本發(fā)明涉及用于制備含有用以鑒別活共培養(yǎng)物中的獨特細(xì)胞譜系的譜系條形碼的干細(xì)胞衍生多色報告細(xì)胞系的方法以及使用所述干細(xì)胞衍生多色報告細(xì)胞系例如在活細(xì)胞中實時監(jiān)測途徑、表型、測定、化合物作用模式和模型疾病的方法。

背景技術(shù)：

1、確定對內(nèi)部或外部刺激的細(xì)胞特定反應(yīng)需要可視化和監(jiān)測細(xì)胞的類型、表型和途徑以及它們之間的動態(tài)相互作用。目前可視化此類反應(yīng)的方法效率低、成本高，并且對在細(xì)胞和分子水平上發(fā)生的多參數(shù)動態(tài)過程提供非常有限的見解。例如，傳統(tǒng)上使用體內(nèi)臨床前動物模型進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)和/或?qū)λ幬锖蜻x物的毒理學(xué)評價，所述體內(nèi)臨床前動物模型是低通量的、成本高、不能充分預(yù)測在人體內(nèi)的毒性，并且對化合物治療作用機制或化合物毒性易感性提供很少的見解。類似地，常規(guī)使用的基于細(xì)胞的測定(如蛋白質(zhì)印跡)提供了對使用活細(xì)胞中的時間譜分析(profiling)將更好地表征和理解的過程的端點讀出，并且在通量上也是極其有限的。這些傳統(tǒng)方法的通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及新化學(xué)品產(chǎn)生的速度，不管它們是出于藥學(xué)上的、農(nóng)業(yè)上的還是其他目的(如營養(yǎng)、化妝品、個人護(hù)理等)開發(fā)的化合物。對這些新化學(xué)品的功效或可能對人類健康構(gòu)成的風(fēng)險評價的需要要求開發(fā)新的篩選工具，所述新的篩選工具可以在與每周評價數(shù)十萬種化合物兼容的通量下對與此類化合物相關(guān)的機制提供有意義的見解。盡管基于細(xì)胞的方法(如免疫熒光顯微術(shù)和活力測定)已經(jīng)以高通量形式展示，但這些方法仍然局限于在死細(xì)胞系統(tǒng)中測定的端點讀出，這嚴(yán)重限制了它們的生理相關(guān)性并極大地限制了它們對譜分析疾病相關(guān)活細(xì)胞中復(fù)雜多參數(shù)過程的適用性。理想的是，新的篩選工具將能夠解決工具的嚴(yán)重不足以使得能夠可視化和定量基于細(xì)胞的生理學(xué)相關(guān)模型中特定細(xì)胞生理學(xué)的變化，如通過基于干細(xì)胞的測定和疾病模型實現(xiàn)的那些。這些需求可以通過適當(dāng)配置的干細(xì)胞活細(xì)胞方法來解決，這是本發(fā)明的重點。

2、概述的本發(fā)明提供了實施稱為譜系條形編碼的譜系特異性標(biāo)記方法以作為用于需要高通量技術(shù)的藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)篩選的模型穩(wěn)健地鑒別活干細(xì)胞培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物中的獨特細(xì)胞譜系從而建立用于化合物譜分析和藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的測定的手段。

3、多重測定披露于通過引用以其整體并入本文的pct/us2018//032834中。

4、本文引用的所有參考文獻(xiàn)(包括專利申請和出版物)均通過引用以其整體并入。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多順反子報告載體，其包含：與開放閱讀框可操作地連接的啟動子，其中所述啟動子是譜系特異性啟動子，其中所述開放閱讀框包含兩個或更多個順反子，并且其中所述開放閱讀框在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生來自每個順反子的分開的組分多肽產(chǎn)物；其中每個順反子包含多克隆位點(mcs)和編碼報告載體的核酸，其中每個順反子編碼不同的報告多肽；并且其中插入所述兩個或更多個多克隆位點中并與所述報告多肽融合的編碼多肽的兩種或更多種核酸的表達(dá)基本上為約1:1化學(xué)計量。

2、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多順反子報告載體，其包含：與反式激活因子多肽連接的第一啟動子，其中所述第一啟動子是譜系特異性啟動子；與開放閱讀框可操作地連接的第二啟動子，其中所述第二啟動子是可由所述反式激活因子多肽誘導(dǎo)的，其中所述開放閱讀框包含兩個或更多個順反子，并且其中所述開放閱讀框在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生來自每個順反子的分開的組分多肽產(chǎn)物；其中每個順反子包含多克隆位點(mcs)和編碼報告載體的核酸，其中每個順反子編碼不同的報告多肽；并且其中插入所述兩個或更多個多克隆位點中并與所述報告多肽融合的編碼多肽的兩種或更多種核酸的表達(dá)基本上為約1:1化學(xué)計量。在一些實施方案中，所述反式激活因子多肽是四環(huán)素反式激活因子多肽，并且所述第二啟動子包含四環(huán)素響應(yīng)型元件。在一些實施方案中，所述四環(huán)素響應(yīng)型元件是tet操縱子2(teto2)誘導(dǎo)型或阻遏元件。

