本發(fā)明屬于白僵菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種白僵菌固體培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

白僵菌是一類對農(nóng)林害蟲寄主范圍廣且致病性強的昆蟲病原真菌，因其易培養(yǎng)、不寄生天敵、對環(huán)境友好、適宜條件下易形成流行病等特點，成為目前國內(nèi)外研究最多應用最廣的害蟲生防病原真菌，已成功用于大規(guī)模防治松毛蟲、玉米螟、蠐螬和大豆食心蟲等多種重要的農(nóng)林業(yè)害蟲。

目前，白僵菌大量培養(yǎng)的主要方式有液體發(fā)酵、固體發(fā)酵和液固兩相發(fā)酵。白僵菌液體發(fā)酵時間短，主要產(chǎn)物為芽生孢子和菌絲體，但這兩種產(chǎn)物的存活時間較短，不宜加工為制劑形式；固體發(fā)酵和液固兩相發(fā)酵時間長，但均可產(chǎn)生貯存期較長的分生孢子?，F(xiàn)有研究與生產(chǎn)工藝中，固體發(fā)酵和液固兩相發(fā)酵所用到的固體培養(yǎng)基通常選用豆粉、玉米粉、蠶蛹粉、麥麩、細米糠或甘蔗渣及其他農(nóng)副產(chǎn)品為基質(zhì)，多采用兩種及以上基質(zhì)混合，各組分比例需嚴格控制，同時還需加入蛭石、稻谷殼等填充料，以在發(fā)酵過程中起到排濕、通氣的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種白僵菌固體培養(yǎng)基及其制備方法，本發(fā)明提供的白僵菌固體培養(yǎng)基價格低廉，來源充足，且用于白僵菌培養(yǎng)時，發(fā)酵周期短，產(chǎn)孢量高。

本發(fā)明提供了一種白僵菌固體培養(yǎng)基，以玉米顆粒作為基質(zhì)。

本發(fā)明以玉米顆粒作為白僵菌固體培養(yǎng)基基質(zhì)，原料來源易得，價格較低，多數(shù)地區(qū)可以就地取材，減少了運輸費用，大大降低了生產(chǎn)成本，適合不同規(guī)模企業(yè)及研究單位進行白僵菌研究與生產(chǎn)，具有顯著的經(jīng)濟價值和良好的應用前景。

在本發(fā)明中，所述玉米顆粒可以是玉米粉碎后的玉米顆粒，其粒徑為2mm～4mm，含水量為20％～30％。

在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)基還包括氮源；所述氮源選自花生粉、豆粉、魚粉、酵母粉或牛肉膏，添加量為玉米顆粒的0.2～1wt％。

在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)基還包括無機鹽，所述無機鹽包括kh2po4、mgso4·7h2o和kno3。所述無機鹽以水溶液的形式加入到玉米顆粒中，無機鹽水溶液包括0.05wt％的kh2po4、0.01wt％的mgso4·7h2o、0.2wt％的kno3，按玉米顆粒的0.2％～0.6wt％添加。

本發(fā)明還提供了一種白僵菌固體培養(yǎng)基的制備方法，包括：

將玉米顆粒浸泡，撈出控水加油攪拌均勻后滅菌，得到固體培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述玉米顆粒由玉米經(jīng)過粉碎機粉碎后得到，其粒徑為2mm～4mm，大小顆?；祀s即可。

將玉米顆粒在水中浸泡使其吸水，所述浸泡的溫度為常溫，浸泡至玉米顆粒含水量為20％～30％，優(yōu)選至25％。將玉米顆粒撈出并控干多余水分，添加少量植物油防止后續(xù)滅菌過程中玉米顆粒黏成團，所述油可以是色拉油，添加量為玉米顆粒重量的0.5％左右。

將玉米顆粒與油混合均勻后滅菌前還可以加入氮源和/或無機鹽水溶液，混合均勻。其中，所述氮源選自花生粉、豆粉、魚粉、酵母粉或牛肉膏，添加量為玉米顆粒的0.2～1wt％。所述無機鹽水溶液包括0.05wt％的kh2po4、0.01wt％的mgso4·7h2o、0.2wt％的kno3，按玉米顆粒的0.2％～0.6wt％添加。

混合均勻后，將混合物料裝入容器內(nèi)進行滅菌，所述滅菌的溫度為121～125℃；壓力為0.1～0.15mpa；時間為30～60分鐘。滅菌完畢后即可得到白僵菌固體培養(yǎng)基。

該白僵菌固體培養(yǎng)基既可以用于白僵菌的固體發(fā)酵，也可以用于白僵菌的液固兩相發(fā)酵。

本發(fā)明還提供了一種白僵菌的培養(yǎng)方法，包括：

將白僵菌接種至上述技術(shù)方案所述的固體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

獲得固體培養(yǎng)基后，將白僵菌接種液接種培養(yǎng)即可。

其中，白僵菌接種液可以孢懸液、菌絲體或芽生孢子的形式接入固體培養(yǎng)基中，濃度為5×10⁶～5×10⁷個/ml，接種量為10～20％(v/w)。

在本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20～26℃，可以采用袋裝或盒裝等密閉式培養(yǎng)，也可采用淺盤、培養(yǎng)池等開放式培養(yǎng)。

