本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及hcbp6單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、丙型肝炎病毒(hcv)作為輸血傳播的非甲非乙型病毒性肝炎(nanb)h的主要病原體，是一種單股正鏈rna病毒，屬于黃病毒屬，因此hcv感染的發(fā)病機(jī)制與乙型肝炎病毒(hbv)這種dna病毒有很大的區(qū)別，hcv與肝細(xì)胞之間的相互作用，可能是hcv感染發(fā)病機(jī)制的重要部分。hcv核心蛋白對(duì)感染的肝細(xì)胞中基因表達(dá)譜產(chǎn)生影響，同時(shí)，hcv核心蛋白自身結(jié)合形成同二聚體結(jié)構(gòu)，也可以與肝細(xì)胞中其他類型的蛋白之間進(jìn)行結(jié)合，形成異二聚體或多聚體結(jié)構(gòu)，對(duì)肝細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。hcv感染除了引起急性和慢性病毒性肝炎、肝纖維化、肝細(xì)胞癌(hc)c，還包括肝臟脂肪變、b細(xì)胞淋巴瘤、冷球蛋白血癥等。

2、脂肪性肝病是rokitansky根據(jù)肥胖癥患者肝臟組織肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉積而命名。依據(jù)患者是否存在長(zhǎng)期大量飲酒史分為酒精性脂肪性肝病(alcoholic?liverdisease，ald)及非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic?fatty?liver?disease，nafld)。nafld指既往無(wú)大量飲酒史(折合乙醇量男性＜30g/d，女性＜20g/d)及其他明確的肝損傷因素(肝炎病毒、自身免疫、藥物等)，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為特征的臨床病理綜合征。

3、近年來(lái)由于人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，nafld全球發(fā)病率持續(xù)升高，但對(duì)于nafld的發(fā)病機(jī)制尚未明確，尚無(wú)理想的治療方案。丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6(hepatitis?c?virus?core-binding?protein?6，hcbp6)是利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出的可與丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合的蛋白之一，hcbp6在抑制脂肪性肝病的發(fā)生或糖脂代謝中具有重要作用。

4、通過(guò)分析脂肪性肝病患者與健康對(duì)照者血清hcbp6的表達(dá)差異，為hcbp6作為nafld治療靶點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外有效檢測(cè)hcbp6水平的原料十分缺乏，研發(fā)出一種檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6(hcbp6)的原料迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供hcbp6單克隆抗體及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了hcbp6單克隆抗體，其包括抗體1和/或抗體2，

3、所述抗體1的重鏈可變區(qū)的具有如seq?id?no:1、2或3所示的氨基酸序列中的至少一種；

4、所述抗體1的輕鏈可變區(qū)的具有如seq?id?no:4、5或6所示的氨基酸序列中的至少一種；

5、所述抗體2的重鏈可變區(qū)的具有如seq?id?no:9、10或11所示氨基酸序列中的至少一種；

6、所述抗體2的輕鏈可變區(qū)的具有如seq?id?no:12、13或14所示氨基酸序列中的至少一種。

7、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體，

8、所述抗體1的重鏈可變區(qū)具有如seq?id?no:7所示的氨基酸序列；

9、所述抗體1的輕鏈可變區(qū)具有如seq?id?no:8所示的氨基酸序列；

10、所述抗體2的重鏈可變區(qū)具有如seq?id?no:15所示的氨基酸序列；

11、所述抗體2的輕鏈可變區(qū)具有如seq?id?no:16所示的氨基酸序列。

12、更進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體，

13、所述抗體1的重鏈恒定區(qū)為鼠igg1亞型；所述輕鏈恒定區(qū)為鼠κ1型；

14、所述抗體2的重鏈恒定區(qū)為鼠igg1亞型；所述輕鏈恒定區(qū)為鼠κ1型。

15、本發(fā)明所述的抗體，經(jīng)過(guò)抗原篩選后經(jīng)免疫小鼠獲得的38個(gè)抗體中篩選獲得；本發(fā)明將所述38個(gè)抗體，分別單獨(dú)包被于nc膜或進(jìn)行膠體金標(biāo)記后進(jìn)行組合排列，共有1444中排列組合方式，將這1444中排列組合制備的膠體金試紙條用于質(zhì)控品和臨床樣本的檢測(cè)，其中有20個(gè)組合方式檢測(cè)結(jié)果較好，其中以抗體編號(hào)38標(biāo)記，抗體編號(hào)9包被的效果最好。

16、本發(fā)明提供了免疫獲得本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體的抗原多肽，所述抗原多肽具有如下i)～iii)所示氨基酸序列中的至少一種：

17、i)、如seq?id?no:18所示的氨基酸序列；或

18、ii)、如(i)所述的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

19、iii)、與如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列。

20、本發(fā)明所述的hcbp6抗原多肽，是經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資料和在線工具對(duì)蛋白結(jié)果進(jìn)行分析后篩選獲得，試驗(yàn)結(jié)果表明，與其他序列相比較，氨基酸序列如seq?id?no:18所示的hcbp6抗原多肽的免疫原性最好，免疫后血清滴度更高，更利于抗體的生產(chǎn)。

21、本發(fā)明提供了重組抗原，其包括本發(fā)明所述的抗原多肽和載體蛋白。

22、進(jìn)一步的，所述載體蛋白包括血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白和/或雞卵白蛋白中的至少一種。