3、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多順反子報告載體，其包含：與編碼細(xì)胞器特異性多肽的核酸連接的第一啟動子，其中所述第一啟動子是譜系特異性啟動子；與開放閱讀框可操作地連接的第二啟動子，其中所述第二啟動子是組成型啟動子，其中所述開放閱讀框包含兩個或更多個順反子，并且其中所述開放閱讀框在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生來自每個順反子的分開的組分多肽產(chǎn)物；其中每個順反子包含多克隆位點(mcs)和編碼報告載體的核酸，其中每個順反子編碼不同的報告多肽；并且其中插入所述兩個或更多個多克隆位點中并與所述報告多肽融合的編碼多肽的兩種或更多種核酸的表達(dá)基本上為約1:1化學(xué)計量。在一些實施方案中，所述細(xì)胞器特異性多肽是h2b。在一些實施方案中，所述組成型啟動子是巨細(xì)胞病毒a(cmv)、胸苷激酶(tk)、ef1-α、泛素c(ubc)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、cag啟動子、sv40啟動子或人β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述啟動子包含四環(huán)素響應(yīng)型元件。在一些實施方案中，所述四環(huán)素響應(yīng)型元件是tet操縱子2(teto2)誘導(dǎo)型或阻遏元件。

4、在以上方面和實施方案的一些實施方案中，所述第一啟動子和所述第二啟動子處于不同的取向。在一些實施方案中，所述第一啟動子和所述第二啟動子通過隔離子核酸分開。在一些實施方案中，所述順反子通過編碼一種或多種自切割肽和/或一個或多個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(ires)的核酸彼此分開。在一些實施方案中，所述一種或多種自切割肽是病毒自切割肽。在一些實施方案中，所述一種或多種病毒自切割肽是一種或多種2a肽。在一些實施方案中，一種或多種2a肽是t2a肽、p2a肽、e2a肽或f2a肽。

5、在一些實施方案中，所述報告多肽還包含一種或多種核酸，所述一種或多種核酸編碼在所述報告多肽中的一種或多種與所述自切割肽中的一種或多種之間的肽接頭。在一些實施方案中，所述肽接頭包含序列g(shù)ly-ser-gly。

6、在一些實施方案中，所述報告多肽是熒光報告多肽。在一些實施方案中，每個順反子的所述報告多肽選自gfp、egfp、emerald、citrine、venus、morange、mcherry、tagbfp、mturquoise、cerulean、unag、dsred、eqfp611、dronpa、rfp、tagrfp、tdtomato、kfp、eosfp、dendra、irisfp、irfp和smurfp。

7、在一些實施方案中，所述開放閱讀框包含第一順反子和第二順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸和編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼病毒切割肽的核酸分開。在一些實施方案中，所述開放閱讀框包含第一順反子、第二順反子和第三順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸和編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼第一病毒切割肽的核酸分開，并且所述第二順反子和所述第三順反子通過編碼第二病毒切割肽的核酸分開。在一些實施方案中，所述開放閱讀框包含第一順反子、第二順反子、第三順反子和第四順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸、編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼第一病毒切割肽的核酸分開，所述第二順反子和所述第三順反子通過編碼第二病毒切割肽的核酸分開，所述第三順反子和所述第四順反子通過編碼第三病毒切割肽的核酸分開。在一些實施方案中，所述載體包含與開放閱讀框可操作地連接的啟動子，其中所述開放閱讀框包含第一順反子、第二順反子、第三順反子和第四順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸、編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼第一病毒切割肽的核酸分開，所述第二順反子和所述第三順反子通過編碼第二病毒切割肽的核酸分開，所述第三順反子和所述第四順反子通過編碼ires的核酸分開。

8、在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子對心臟、血液、肌肉、肺、肝、腎、胰腺、腦或皮膚譜系的細(xì)胞具有特異性。在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子是亞譜系特異性啟動子。在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子是心臟特異性啟動子。在一些實施方案中，所述心臟特異性啟動子是mclv2v、sln、shox2、mybpc3、tnni3或α-mhc啟動子。在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子是神經(jīng)特異性啟動子。在一些實施方案中，所述神經(jīng)特異性啟動子是vgat、th、gfap或vglut1啟動子。