在一個實施例中，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，首先密閉培養(yǎng)，待長滿菌絲體后，在托盤中采用開放式培養(yǎng)。在菌絲生長階段采用密閉培養(yǎng)，可保證培養(yǎng)料的濕度維持在較高水平，在滿足菌絲生長的需要的同時，還可以降低培養(yǎng)基污染的概率；產(chǎn)孢階段將培養(yǎng)料倒在托盤中采用開放式培養(yǎng)，此時固料已布滿白僵菌菌絲，不易污染雜菌，同時可降低培養(yǎng)濕度，有利于分生孢子的形成及成熟脫落。

上述培養(yǎng)完成后，將固體培養(yǎng)基在干燥通風處晾干，待培養(yǎng)料含水量低于5％時，可通過分孢器分離獲得分生孢子粉，加工為可濕性粉劑、粉劑或油懸劑等劑型；也可以直接將培養(yǎng)料進行二次粉碎直接施用到田間，既起到殺蟲作用，培養(yǎng)料也可作為土壤肥料。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明以玉米為固體培養(yǎng)基，由于玉米顆粒本身具有一定的粒徑，培養(yǎng)基本身形成一定的間隙，因此培養(yǎng)過程中無需額外通氣，無需添加其他填料增加透氣性。

(2)該發(fā)明操作過程較為簡單，容易實現(xiàn)規(guī)模批量生產(chǎn)，生產(chǎn)條件和生產(chǎn)過程可人為調(diào)控，生產(chǎn)質(zhì)量容易控制。固體發(fā)酵基質(zhì)可經(jīng)分孢器獲得含量較高的分生孢子粉，進一步加工為可濕性粉劑等多種劑型；也可以直接將玉米培養(yǎng)料直接二次粉碎，通過撒施、溝施或穴施施用到田間，使用更加方便快捷。

(3)本發(fā)明固體培養(yǎng)基主要基質(zhì)為玉米，相對于白僵菌其他固體培養(yǎng)基，原料來源易得，價格較低，多數(shù)地區(qū)可以就地取材，減少了運輸費用，大大降低了生產(chǎn)成本。適合不同規(guī)模企業(yè)及研究單位進行白僵菌研究與生產(chǎn)，具有顯著的經(jīng)濟價值和良好的應用前景。

(4)本發(fā)明提供的固體培養(yǎng)基可用于白僵菌固體發(fā)酵和液固兩相發(fā)酵工藝，培養(yǎng)方法操作方便，發(fā)酵周期短，產(chǎn)孢量高。

具體實施方式

實施例1接種白僵菌孢懸液的固體培養(yǎng)方法

1孢懸液制備

1.1菌種活化：將低溫保存的白僵菌菌株jcf(保藏編號為cgmccno.11338)在試管斜面上活化培養(yǎng)，所用活化培養(yǎng)基為通用的sday培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為26±1℃，斜面長滿孢子后即可使用。

1.2孢懸液制備：將1.1中斜面上的分生孢子轉(zhuǎn)接到sday平板培養(yǎng)基，產(chǎn)孢后用0.1％吐溫-80無菌水漂洗孢子，震蕩懸浮制成孢懸液，調(diào)整濃度為1×10⁷孢子/ml。

2固體培養(yǎng)

2.1固體培養(yǎng)基制作：玉米用粉碎機打成碎顆粒，大小為2～4mm左右，加水浸泡4h，平均含水量為25wt％，撈出控去多余水分，加0.2％魚粉作為氮源，加0.5％色拉油以防粘連，攪拌均勻后分裝到40cm×22cm大小的聚丙烯pp塑料袋內(nèi)，每袋裝400g濕料。用直徑4cm、長6cm的聚丙烯pp管扎口，管口依次用三層棉布和封口膜封口，121℃高溫蒸汽滅菌40min，形成固體培養(yǎng)基。

2.2接種及培養(yǎng)：將已滅菌的固體培養(yǎng)基放置在接種室中，待冷卻后在無菌操作臺中按10％(v/w)比例接入白僵菌孢懸液并抖落均勻，去掉最外層封口膜，將固體料平鋪展開放置在培養(yǎng)箱中，24±2℃條件下培養(yǎng)，無需額外增加濕度，24h～48h內(nèi)，翻動2次固料以增加底部固料通氣量，同時也可避免發(fā)酵過程中熱量累積而出現(xiàn)“燒料”現(xiàn)象。4～5d時，待固體培養(yǎng)料長滿白僵菌菌絲后，將固體培養(yǎng)料倒在托盤中進行開放式培養(yǎng)，有利于孢子脫落，固體料厚度以3～4cm為宜，此時培養(yǎng)箱濕度應低于50％。

