段，測定其對煙草主要病原菌拮抗作用，鑒定選用的活性菌株分子；確定其用于配制混合菌劑的可行性。
第二步，菌種的培養(yǎng)：
(1)真菌白腐菌的培養(yǎng)
①真菌白腐菌母種的培養(yǎng)
事先將玉米粒浸泡72h后裝袋，并于121℃下高壓蒸汽滅菌30-40min后冷卻備用；接著將活化后的白腐菌接種于玉米粒培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，等到菌絲長滿整個玉米粒之后備用；
②真菌白腐菌的擴(kuò)大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的白腐菌母種接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面長滿菌絲后，每48h翻拋1次，直到白腐菌布滿整個麥麩棉籽殼培養(yǎng)基。
(2)細(xì)菌枯草芽孢桿菌培養(yǎng)
①枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保存的枯草芽孢桿菌菌株在na固體培養(yǎng)基、平板上于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，然后挑取單菌落于種子培養(yǎng)基中，37℃，170r·min-1條件下培養(yǎng)16h作為種子液。
②枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵：將麥麩與按照質(zhì)量配比3∶1組成的棉籽殼混合物在121℃、30min間隔滅菌兩次，得到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基；然后將枯草芽孢桿菌種子液按10％的接種量接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基的添加量為20％，含水量為60％，發(fā)酵溫度為28℃，翻拋次數(shù)為1次/24h；實(shí)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵。
第三步白腐菌、枯草芽孢桿菌混合菌劑的配制
取第二步擴(kuò)大培養(yǎng)后的白腐菌和擴(kuò)大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌按照1∶3的質(zhì)量配比混合均勻，然后按照每包1000g的量裝入事先消毒殺菌的容器，儲存在陰涼、干燥、通風(fēng)、避光處、避免和有毒物品一起儲運(yùn)。在上述儲運(yùn)條件下保質(zhì)期18個月。
上述方法第一步中所述測定對煙草主要病原菌拮抗作用，是對煙草黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、煙草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)進(jìn)行拮抗試驗(yàn)；所述鑒定選用的活性菌株分子包括pcr擴(kuò)增、dna序列測定與分析。
上述方法第二步中所述混合培養(yǎng)基是麥麩棉籽殼與棉籽殼按照質(zhì)量配比3∶1的混合物，在121℃、30min間隔滅菌兩次制得的；所述na固體培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、瓊脂15-20g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5；所述種子培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5。
上述方法第三步中所述容器可以是包裝袋、包裝桶、包裝罐、玻璃瓶中的一種。
為了配制用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑，發(fā)明人進(jìn)行了以下研究與試驗(yàn)：
1拮抗細(xì)菌的分離、純化
1.1樣品的稀釋稱取煙草根際土壤樣品、有機(jī)肥各5g(精確到0.01g)，分別加入帶玻璃珠的45ml無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成樣品母液。對樣品母液進(jìn)行10倍倍比稀釋。
1.2加樣及培養(yǎng)每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，細(xì)菌取10-4、10-5、10-6。分別吸取不同稀釋度樣品懸浮液0.1ml，加至預(yù)先制備好的固體na培養(yǎng)基平板上，涂布直至液體被完全吸收，每個梯度3個重復(fù)。細(xì)菌放置于28℃條件下培養(yǎng)。
1.3分離細(xì)菌的純化、保存將分離得到的細(xì)菌通過平板劃線法進(jìn)行純化，并將純化物接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2分離細(xì)菌對煙草主要病原菌拮抗作用的測定
2.1指示煙草病原菌的選擇以煙草黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、煙草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)作為靶標(biāo)病原菌，利用平板對峙培養(yǎng)法和抑菌圈法，對分離得到的細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性篩選。
2.2細(xì)菌對煙草黑脛病菌的拮抗試驗(yàn)將供試煙草病原真菌分別在pda平板上活化3d后，用打孔器(直徑6mm)沿供試煙草病原菌菌落邊緣打取菌碟備用，將分離得到的菌株在na培養(yǎng)基平板上活化24h后，用接種環(huán)取一環(huán)優(yōu)勢菌株在pda平板中央劃線，供試煙草病原菌分別接種在pda平板兩側(cè)，接種點(diǎn)均距平板中心2.5cm。同時(shí)以只接種病原菌的平板為對照，每處理設(shè)3次重復(fù)，置于25℃光照培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3d時(shí)，逐日觀察記載病原菌菌落半徑，根據(jù)菌絲生長抑制率比較各分離菌株對供試煙草病原真菌的抑制效果。
菌落半徑＝測量菌落平均半徑–3.0mm
菌絲生長抑制率(％)＝(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100
2.3細(xì)菌對煙草青枯病菌的拮抗試驗(yàn)將細(xì)菌活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24h后，在無菌條件下用6mm打孔器制成菌碟，將菌碟放置于涂布接種有煙草青枯病菌的平板上，28℃培養(yǎng)，每隔12h觀察1次，培養(yǎng)48h后用十字交叉法測定抑菌圈的直徑，每處理重復(fù)3次，以無菌的培養(yǎng)基打孔代替菌碟做為對照(ck)。相對抑菌率(％)＝(抑菌圈直徑-菌碟直徑)/菌碟直徑×100％。