9、在一些實施方案中，所述載體還包含位于所述開放閱讀框的3'的位點特異性重組酶序列。在一些實施方案中，所述載體還包含編碼選擇性標(biāo)記的核酸，其中當(dāng)所述位點特異性重組酶序列尚未重組時，編碼所述選擇性標(biāo)記的核酸不與所述啟動子可操作地連接，并且當(dāng)所述位點特異性重組酶序列與其靶位點特異性重組酶序列重組時，編碼所述選擇性標(biāo)記的核酸與所述啟動子可操作地連接。在一些實施方案中，所述位點特異性重組酶序列是frt核酸序列和/或attp核酸和/或loxp核酸序列。在一些實施方案中，所述選擇性標(biāo)記賦予對潮霉素、zeocintm、嘌呤霉素、新霉素、或者潮霉素、zeocintm、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素或新霉素的類似物的抗性。在一些實施方案中，將編碼一種或多種多肽的核酸框內(nèi)插入所述一個或多個mcs中。在一些實施方案中，至少一個順反子包含編碼管家基因的核酸。在一些實施方案中，所述管家基因是h2b。在一些實施方案中，至少一個順反子包含編碼細(xì)胞器標(biāo)記的核酸。在一些實施方案中，所述細(xì)胞器標(biāo)記包含與所述報告多肽融合的h2b、α-輔肌動蛋白2或線粒體靶向信號。

10、在一些實施方案中，所述一種或多種多肽包含可用于譜分析或區(qū)分單一或多種生物途徑、兩種或更多種生物途徑之間的串?dāng)_、合成致死性、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)、其他細(xì)胞或亞細(xì)胞表型、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或毒性反應(yīng)的多肽。

11、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多報告干細(xì)胞，其中所述多報告干細(xì)胞包含多順反子報告構(gòu)建體，其中所述多順反子報告構(gòu)建體包含與開放閱讀框可操作地連接的啟動子，其中所述啟動子是譜系特異性啟動子，其中所述開放閱讀框包含兩個或更多個順反子，并且其中所述開放閱讀框在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生來自每個順反子的分開的組分多肽產(chǎn)物；其中每個順反子包含多克隆位點(mcs)和編碼報告載體的核酸，其中每個順反子編碼不同的報告多肽；其中插入所述兩個或更多個多克隆位點中并與所述報告多肽融合的編碼多肽的兩種或更多種核酸的表達(dá)基本上為約1:1化學(xué)計量；并且其中所述干細(xì)胞是多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干(ips)細(xì)胞。

12、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多報告干細(xì)胞，其中所述多報告干細(xì)胞包含多順反子報告構(gòu)建體，其中所述多順反子報告構(gòu)建體包含與反式激活因子多肽連接的第一啟動子，其中所述第一啟動子是譜系特異性啟動子；與開放閱讀框可操作地連接的第二啟動子，其中所述第二啟動子是可由所述反式激活因子多肽誘導(dǎo)的，其中所述開放閱讀框包含兩個或更多個順反子，并且其中所述開放閱讀框在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生來自每個順反子的分開的組分多肽產(chǎn)物；其中每個順反子包含多克隆位點(mcs)和編碼報告載體的核酸，其中每個順反子編碼不同的報告多肽；其中插入所述兩個或更多個多克隆位點中并與所述報告多肽融合的編碼多肽的兩種或更多種核酸的表達(dá)基本上為約1:1化學(xué)計量；并且其中所述干細(xì)胞是多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干(ips)細(xì)胞。在一些實施方案中，所述反式激活因子多肽是四環(huán)素反式激活因子多肽，并且所述第二啟動子包含四環(huán)素響應(yīng)型元件。在一些實施方案中，所述四環(huán)素響應(yīng)型元件是tet操縱子2(teto2)誘導(dǎo)型或阻遏元件。

13、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多報告干細(xì)胞，其中所述多報告干細(xì)胞包含多順反子報告構(gòu)建體，其中所述多順反子報告構(gòu)建體包含與編碼管家多肽的核酸連接的第一啟動子，其中所述第一啟動子是譜系特異性啟動子；與開放閱讀框可操作地連接的第二啟動子，其中所述第二啟動子是組成型啟動子，其中所述開放閱讀框包含兩個或更多個順反子，并且其中所述開放閱讀框在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生來自每個順反子的分開的組分多肽產(chǎn)物；其中每個順反子包含多克隆位點(mcs)和編碼報告載體的核酸，其中每個順反子編碼不同的報告多肽；其中插入所述兩個或更多個多克隆位點中并與所述報告多肽融合的編碼多肽的兩種或更多種核酸的表達(dá)基本上為約1:1化學(xué)計量；并且其中所述干細(xì)胞是多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干(ips)細(xì)胞。在一些實施方案中，所述管家多肽是h2b。

14、在一些實施方案中，所述組成型啟動子是巨細(xì)胞病毒a(cmv)、胸苷激酶(tk)、ef1-α、泛素c(ubc)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、cag啟動子、sv40啟動子或人β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述第一啟動子和所述第二啟動子處于不同的取向。在一些實施方案中，所述第一啟動子和所述第二啟動子通過隔離子核酸分開。