2.3培養(yǎng)料處理：白僵菌形成分生孢子后，將固料置于通風處或干燥間內(nèi)晾干，固料含水量低于5％時粉碎后即可得粗粉劑。

2.4培養(yǎng)結(jié)果：固體發(fā)酵周期為8d，固體培養(yǎng)料晾干后，隨機稱取3g放在裝有玻璃珠的100ml0.1％吐溫-80水中，震蕩，使分生孢子充分洗脫，血球計數(shù)板計數(shù)，3次測量取平均值，培養(yǎng)物分生孢子含量為1.8×10¹⁰個/克料。

實施例2接種白僵菌菌絲體的固體培養(yǎng)方法

1菌絲體種子液制備：

1.1菌種活化：方法同實施例1。

1.2菌懸液制備：方法同實施例1，孢懸液濃度為5×10⁷孢子/ml。

1.3搖瓶培養(yǎng)：在500ml三角瓶中裝入sdy培養(yǎng)基100ml，121℃高溫蒸汽滅菌30min，待冷卻后，在無菌操作臺中，按1％接種量接入孢懸液，26±1℃、200rpm恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)20h后，形成菌絲體即可作為白僵菌固體培養(yǎng)的種子液。

2固體培養(yǎng)

2.1固體培養(yǎng)基制作：方法同實施例1，氮源為0.8％花生粉。

2.2接種及培養(yǎng)：將接種后混合均勻的固體培養(yǎng)料倒在滅菌消毒的培養(yǎng)盒中培養(yǎng)，其他方法同實施例1。

2.3培養(yǎng)料處理：方法同實施例1。

2.4培養(yǎng)結(jié)果：固體發(fā)酵周期為6d，血球計數(shù)板計數(shù)，3次測量取平均值，培養(yǎng)物分生孢子含量為4.5×10¹⁰個/克料。

實施例3接種白僵菌芽生孢子的固體培養(yǎng)方法

1芽生孢子種子液制備：

1.1菌種活化：方法同實施例1。

1.2菌懸液制備：方法同實施例1，孢懸液濃度為5×10⁶孢子/ml。

1.3搖瓶培養(yǎng)：在500ml三角瓶中裝入sdy培養(yǎng)基100ml，121℃高溫蒸汽滅菌30min，待冷卻后，在無菌操作臺中，按1％接種量接入孢懸液，26±1℃、200rpm恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)28h后，形成大量芽生孢子即可作為固相發(fā)酵的種子液。

2固體培養(yǎng)

2.1固體培養(yǎng)基制作：同實施例1，氮源為0.5％豆粉。

2.2接種及培養(yǎng)：同實施例1。

2.3培養(yǎng)料處理：同實施例1。

2.4培養(yǎng)結(jié)果：固體發(fā)酵周期為8d，血球計數(shù)板計數(shù)，3次測量取平均值，培養(yǎng)物分生孢子含量為3.2×10¹⁰/克料。

實施例4在固體培養(yǎng)基中添加無機鹽

1菌絲體種子液制備：

1.1菌種活化：方法同實施例1。

1.2菌懸液制備：方法同實施例1，孢懸液濃度為5×10⁷孢子/ml。

1.3搖瓶培養(yǎng)：方法同實施例2。

2固體培養(yǎng)

2.1固體培養(yǎng)基制作：方法同實施例1，氮源為1％牛肉膏，在固體培養(yǎng)基中按濕料重的0.4％添加無機鹽水溶液(成分為0.05％kh2po4、0.01％mgso4·7h2o、0.2％kno3)。

2.2接種及培養(yǎng)：同實施例1。

2.3培養(yǎng)料處理：同實施例1。

2.4培養(yǎng)結(jié)果：固體發(fā)酵周期為6d，血球計數(shù)板技術(shù)，3次測量取平均值，培養(yǎng)物分生孢子含量為6.5×10¹⁰/克料。

比較例1

為更進一步說明玉米發(fā)酵培養(yǎng)基工藝簡單、發(fā)酵周期短，比較了白僵菌jcf(保藏編號為cgmccno.11338)在玉米發(fā)酵培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、常規(guī)真菌培養(yǎng)基sday及pda的發(fā)酵水平，結(jié)果參見表1，表1為本發(fā)明比較例提供的白僵菌在不同固體培養(yǎng)基上的生長情況及產(chǎn)孢水平。

表1白僵菌在不同固體培養(yǎng)基上的生長情況及產(chǎn)孢水平

表1中，玉米培養(yǎng)基即為實施例1制備的固體培養(yǎng)基，大米培養(yǎng)基基質(zhì)為低值粳米，玉米粉培養(yǎng)基成分包括4％玉米粉、1.5％瓊脂和余量的水。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。