2.4細(xì)菌對煙草病原菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果
通過平板對峙培養(yǎng)和抑菌圈法篩選獲得1株對煙草青枯病菌、煙草黑脛病菌具有強(qiáng)拮抗作用的菌株，用于下一步鑒定。
3活性菌株的分子鑒定
3.1pcr擴(kuò)增
采用試劑盒法提取具有明顯抑菌活性細(xì)菌菌株的基因組dna(試劑盒購自上海生工生物工程有限公司)。擴(kuò)增和測序所用的引物為xjf:5’-agagtttgatcatggctcag-3’和xjr:5’-aaggaggtgatccagccgca-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。pcr反應(yīng)采用20μl反應(yīng)體系，包括模板dna溶液(濃度為50ng/μl)1μl、10×buffer2.0μl、dntp(濃度2.5mm)2.0μl、引物xjf(濃度10μmol/l)和xjr(濃度10μmol/l)各0.5μl、extaqdnapolymerase(5u/μl)0.5μl、加ddh2o至20μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s，72℃延伸90s，33個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用于膠回收。
3.2dna序列測定與分析
pcr產(chǎn)物用tiangelmidipurificationkit瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收，再與pmd18t-vector載體(大連takara公司)連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，重組質(zhì)粒純化后交由上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果用bioedit7.0軟件進(jìn)行分析，并將dna序列提交于genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast同源序列比對。
3.3活性菌株的分子鑒定結(jié)果
活性菌株經(jīng)分子鑒定為枯草芽孢桿菌(基因登錄號：kp777596)。
4白腐菌、枯草芽孢桿菌混合菌劑的比例設(shè)定
(1)將擴(kuò)大培養(yǎng)后的白腐菌和擴(kuò)大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌分別按照1∶3、2∶3、3∶2、3∶1的比例進(jìn)行混配，混合均勻后分別測不同配比菌劑的有效活菌數(shù)及蛋白酶酶活和纖維素酶酶活。
(2)4種配比混合菌劑的有效活菌數(shù)及酶活
4種配比混合菌劑的有效活菌數(shù)見表1。由表1可以看出，白腐菌：枯草芽孢桿菌(2∶3)配比濃度的混合菌劑，其真菌數(shù)量4.12×107個/g，細(xì)菌數(shù)量1.18×109個/g，其有效活菌數(shù)為1.2212×109。
4種配比混合菌劑的纖維素酶及蛋白酶活性見表2。由表2可看出，白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)配比濃度的混合菌劑纖維素酶及蛋白酶活性分別為77.5715u/g、53.0000u/g，均高于其他配比濃度的混合菌劑。
表14種配比混合菌劑的有效活菌數(shù)檢測結(jié)果(個/g)
表24種配比混合菌劑的纖維素酶及蛋白酶活性(u/g)白腐菌：枯草
結(jié)合有效活菌數(shù)和兩種酶的活性考慮，選擇白腐菌：枯草芽孢桿菌2∶3為最佳配比濃度。
采用本發(fā)明方法配制的混合菌劑，用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑，可有效地提高硬質(zhì)秸稈的發(fā)酵速度，從而用于制造有機(jī)肥料，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中秸稈的回收利用。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的菌劑與天地緣發(fā)酵菌的發(fā)酵溫度對比圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：配制用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑
選定真菌白腐菌和細(xì)菌枯草芽孢桿菌為配制用于硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑的原料菌種；真菌白腐菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)；細(xì)菌枯草芽孢桿菌自行培養(yǎng)；
對于選用的原料菌種，對煙草黑脛病菌(phytophthoraparasiticavar.nicotiana)、煙草青枯病菌(pseudomonassolanacearum)進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，測定其對煙草主要病原菌拮抗作用；通過pcr擴(kuò)增、dna序列測定與分析鑒定選用的活性菌株分子；確定其用于配制混合菌劑的可行性。
接著進(jìn)行菌種的培養(yǎng)：
(1)真菌白腐菌的培養(yǎng)
①真菌白腐菌母種的培養(yǎng)
事先將玉米粒浸泡72h后裝袋，并于121℃下高壓蒸汽滅菌30-40min后冷卻備用；接著將活化后的白腐菌接種于玉米粒培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，等到菌絲長滿整個玉米粒之后備用；
②真菌白腐菌的擴(kuò)大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的白腐菌母種接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基表面長滿菌絲后，每48h翻拋1次，直到白腐菌布滿整個麥麩棉籽殼培養(yǎng)基。所述混合培養(yǎng)基是麥麩棉籽殼與棉籽殼按照質(zhì)量配比3∶1的混合物，在121℃、30min間隔滅菌兩次制得的；
(2)細(xì)菌枯草芽孢桿菌培養(yǎng)
①枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保存的枯草芽孢桿菌菌株在na固體培養(yǎng)基、平板上于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，然后挑取單菌落于種子培養(yǎng)基中，37℃，170r·min-1條件下培養(yǎng)16h作為種子液。所述na固體培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、瓊脂15-20g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5；所述種子培養(yǎng)基是用牛肉膏3.0g、nacl5.0g、蛋白胨10.0g、水1000ml配制而得的，其ph7.2-7.5。
②枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵：將麥麩與按照質(zhì)量配比3∶1組成的棉籽殼混合物在121℃、30min間隔滅菌兩次，得到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基；然后將枯草芽孢桿菌種子液按10％的接種量接入到麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基中，麥麩棉籽殼混合培養(yǎng)基的添加量為20％，含水量為60％，發(fā)酵溫度為28℃，翻拋次數(shù)為1次/24h；實(shí)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的固體發(fā)酵。
最后，進(jìn)行白腐菌、枯草芽孢桿菌混合菌劑的配制：取擴(kuò)大培養(yǎng)后的白腐菌和擴(kuò)大培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌按照2∶3的質(zhì)量配比混合均勻，然后按照每包50kg的量裝入事先消毒殺菌的包裝袋，制得本發(fā)明的菌劑。
實(shí)施例2：實(shí)施本發(fā)明的硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑效果案例之一
在安徽省合肥市中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心實(shí)驗(yàn)室利用發(fā)酵箱來驗(yàn)證白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)在腐熟硬質(zhì)秸稈(甘蔗渣)上的實(shí)施效果。
試驗(yàn)表明：
1.白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)在用于一種硬質(zhì)秸稈(甘蔗渣)有機(jī)肥發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵平均溫度分別為33.3℃，高于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)(32.4℃)，而且高于50℃溫度天數(shù)達(dá)15天，比天地緣發(fā)酵菌(粉劑)多2天。
2.白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)的發(fā)酵菌劑在甘蔗渣有機(jī)肥生產(chǎn)中，能促進(jìn)有機(jī)肥中真菌、細(xì)菌、放線菌等微生物的生長，并對大腸桿菌、霉菌等微生物以及蛔蟲卵的生長起到一定的抑制作用，提高有機(jī)肥成品質(zhì)量，尤其是甘蔗渣有機(jī)肥成品的大腸桿菌達(dá)到ny884～2012生物有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)要求，好于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)。
表1可以看出白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵過程中有機(jī)肥微生物和蛔蟲卵數(shù)量的影響：
表1白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵過程中有機(jī)肥微生物和蛔蟲卵數(shù)量的影響
3.添加白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)的發(fā)酵菌劑生產(chǎn)的甘蔗渣有機(jī)肥成品的有機(jī)質(zhì)、總氮、總磷、總鉀和腐殖酸等養(yǎng)分指標(biāo)與天地緣發(fā)酵菌(粉劑)相當(dāng)，達(dá)到ny525～2012有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)要求。但白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)的發(fā)酵菌劑在發(fā)酵前期表現(xiàn)好。
表2白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵過程中有機(jī)肥主要化學(xué)成分的作用
實(shí)施例3實(shí)施本發(fā)明的硬質(zhì)秸稈發(fā)酵菌劑效果案例之二
2016年在貴州省興義市豬場坪有機(jī)肥工場利用有機(jī)肥規(guī)?，F(xiàn)場堆制來驗(yàn)證白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)在腐熟硬質(zhì)秸稈(甘蔗渣和煙桿混合材料)有機(jī)肥堆制中的實(shí)施效果(以當(dāng)前生產(chǎn)上使用效果較好的商品菌劑作對照)。
規(guī)模示范堆制表明：
⑴在硬質(zhì)秸稈(甘蔗渣和煙桿)有機(jī)肥規(guī)模堆制發(fā)酵過程中，白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)能能提高發(fā)酵溫度(特別是前期發(fā)酵溫度)和高于50℃溫度天數(shù)，有利于物料的分解和腐熟；其中平均發(fā)酵溫度為47.7℃高于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)(45.0℃)，且高于50℃溫度天數(shù)為21天，比天地緣發(fā)酵菌(粉劑)多9天。本發(fā)明的菌劑與天地緣發(fā)酵菌的發(fā)酵溫度對比見附圖1。
⑵利用白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)發(fā)酵后的有機(jī)肥質(zhì)量符合ny525-2012農(nóng)業(yè)部有機(jī)肥料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，且總磷、總鉀、總養(yǎng)分含量和ph分別高于天地緣發(fā)酵菌(粉劑)0.22、0.10、0.30、0.08個百分點(diǎn)。
表1白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵后有機(jī)肥質(zhì)量的影響
3白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)發(fā)酵能提高發(fā)酵后有機(jī)肥微生物數(shù)量，其中有益微生物細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量數(shù)量分別比天地緣發(fā)酵菌(粉劑)提高23.2％、97.1％、22.2％。
表2白腐菌∶枯草芽孢桿菌(2∶3)對發(fā)酵后有機(jī)肥有益微生物數(shù)量的影響