本發(fā)明涉及生物，具體而言，涉及eco31i限制性內切酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術：

1、限制性內切酶是一種能夠識別雙鏈dna分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割dna鏈中的磷酸二酯鍵的一類酶，簡稱限制酶。不同的限制性內切酶會識別不同的dna序列，它可以在識別序列內或距識別序列相鄰位置處切割dna，酶切之后會形成不同類型的產物，如平末端或黏性末端產物。

2、眾所周知，限制性內切酶最常用于分子克隆實驗中。但除了克隆，它還可以應用于疫苗研發(fā)生產、基因測序、snp鑒定、ddpcr等領域。根據結構的復雜程度、作用方式與輔因子的區(qū)別，限制性內切酶大致可分為四大類：i型酶、ii型酶、iii型酶和iv型酶。其中，ii型限制性內切酶的特點是只具有識別切割的作用，無修飾活性；識別序列多為短的回文序列(一般為4-8bp)，切割位于識別序列內或鄰近識別序列的位點，產生帶3’羥基和5’磷酸基團的dna產物，作用時需要mg2+，是分子克隆中最常用的一類限制酶。

3、ii型限制性內切酶又被進一步細分成iip、iia、iib、iic、iis等子類別。eco31i限制性內切酶屬于iis型，其與bsai、bso31i、bsptni互為同裂酶，均為應用較為廣泛的限制性內切酶。eco31i可特異性識別六個堿基的核酸序列(5’ggtctcn^nnnn^3’)位點，該類酶的一個突出特點是對切割位點的序列沒有要求。利用其特性衍生而出的無縫克隆技術，能以任何順序無縫組裝多個dna片段到兼容載體上。此外，eco31i不僅在分子克隆，在生物領域的其他方向，例如mrna疫苗體外轉錄模板的制備等，也具有重要的應用價值。

4、不同于其他類型酶的制備過程，在原核表達體系中單一的重組表達限制酶時，由于宿主自身的dna不會被甲基化酶修飾，所產生的限制酶對宿主dna進行切割，造成宿主細胞死亡。針對這一現象，相關科學家在原核表達體系中引入甲基轉移酶基因。甲基轉移酶在識別序列上的特異性修飾可防止限制酶的切割。限制酶-甲基轉移酶基因常緊密連鎖，細菌通過調控兩者的表達，使自身dna首先受到甲基化保護，保護完成后再表達限制酶，而入侵的異源dna并沒有受到保護因而被限制酶降解。即胞內相關的甲基轉移酶對與其配對限制酶識別的相同特定序列進行甲基化修飾，并使修飾的dna具有抵抗其限制酶的切割的特性，保護宿主dna而降解未被甲基化的外源dna。

5、但細菌對限制酶和甲基轉移酶的調控往往是不平衡的。這種不平衡往往會導致野生型eco31i低表達甚至不表達，導致分離純化程序繁瑣、蛋白得率低等問題，造成目前市售的eco31i限制酶不僅價格高，而且也限制了它的廣泛應用及深入研究。同時，以上提及的一系列問題也間接影響了eco31i的酶活，使得野生型eco31i的酶切速率慢，常需要1h左右的時間才能完全酶切1μg質粒，這種長時間的酶切往往容易出現酶星號活性的情況，導致引入不期望的切割結果。

6、因此，提供一種表達量高、分離純化程序簡單、蛋白得率高、價格低廉且酶切效率較好的eco31i限制性內切酶及其制備方法具有重要意義。

7、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于提供eco31i限制性內切酶突變體及其制備方法和應用。

2、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第一個方面，提供了一種用于識別并切割dna的方法，該方法包括以下步驟：

3、(a)在切割體系中加入dna片段和eco31i限制性內切酶產生反應混合物，上述eco31i限制性內切酶包含在對應于seq?id?no:1的第283位或其他eco31i限制性內切酶等價位點處的氨基酸取代；和