15、在一些實施方案中，所述啟動子包含四環(huán)素響應(yīng)型元件。在一些實施方案中，所述四環(huán)素響應(yīng)型元件是tet操縱子2(teto2)誘導(dǎo)型或阻遏元件。

16、在一些實施方案中，所述順反子通過編碼一種或多種自切割肽和/或一個或多個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(ires)的核酸彼此分開。在一些實施方案中，所述一種或多種自切割肽是病毒自切割肽。在一些實施方案中，所述一種或多種病毒自切割肽是一種或多種2a肽。在一些實施方案中，所述一種或多種2a肽是t2a肽、p2a肽、e2a肽或f2a肽。在一些實施方案中，所述報告多肽還包含一種或多種核酸，所述一種或多種核酸編碼在所述報告多肽中的一種或多種與所述自切割肽中的一種或多種之間的肽接頭。在一些實施方案中，所述肽接頭包含序列g(shù)ly-ser-gly。

17、在一些實施方案中，所述報告多肽是熒光報告多肽。在一些實施方案中，每個順反子的所述報告多肽選自gfp、egfp、emerald、citrine、venus、morange、mcherry、tagbfp、mturquoise、cerulean、unag、dsred、eqfp611、dronpa、rfp、tagrfp、tdtomato、kfp、eosfp、dendra、irisfp、irfp和smurfp。

18、在一些實施方案中，所述開放閱讀框包含第一順反子和第二順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸和編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼病毒切割肽的核酸分開。在一些實施方案中，所述開放閱讀框包含第一順反子、第二順反子和第三順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸和編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼第一病毒切割肽的核酸分開，并且所述第二順反子和所述第三順反子通過編碼第二病毒切割肽的核酸分開。在一些實施方案中，所述開放閱讀框包含第一順反子、第二順反子、第三順反子和第四順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸、編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼第一病毒切割肽的核酸分開，所述第二順反子和所述第三順反子通過編碼第二病毒切割肽的核酸分開，所述第三順反子和所述第四順反子通過編碼第三病毒切割肽的核酸分開。在一些實施方案中，所述載體包含與開放閱讀框可操作地連接的啟動子，其中所述開放閱讀框包含第一順反子、第二順反子、第三順反子和第四順反子，其中每個順反子從5'至3'包含含有mcs的核酸、編碼報告多肽的核酸、編碼接頭肽的核酸；其中所述第一順反子和所述第二順反子通過編碼第一病毒切割肽的核酸分開，所述第二順反子和所述第三順反子通過編碼第二病毒切割肽的核酸分開，所述第三順反子和所述第四順反子通過編碼ires的核酸分開。

19、在一些實施方案中，其中所述譜系特異性啟動子對心臟、血液、肌肉、肺、肝、腎、胰腺、腦或皮膚譜系的細(xì)胞具有特異性。在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子是亞譜系特異性啟動子。在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子是心臟特異性啟動子。在一些實施方案中，所述心臟特異性啟動子是mclv2v、sln、shox2、mybpc3、tnni3或α-mhc啟動子。在一些實施方案中，所述譜系特異性啟動子是神經(jīng)特異性啟動子。在一些實施方案中，所述神經(jīng)特異性啟動子是vgat、th、gfap或vglut1啟動子。

20、在一些實施方案中，將編碼一種或多種多肽的核酸框內(nèi)插入所述一個或多個mcs中。在一些實施方案中，至少一個順反子包含編碼細(xì)胞器特異性多肽的核酸。在一些實施方案中，所述細(xì)胞器特異性多肽是h2b。在一些實施方案中，至少一個順反子包含編碼細(xì)胞器標(biāo)記的核酸。在一些實施方案中，所述細(xì)胞器標(biāo)記包含與所述報告多肽融合的h2b、α-輔肌動蛋白2或線粒體靶向信號。

21、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了如本文所述的多報告干細(xì)胞，其中所述一種或多種多肽包含可用于在所述干細(xì)胞分化之后譜分析或區(qū)分單一或多種生物途徑、兩種或更多種生物途徑之間的串?dāng)_、合成致死性、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、毒性反應(yīng)或其他細(xì)胞或亞細(xì)胞表型的多肽。在一些實施方案中，其中所述譜分析是在單一細(xì)胞上進(jìn)行的。在一些實施方案中，其中所述報告多肽可以通過顯微術(shù)、高通量顯微術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選(facs)、發(fā)光或使用讀板儀來可視化。在一些實施方案中，在所述干細(xì)胞分化之前、期間或之后分析所述報告多肽。

22、在一些實施方案中，將所述多順反子報告構(gòu)建體整合在所述多報告干細(xì)胞基因組中的第一特定位點處。在一些實施方案中，本發(fā)明的多報告干細(xì)胞還包含整合在所述多報告干細(xì)胞基因組中的第二特定位點處的核酸。在一些實施方案中，整合在所述多報告干細(xì)胞基因組中的第二特定位點處的核酸編碼多肽、報告多肽、細(xì)胞毒性多肽、選擇性多肽、組成型cas9表達(dá)載體或誘導(dǎo)型cas9表達(dá)載體。

