本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：紅豆杉，民間一般稱為“紫杉”，含有多種藥用成分。關(guān)于紅豆杉屬植物的藥用功能最早記載于《本草綱目》，可用于治療霍亂、傷寒等癥。《本草推陳》也對其藥用功能有過相關(guān)記載：“紫杉可入藥，利尿、通經(jīng)、治腎病，用皮易嘔吐，本部及葉不吐”。民間和傳統(tǒng)中醫(yī)藥對于紅豆杉屬植物的利用也有著悠久的歷史記載，用以消積、潤燥、利尿、通經(jīng)、消炎，并可治療多種腸道寄生蟲病。最新藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅豆杉屬植物具有抑菌斂毒、消炎排毒的作用，對上呼吸道炎癥具有治療作用，對糖尿病、腎臟病、高血壓和高血脂癥具有顯著療效。不同種的紅豆杉屬植物中紫杉醇含量不同，其藥效也就不同。如中國紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉以及曼地亞紅豆杉樹木各部位的平均含量均不同。因此，紅豆杉藥材的鑒別對于植物資源保護及中藥材安全合理利用都具有重要的意義。雖然通過植物形態(tài)學(xué)可以方便的對紅豆杉進行鑒定，但是，目前市場上的紅豆杉藥材大多為飲片或粉末，一經(jīng)加工成飲片或粉末后，很難利用常規(guī)中藥鑒定手段鑒別這些藥材來源于哪種紅豆杉屬植物。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究深入和發(fā)展，一些分子標(biāo)記技術(shù)如限制性片段長度多態(tài)性、隨機擴增多肽dna、issr標(biāo)記、aflp技術(shù)等得到了廣泛應(yīng)用。這些方法各具優(yōu)勢但也存在很多不足。rflp技術(shù)穩(wěn)定、重復(fù)性強，但探針制備繁瑣；rapd方法可以很好的揭示親緣物種間的演化關(guān)系，但受實驗條件限制較大且不穩(wěn)定；issr標(biāo)記具有快速、簡便及多態(tài)性高等優(yōu)點，但其引物通用性較差，造作要求高花費大。一方面，由于中藥在制備過程中其dna嚴(yán)重破壞，且大量損失，因此成品中所含dna含量極少，片段極短，如何富集這些僅有的少量dna片段是必須面臨的一個挑戰(zhàn)；另一方面，紅豆杉藥材中最主要的成分是各種蛋白，這些蛋白的存在必然對dna提取和純化工作造成嚴(yán)重干擾，因此影響到后續(xù)的鑒定效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠富集市售中藥紅豆杉樣品中含量較少、片段極短的dna，進而快速、準(zhǔn)確鑒定其品種的方法，本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4。優(yōu)選的，所述引物對p1、p2的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.5。表1引物對及發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fatgcgatacttggtgtgaat1p1-rgacgcttctccagactacaat2p2-faagtaaaagtcgtaacaagg3p2-rtcctccgcttattgatatgc4發(fā)卡結(jié)構(gòu)cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在制備鑒定中藥紅豆杉試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。優(yōu)選的，所述試劑盒鑒定中藥紅豆杉的步驟包括：(1)提取市售紅豆杉藥材樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50～100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)收集第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。進一步的，所述紅豆杉樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。進一步的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。有益效果：(1)本發(fā)明所述引物對能夠以含量極少、片段極短的紅豆杉樣品dna為模板，快速、準(zhǔn)確鑒定紅豆杉的品種；(2)本發(fā)明采用連續(xù)兩輪pcr的方法保證鑒定成功率為100％。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑒定結(jié)果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；2為實施例2pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；3為實施例3pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果。具體實施方式實施例1一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4。所述引物對p1、p2的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.5。所述引物對在制備鑒定中藥紅豆杉試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥紅豆杉的步驟包括：(1)提取市售紅豆杉藥材樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)收集第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述紅豆杉樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。實施例2一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4。所述引物對p1、p2的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.5。所述引物對在制備鑒定中藥紅豆杉試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥紅豆杉的步驟包括：(1)提取市售紅豆杉藥材樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋80倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)收集第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述紅豆杉樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。實施例3一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4。所述引物對p1、p2的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.5。所述引物對在制備鑒定中藥紅豆杉試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥紅豆杉的步驟包括：(1)提取市售紅豆杉藥材樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)收集第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述紅豆杉樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，條帶清晰可見，產(chǎn)物單一。sequencelisting<110>蘇州市李良濟健康產(chǎn)業(yè)有限公司<120>一種用于鑒定中藥紅豆杉的引物對及其應(yīng)用<130><160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atgcgatacttggtgtgaat20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gacgcttctccagactacaat21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3aagtaaaagtcgtaacaagg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4tcctccgcttattgatatgc20<210>5<211>40<212>dna<213>人工序列<400>5cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當(dāng)前第1頁12