23、本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述載體蛋白為血藍(lán)蛋白，其作為抗原載體蛋白，用于提高h(yuǎn)cbp6抗原多肽的免疫原性。

24、本發(fā)明提供了生物材料，其包括如下i)～iv)所示中的至少一種：

25、i)、本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體或本發(fā)明所述的抗原多肽或本發(fā)明所述的重組抗原的核酸；

26、ii)、包含載體骨架和如i)所示核酸的重組載體；

27、iii)、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化如ii)所示重組載體的宿主細(xì)胞；

28、iv)、培養(yǎng)如iii)所示宿主細(xì)胞獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物。

29、本發(fā)明中，所述核酸可以是dna、rna、cdna或pna。所述dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。所述dna可以是單鏈的或是雙鏈的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如編碼區(qū)和非編碼區(qū)如調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止子)。核酸在拓?fù)鋵W(xué)上可以是線性或環(huán)狀的。核酸可以是載體(如表達(dá)或克隆載體)的一部分，或一個(gè)片段。所述核酸可直接從天然來(lái)源獲得，或者可由重組、酶法或化學(xué)技術(shù)輔助制備。所述rna形式為由基因轉(zhuǎn)錄獲得的mrna等。

30、本發(fā)明中，所述的重組載體，所述載體骨架的來(lái)源包括植物載體、動(dòng)物載體、細(xì)菌載體、真菌載體、噬菌體載體、或病毒載體等，本發(fā)明對(duì)此不做限定。

31、本發(fā)明所述重組載體，是指重組的核酸載體，是一種重組dna分子，其包含期望的編碼序列和對(duì)可操作連接的編碼基因在具體宿主生物內(nèi)的表達(dá)所必不可少的合適的核酸序列或元件。

32、本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化如本發(fā)明所述的重組載體。

33、進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化的方法包括：化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化；所述轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣共沉淀、人工脂質(zhì)體法、病毒轉(zhuǎn)染。所述的病毒轉(zhuǎn)染包括腺病毒轉(zhuǎn)染、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染等。

34、本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞，其來(lái)源包括植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、噬菌體或病毒，本發(fā)明對(duì)此不做限定。

35、本發(fā)明提供了所述的hcbp6單克隆抗體或所述的抗原多肽或所述的重組抗原的制備方法，其通過(guò)培養(yǎng)如本發(fā)明所述的生物材料中的宿主細(xì)胞，獲得所述hcbp6單克隆抗體或抗原多肽或重組抗原。

36、本發(fā)明提供了標(biāo)記抗體，其包括本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體和標(biāo)記物。

37、進(jìn)一步的，所述標(biāo)記物包括化學(xué)標(biāo)記物和/或生物標(biāo)記物；所述的生物標(biāo)記物包括生物素、親和素或酶中的至少一種；所述的化學(xué)標(biāo)記包括同位素和/或化學(xué)藥物。

38、本發(fā)明提供了偶聯(lián)物，其包括本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體和偶聯(lián)介質(zhì)。

39、進(jìn)一步的，所述的偶聯(lián)介質(zhì)包括納米顆粒，所述納米顆粒包括金納米顆粒，本發(fā)明對(duì)此不作限定。

40、本發(fā)明提供了如下a)～f)所示中的至少一種在制備hcbp6檢測(cè)或脂肪肝診斷的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

41、a)、本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體；

42、b)、本發(fā)明所述的抗原多肽；

43、c)、本發(fā)明所述重組抗原；

44、d)、本發(fā)明所述的生物材料；

45、e)、本發(fā)明所述的標(biāo)記抗體；

46、f)、本發(fā)明所述的偶聯(lián)物。

47、本發(fā)明提供了hcbp6檢測(cè)或脂肪肝診斷的產(chǎn)品，其原料包括如下a)～d)所示中的至少一種：

48、a)、本發(fā)明所述的hcbp6單克隆抗體；

49、b)、本發(fā)明所述的生物材料；

50、c)、本發(fā)明所述的標(biāo)記抗體；

51、d)、本發(fā)明所述的偶聯(lián)物。

52、本發(fā)明所述的產(chǎn)品，其包括檢測(cè)試劑盒和/或試紙條；

53、所述試劑盒還可以包括用于輔助檢測(cè)的溶劑或溶液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品等。在實(shí)際應(yīng)用中，本發(fā)明所述的試劑盒可為酶聯(lián)免疫試劑盒；

54、所述試紙條還包括載體基質(zhì)，如nc膜、金標(biāo)墊、吸水墊、樣品墊等，具體的，本發(fā)明所述的試紙條可為膠體金檢測(cè)試紙條。

55、本發(fā)明提供了hcbp6檢測(cè)或脂肪肝診斷的方法，其為利用本發(fā)明所述的產(chǎn)品對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

56、進(jìn)一步的，所述樣本包括血清和/或血漿。

57、本發(fā)明采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資料和在線工具對(duì)hcbp6蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，篩選獲得具有高免疫原性的hcbp6抗原多肽，經(jīng)免疫獲得抗體1和抗體2，所述抗體1和抗體2的組合用于hcbp6的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)效果好，具有較高的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值，在脂肪肝的輔助診斷領(lǐng)域具有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。