23、在一些方面，本發(fā)明提供了一種多報告載體文庫，其中所述文庫包含如本文所述的兩種或更多種多順反子報告載體，其中所述兩種或更多種多順反子報告載體包含與報告多肽融合的不同轉(zhuǎn)基因，其中當(dāng)引入細(xì)胞時，每種載體上的所述不同轉(zhuǎn)基因中的兩個或更多個以基本上1:1化學(xué)計量表達(dá)。在一些方面，本發(fā)明提供了一種多報告載體文庫，其中所述文庫包含如本文所述的兩種或更多種多順反子報告載體，其中所述兩種或更多種多順反子報告載體包含與融合至不同報告多肽的轉(zhuǎn)基因可操作地連接的不同譜系特異性啟動子，使得所述報告多肽的表達(dá)可以基于所述譜系特異性啟動子來區(qū)分細(xì)胞類型。在一些實施方案中，將相同的轉(zhuǎn)基因與所述不同的譜系特異性啟動子和所述不同的報告多肽可操作地連接。在一些實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因編碼管家多肽和/或細(xì)胞器特異性多肽。在一些實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因編碼h2b、α-輔肌動蛋白2或線粒體靶向信號。

24、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了如本文所述的多報告載體文庫，其中所述報告載體編碼一個或多個轉(zhuǎn)基因，所述一個或多個轉(zhuǎn)基因可以用于在所述細(xì)胞分化之后譜分析或區(qū)分單一或多種生物途徑、兩種或更多種生物途徑之間的串?dāng)_、合成致死性、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、毒性反應(yīng)或其他細(xì)胞或亞細(xì)胞表型。

25、在一些實施方案中，所述生物途徑或表型是與疾病相關(guān)的途徑或表型。在一些實施方案中，所述疾病是癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性或神經(jīng)系統(tǒng)疾病或自身免疫性疾病。在一些實施方案中，所述生物途徑或表型是與所述細(xì)胞內(nèi)的毒性反應(yīng)機制相關(guān)的途徑或表型。在一些實施方案中，所述生物途徑或表型是與衰老相關(guān)的途徑或表型。在一些實施方案中，所述生物途徑是與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡、自噬、dna損傷和修復(fù)、氧化應(yīng)激、染色質(zhì)/表觀遺傳學(xué)、mapk信號傳導(dǎo)、pi3k/akt信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、翻譯控制、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期和檢查點控制、細(xì)胞代謝、發(fā)育和分化信號傳導(dǎo)、免疫學(xué)和炎癥信號傳導(dǎo)、酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)、膜泡運輸、細(xì)胞骨架調(diào)控、泛素途徑相關(guān)的途徑。

26、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種多報告細(xì)胞文庫，其中所述文庫中的每種細(xì)胞包含如本文所述的多順反子報告載體，其中所述文庫中的細(xì)胞包含不同的多順反子報告載體。在一些實施方案中，每種多順反子報告載體包含與共同報告多肽融合、與共同譜系特異性啟動子可操作地連接的共同轉(zhuǎn)基因。在一些實施方案中，每種多順反子報告載體包含與不同報告多肽融合并與不同譜系特異性啟動子可操作地連接的共同轉(zhuǎn)基因。

27、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含如本文所述的兩種或更多種多報告細(xì)胞的多報告細(xì)胞文庫，其中所述文庫中的兩種或更多種多報告細(xì)胞包含不同的多順反子報告載體。

28、在一些實施方案中，所述文庫包含多能細(xì)胞、多潛能細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。在一些實施方案中，所述文庫包含不同的多能細(xì)胞、多潛能細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。在一些實施方案中，所述多能細(xì)胞或所述多潛能細(xì)胞包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、多潛能細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮祖受體細(xì)胞、間充質(zhì)祖細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、骨軟骨祖細(xì)胞、淋巴樣祖細(xì)胞或胰腺祖細(xì)胞中的一種或多種。在一些實施方案中，在引入所述多順反子報告載體之后，使所述多能細(xì)胞多報告細(xì)胞或所述多潛能細(xì)胞多報告細(xì)胞分化。在一些實施方案中，將不同的多順反子報告載體引入等基因受體細(xì)胞。