4、(b)在適合于dna片段切割的條件下孵育所述反應混合物以產生上述片段的dna切割產物。

5、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第二個方面，提供了一種eco31i限制性內切酶的制備方法，該方法包括以下步驟：

6、(a)選擇在seq?id?no:1的第283位或其他eco31i限制性內切酶等價位點處的氨基酸發(fā)生取代的eco31i限制性內切酶進行純化；和

7、(b)得到上述eco31i限制性內切酶。

8、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第三個方面，提供了一種eco31i限制性內切酶，上述eco31i限制性內切酶包括在seq?id?no:1的第283位或其他eco31i限制性內切酶等價位點處的氨基酸取代。

9、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第四個方面，提供了一種偶聯(lián)物，其含有上述eco31i限制性內切酶和用于純化的標記物。

10、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第五個方面，提供了一種分離的核酸，其編碼上述eco31i限制性內切酶的氨基酸。

11、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第六個方面，提供了一種重組載體，其含有上述分離的核酸。

12、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第七個方面，提供了一種宿主細胞，其含有上述的載體。

13、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第八個方面，提供了一種試劑盒，其包括上述的eco31i限制性內切酶。

14、為了實現上述目的，根據本發(fā)明的第九個方面，提供了上述的eco31i限制性內切酶在dna切割中的應用。

15、與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

16、本發(fā)明優(yōu)化的eco31i限制性內切酶突變體突破了常規(guī)eco31i限制性內切酶無法在甲基化宿主中表達的問題，能夠在甲基化宿主中高效表達，具備優(yōu)越的酶切效率，可應用于大片段的線性化，具有切割時間短，副產物少等優(yōu)點。

技術特征：

1.一種用于識別并切割dna的方法，其包括：

2.一種eco31i限制性內切酶的制備方法，其包括：

3.一種eco31i限制性內切酶，其特征在于，所述eco31i限制性內切酶包括在seq?idno:1的第283位或其他eco31i限制性內切酶等價位點處的氨基酸取代。

4.根據權利要求1～3任一項所述的方法、制備方法或eco31i限制性內切酶，其特征在于，所述seq?id?no:1的第283位或其他eco31i限制性內切酶等價位點處的氨基酸取代為q283-。

5.根據權利要求4所述的方法、制備方法或eco31i限制性內切酶，其特征在于，所述eco31i限制性內切酶相對于seq?id?no:1所示的eco31i限制性內切酶具有改變的切割效率或表達量發(fā)生改變。

6.根據權利要求4所述的方法、制備方法或eco31i限制性內切酶，其特征在于，所述eco31i限制性內切酶還包括以下任意一個或多個位置的氨基酸取代：在seq?id?no:1的第138、181、237、240、255、256、259、262、264、271、274、278、311、326、333、334、337、340、345、361、372、457、459、460、472或475位；

7.一種偶聯(lián)物，其特征在于，其含有權利要求1～6任一項所述的eco31i限制性內切酶和用于純化的標記物。

8.一種分離的核酸、重組載體或宿主細胞，其特征在于，所述分離的核酸編碼權利要求1～6任一項所述的eco31i限制性內切酶，所述重組載體含有所述分離的核酸，所述宿主細胞含有所述重組載體。

9.一種試劑盒，其特征在于，其包括權利要求1～6任一項所述的eco31i限制性內切酶。

10.權利要求1～6任一項所述的eco31i限制性內切酶在dna切割中的應用。

技術總結
本發(fā)明公開了限制性內切酶Eco31I突變體及其制備方法和應用，涉及生物技術領域。本發(fā)明提供的限制性內切酶Eco31I突變體能夠在甲基化宿主中高效表達，具備優(yōu)越的酶切效率，可應用于大片段的線性化，具有切割時間短，副產物少等優(yōu)點。

技術研發(fā)人員：潘華路,章瑞程,陳雪祎,林喆,吳鳳依,李麗琪
受保護的技術使用者：廣東菲鵬生物有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/15