29、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了如本文所述的多報告細(xì)胞文庫，其中在引入所述多順反子報告載體之后，使所述多能細(xì)胞或所述多潛能細(xì)胞分化。在一些實施方案中，將不同的多順反子報告載體引入等基因多能或多潛能受體細(xì)胞。在一些實施方案中，所述多順反子報告載體編碼一個或多個轉(zhuǎn)基因，所述一個或多個轉(zhuǎn)基因可以用于譜分析或區(qū)分單一或多種生物途徑、兩種或更多種生物途徑之間的串?dāng)_、合成致死性、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、毒性反應(yīng)或其他細(xì)胞或亞細(xì)胞表型，并且其中與所述譜系特異性啟動子可操作地連接的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)用于鑒定細(xì)胞類型或分化階段。在一些實施方案中，所述生物途徑或表型是與疾病相關(guān)的途徑或表型。在一些實施方案中，所述疾病是癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性或神經(jīng)系統(tǒng)疾病或自身免疫性疾病。在一些實施方案中，所述生物途徑或表型是與所述細(xì)胞內(nèi)的毒性反應(yīng)機制相關(guān)的途徑或表型。.在一些實施方案中，所述生物途徑或表型是與衰老相關(guān)的途徑或表型。在一些實施方案中，所述生物途徑是與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡、自噬、dna損傷和修復(fù)、氧化應(yīng)激、染色質(zhì)/表觀遺傳學(xué)、mapk信號傳導(dǎo)、pi3k/akt信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、翻譯控制、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期和檢查點控制、細(xì)胞代謝、發(fā)育和分化信號傳導(dǎo)、免疫學(xué)和炎癥信號傳導(dǎo)、酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)、膜泡運輸、細(xì)胞骨架調(diào)控或泛素途徑相關(guān)的途徑。

30、在一些實施方案中，本發(fā)明的文庫包含兩種或更多種不同譜系的細(xì)胞。在一些實施方案中，所述不同譜系的細(xì)胞包含譜系特異性報告多肽。

31、在一些方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含一種或多種如本文所述的多順反子報告載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含一種或多種如本文所述的多報告干細(xì)胞。在一些實施方案中，所述試劑盒包含排列在多孔板中的多順反子報告干細(xì)胞的文庫。在一些實施方案中，將所述多孔板中的干細(xì)胞低溫保存。

32、在一些方面，本發(fā)明提供了一種譜分析活細(xì)胞中的兩種或更多種多肽的方法，所述方法包括確定如本文所述的多報告干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因中的兩個或更多個的表達(dá)和/或位置。在一些實施方案中，在所述干細(xì)胞分化之前、期間或之后進(jìn)行譜分析。在一些實施方案中，所述方法用于譜分析或區(qū)分單一或多種生物途徑、兩種或更多種生物途徑之間的串?dāng)_、合成致死性、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、毒性反應(yīng)或其他細(xì)胞或亞細(xì)胞表型。

33、在一些實施方案中，在一個或多個時間點確定所述轉(zhuǎn)基因中的兩個或更多個的表達(dá)和/或位置。在一些實施方案中，在1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、24小時、2天、4天、7天、14天、21天、30天、1個月、3個月、6個月、9個月、1年或超過1年中的一個或多個時間點確定所述轉(zhuǎn)基因中的兩個或更多個的表達(dá)和/或位置。

34、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種測量藥劑對活細(xì)胞中兩種或更多種多肽的譜的影響的方法，所述方法包括使如本文所述的多報告干細(xì)胞經(jīng)受所述藥劑，以及確定所述兩個或更多個轉(zhuǎn)基因響應(yīng)于所述藥劑在所述細(xì)胞中的表達(dá)和/或位置。在一些實施方案中，在所述干細(xì)胞分化之前、期間或之后進(jìn)行譜分析。在一些實施方案中，所述藥劑是藥物或藥物候選物。在一些實施方案中，所述藥劑是癌癥藥物或癌癥藥物劑。在一些實施方案中，所述方法是毒理學(xué)篩選。在一些實施方案中，確定所述兩個或更多個轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或位置是在多報告細(xì)胞文庫中進(jìn)行的。在一些實施方案中，通過在所述譜系特異性報告物的控制下所述報告多肽的表達(dá)來確定所述文庫中細(xì)胞的譜系。在一些實施方案中，使用單一細(xì)胞獲得所述譜。在一些實施方案中，通過在所述譜系特異性報告物的控制下所述報告多肽的表達(dá)來確定所述單一細(xì)胞的譜系。

35、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種測量藥劑對一池不同譜系的活細(xì)胞中兩種或更多種多肽的譜的影響的方法，所述方法包括使一池如本文所述的多報告干細(xì)胞經(jīng)受所述藥劑，以及確定所述兩個或更多個轉(zhuǎn)基因響應(yīng)于所述藥劑在所述細(xì)胞中的表達(dá)和/或位置。在一些實施方案中，在所述干細(xì)胞分化之前、期間或之后進(jìn)行譜分析。在一些實施方案中，所述藥劑是藥物或藥物候選物。在一些實施方案中，所述藥劑是癌癥藥物或癌癥藥物劑。在一些實施方案中，所述方法是毒理學(xué)篩選。在一些實施方案中，確定所述兩個或更多個轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或位置是在多報告細(xì)胞文庫中進(jìn)行的。在一些實施方案中，通過在所述譜系特異性報告物的控制下所述報告多肽的表達(dá)來確定所述文庫中細(xì)胞的譜系。在一些實施方案中，使用單一細(xì)胞獲得所述譜。在一些實施方案中，通過在所述譜系特異性報告物的控制下所述報告多肽的表達(dá)來確定細(xì)胞的譜系。

36、在一些實施方案中，通過顯微術(shù)、高通量顯微術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選(facs)、發(fā)光、使用讀板儀、質(zhì)譜或深度測序來測量所述兩個或更多個轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或位置。

37、在一些方面，本發(fā)明提供了一種用于接受多順反子報告載體的受體細(xì)胞，其中所述受體細(xì)胞包含整合到宿主細(xì)胞基因組中的特定位點的重組核酸，其中所述重組核酸包含與編碼融合多肽的核酸可操作地連接的第一啟動子，其中所述融合多肽包含報告結(jié)構(gòu)域和選擇性標(biāo)記結(jié)構(gòu)域，并且其中所述核酸包含位于編碼所述融合多肽的核酸的5'端處的兩個位點特異性重組酶核酸序列。在一些實施方案中，所述核酸包含位于所述兩個特異性重組酶核酸序列的5'的兩個atg序列。在一些實施方案中，所述啟動子是組成型啟動子。在一些實施方案中，所述組成型啟動子是cmv啟動子、tk啟動子、ef1-α啟動子、ubc啟動子、pgk啟動子、cag啟動子、sv40啟動子或人β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述位點特異性重組酶序列是frt核酸序列和/或attp核酸序列和/或loxp核酸序列。在一些實施方案中，所述位點特異性重組酶序列包含phic31?attp核酸序列和bxb1?attp核酸序列。在一些實施方案中，所述融合多肽的報告結(jié)構(gòu)域是熒光報告結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述熒光報告結(jié)構(gòu)域選自gfp、egfp、emerald、citrine、venus、morange、mcherry、tagbfp、mturquoise、cerulean、unag、dsred、eqfp611、dronpa、rfp、tagrfp、tdtomato、kfp、eosfp、dendra、irisfp、irfp和smurfp。在一些實施方案中，所述融合多肽的報告結(jié)構(gòu)域是mcherry報告結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述融合多肽的選擇性標(biāo)記結(jié)構(gòu)域賦予對潮霉素、zeocintm、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、新霉素、或者潮霉素、zeocintm、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、新霉素的類似物的抗性。在一些實施方案中，所述啟動子是人β-肌動蛋白啟動子或cag啟動子。在一些實施方案中，將所述重組核酸整合在腺相關(guān)病毒s1(aavs1)基因座、趨化因子(cc基序)受體5(ccr5)基因座、小鼠rosa26基因座的人直向同源物、hip11(h11)基因座或檸檬酸裂解酶β樣基因座(clybl)中。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是多能細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或多潛能細(xì)胞。在一些實施方案中，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是wtc-11細(xì)胞或ncrm5細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是原代細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是永生化細(xì)胞。在一些實施方案中，所述永生化細(xì)胞是hek293t細(xì)胞、a549細(xì)胞、u2os細(xì)胞、rpe細(xì)胞、npc1細(xì)胞、mcf7細(xì)胞、hepg2細(xì)胞、hacat細(xì)胞、tk6細(xì)胞、a375細(xì)胞或hela細(xì)胞。

38、在本發(fā)明的一些實施方案中，所述受體細(xì)胞包含用于接受第一多順反子報告載體的第一重組核酸和用于接受第二表達(dá)構(gòu)建體的第二重組核酸，其中將所述第一重組核酸整合到宿主細(xì)胞基因組中的第一特定位點中，并且將所述第二重組核酸整合到宿主細(xì)胞基因組中的第二特定位點中。在一些實施方案中，所述第二重組核酸編碼多肽、報告多肽、細(xì)胞毒性多肽、選擇性多肽、組成型cas表達(dá)載體、誘導(dǎo)型cas表達(dá)載體、組成型cas9表達(dá)載體或誘導(dǎo)型cas9表達(dá)載體。在一些實施方案中，由所述受體細(xì)胞制備報告細(xì)胞，其中將多順反子報告載體整合到所述第一特定位點中，并且將組成型或誘導(dǎo)型cas表達(dá)載體(例如，cas9表達(dá)載體)整合到第二特定位點中。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中將如本文所述的報告細(xì)胞排列在多孔板中，并且用作使用單一或寡核苷酸合并sgrna的篩選的基礎(chǔ)。

39、在一些方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生用以接受多順反子報告載體的受體細(xì)胞的方法，所述方法包括將重組核酸引入細(xì)胞，其中所述重組核酸從5'至3'包含用于將同源重組靶向至所述細(xì)胞中的特定位點的第一核酸、第一啟動子、兩個atg序列、兩種位點特異性重組酶核酸、編碼第一報告多肽和選擇性標(biāo)記的核酸、用于將同源重組靶向至所述細(xì)胞中的特定位點的第二核酸、第二啟動子和編碼第二報告多肽或細(xì)胞毒性多肽的核酸，其中表達(dá)所述第一報告多肽而不表達(dá)所述第二報告多肽或細(xì)胞毒性多肽指示將所述重組核酸靶向整合至細(xì)胞基因組中的所述特定位點，并且表達(dá)所述第一報告多肽和所述第二報告多肽或細(xì)胞毒性多肽指示隨機整合在細(xì)胞基因組中。在一些實施方案中，使用以下將所述重組核酸整合到所述細(xì)胞的基因組中：a)包含核酸酶和指導(dǎo)rna的rna指導(dǎo)的重組系統(tǒng)，b)talen核酸內(nèi)切酶，或c)zfn核酸內(nèi)切酶。在一些實施方案中，選擇表達(dá)所述第一報告多肽但不表達(dá)所述第二報告多肽或細(xì)胞毒性多肽的細(xì)胞。在一些實施方案中，所述位點特異性重組酶核酸包含frt核酸序列和/或attp核酸序列和/或loxp核酸序列。在一些實施方案中，所述第一報告多肽是熒光多肽，并且所述第二報告多肽是不同的熒光多肽。在一些實施方案中，所述第一報告多肽和所述第二報告多肽選自gfp、egfp、emerald、citrine、venus、morange、mcherry、tagbfp、mturquoise、cerulean、unag、dsred、eqfp611、dronpa、rfp、tagrfp、tdtomato、kfp、eosfp、dendra、irisfp、irfp和smurfp。在一些實施方案中，所述第一報告多肽是mcherry報告物，并且所述第二報告多肽是gfp。在一些實施方案中，所述第一報告多肽是熒光多肽，并且所述第二報告多肽是細(xì)胞毒性多肽。在一些實施方案中，所述第一選自gfp、egfp、emerald、citrine、venus、morange、mcherry、tagbfp、mturquoise、cerulean、unag、dsred、eqfp611、dronpa、rfp、tagrfp、tdtomato、kfp、eosfp、dendra、irisfp、irfp和smurfp，并且所述細(xì)胞毒性多肽選自胸苷激酶(tk，例如hsv?tk)或白喉毒素a(dta)。在一些實施方案中，所述第一報告多肽是mcherry報告物，并且所述細(xì)胞毒性多肽是hsv?tk或dta。在一些實施方案中，所述選擇性標(biāo)記賦予對潮霉素、zeocintm、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、新霉素、或者潮霉素、zeocintm、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、新霉素的類似物的抗性。在一些實施方案中，所述第一啟動子是cmv啟動子、tk啟動子、ef1-α啟動子、ubc啟動子、pgk啟動子、cag啟動子、sv40啟動子或人β-肌動蛋白啟動子，并且所述第二啟動子是cmv啟動子、tk啟動子、ef1-α啟動子、ubc啟動子、pgk啟動子、cag啟動子、sv40啟動子或人β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，用于靶向同源重組的所述第一核酸和用于靶向同源重組的所述第二核酸將重組靶向至aavs1基因座、ccr5基因座、小鼠rosa26基因座的人直向同源物、h11基因座或clybl基因座。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是永生化細(xì)胞。在一些實施方案中，所述永生化細(xì)胞是hek293t細(xì)胞、a549細(xì)胞、u2os細(xì)胞、rpe細(xì)胞、npc1細(xì)胞、mcf7細(xì)胞、hepg2細(xì)胞、hacat細(xì)胞、tk6細(xì)胞、a375細(xì)胞或hela細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是多能細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或多潛能細(xì)胞。在一些實施方案中，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是wtc-11細(xì)胞或ncrm5細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞是原代細(xì)胞。

40、在一些實施方案中，制備受體細(xì)胞的所述方法還包括將第二重組核酸引入用于接受第二多順反子報告載體的細(xì)胞，其中所述第二重組核酸從5'至3'包含用于將同源重組靶向至所述細(xì)胞中的特定位點的第三核酸、第三啟動子、兩個atg序列、兩種位點特異性重組酶核酸、編碼第三報告多肽和選擇性標(biāo)記的核酸、用于將同源重組靶向至所述細(xì)胞中的特定位點的第四核酸、第四啟動子和編碼第四報告多肽或細(xì)胞毒性(例如，殺傷)多肽的核酸，其中表達(dá)所述第三報告多肽而不表達(dá)所述第四報告多肽或細(xì)胞毒性多肽指示將所述重組核酸靶向整合至細(xì)胞基因組中的所述特定位點，并且表達(dá)所述第三報告多肽和所述第四報告或細(xì)胞毒性多肽指示隨機整合在細(xì)胞基因組中。