本發(fā)明屬于基因工程，尤其是涉及一種抗人her2/ccr4的雙特異性抗體及其應用。

背景技術：

1、her2是一種180kda的跨膜糖蛋白，過表達于多種腫瘤細胞表面，包括20％-30％的乳腺癌，20％左右的胃和12-15％的膽囊。her2基因的擴增或her2蛋白的過表達在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉移中具有重要作用，因此her2被認為是抗腫瘤治療的重要靶點。1998年，美國食品藥物監(jiān)督管理局(food?and?drug?administration，fda)批準了重組人源化抗her2單克隆抗體trastuzumab(商品名herceptin)用于治療her2陽性晚期乳腺。herceptin顯著延長了her2陽性晚期腫瘤患者的生存期，被視為腫瘤治療史上的一個里程碑。但是，隨著herceptin的廣泛使用，大約70％的患者對herceptin具有耐藥性，包括原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥。

2、ccr4是treg的表面標志。在小鼠和人類中，與傳統(tǒng)t細胞相比，treg細胞優(yōu)先表達ccr4。ccr4是2種趨化因子ccl17和ccl22的受體，ccl22和ccl17均由腫瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生。ccr4與趨化因子之間的相互作用導致treg細胞募集到腫瘤微環(huán)境中，進而促進腫瘤的局部生長，增強腫瘤在外周血或淋巴器官的轉移，與不良預后相關。阻斷ccr4可減少瘤間treg細胞的數(shù)量，提高抗腫瘤免疫。靶向ccr4有望成為惡性腫瘤免疫治療的新策略。鑒于大多數(shù)treg靶向制劑不能區(qū)分腫瘤相關的treg細胞和外周血中的treg細胞，靶向腫瘤浸潤的treg細胞而保留系統(tǒng)性treg細胞是目前有效的腫瘤免疫治療的主要障礙，尋找新的有前景的靶向treg細胞的工具，可以作為未來針對免疫抑制治療的主要研究領域。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種抗人her2/ccr4的雙特異性抗體及其應用。

2、本發(fā)明采用的技術方案是：一種抗人her2/ccr4的雙特異性抗體，包含結合her2的第一抗原結合片段、結合ccr4的第二抗原結合片段和fc結構域。

3、優(yōu)選地，第一抗原結合區(qū)包括抗trastuzumab單克隆抗體的fab段，第二抗原結合區(qū)包括抗moglizumab單克隆抗體的fab段，fc結構域為trastuzumab單克隆抗體的fc結構域。

4、優(yōu)選地，第一抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)通過連接肽連接第二抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)，第一抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)通過連接肽連接第二抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)。

5、優(yōu)選地，第一抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.1所示，第二抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.2所示，第一抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.5所示，第二抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.6所示；連接肽氨基酸序列如seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.7或seq?id?no.8所示；fc結構域氨基酸序列如seq?id?no.9所示。

6、優(yōu)選地，第二抗原結合片段的fab區(qū)的c端與第一抗原結合片段的fc區(qū)的n端相連，抗體第一抗原結合片段的fab區(qū)的c端與所述雙特異性抗體第二抗原結合片段的fab區(qū)的n端相連。

7、一種能夠表達抗人her2/ccr4的雙特異性抗體的工程菌，構建能夠表達第一抗原結合片段重鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合片段重鏈可變區(qū)的質粒，構建能夠表達第一抗原結合片段輕鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合輕鏈可變區(qū)的質粒，轉染到表達載體菌株中，得到表達雙特異性抗體的工程菌。

8、優(yōu)選地，表達第一抗原結合片段重鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合片段重鏈可變區(qū)的質粒為h1-pab20-hchigg1質?；騢2-pab20-hchigg1質粒，序列分別如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示；

9、表達第一抗原結合片段輕鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合輕鏈可變區(qū)的質粒為l1-pab20-hck質?；騦2-pab20-hck質粒，序列分別如seq?id?no.21和seq?id?no.22所示。

10、優(yōu)選地，將表達重鏈可變區(qū)的質量與表達輕鏈可變區(qū)的質粒按照1:3的比例混合并轉染到293f細胞中。

11、抗人her2/ccr4的雙特異性抗體的制備方法，培養(yǎng)工程菌，置于co2震蕩培養(yǎng)箱中170rmp/min，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)過程通入5％?co2，收集工程菌表達得到的蛋白，分離純化得到抗人her2/ccr4的雙特異性抗體。

12、抗人her2/ccr4的雙特異性抗體在制備藥物中的應用。

13、優(yōu)選地，用于制備抗腫瘤藥物；或者用于制備治療或預防免疫性疾病藥物，免疫性疾病為移植物抗宿主病。

14、本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：提供一種抗人her2/ccr4的雙特異性抗體，能高特異性、高親和力結合her2，高特異性、相對低親和力結合ccr4，促進效應細胞殺傷腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的treg細胞，有效避免ccr4單克隆抗體引起的外周血treg細胞的耗竭，具有良好的抗癌活性以及更高的安全性。

技術特征：

1.一種抗人her2/ccr4的雙特異性抗體，其特征在于：包含結合her2的第一抗原結合片段、結合ccr4的第二抗原結合片段和fc結構域。

2.根據(jù)權利要求1所述的抗人her2/ccr4的雙特異性抗體，其特征在于：第一抗原結合區(qū)包括trastuzumab單克隆抗體的fab段，第二抗原結合區(qū)包括moglizumab單克隆抗體的fab段，fc結構域為trastuzumab單克隆抗體的fc結構域。

3.根據(jù)權利要求2所述的抗人her2/ccr4的雙特異性抗體，其特征在于：第一抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)通過連接肽連接第二抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)，第一抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)通過連接肽連接第二抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)。

4.根據(jù)權利要求3所述的抗人her2/ccr4的雙特異性抗體，其特征在于：第一抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.1所示，第二抗原結合區(qū)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.2所示，第一抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.5所示，第二抗原結合區(qū)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.6所示；連接肽氨基酸序列如seq?id?no.3、seqid?no.4、seq?id?no.7或seq?id?no.8所示；fc結構域氨基酸序列如seq?id?no.9所示。

5.一種能夠表達權利要求1-4中任一所述抗人her2/ccr4的雙特異性抗體的工程菌，其特征在于：構建能夠表達第一抗原結合片段重鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合片段重鏈可變區(qū)的質粒，構建能夠表達第一抗原結合片段輕鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合輕鏈可變區(qū)的質粒，轉染到表達載體菌株中，得到表達雙特異性抗體的工程菌。

6.根據(jù)權利要求5所述的工程菌，其特征在于：表達第一抗原結合片段重鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合片段重鏈可變區(qū)的質粒為h1-pab20-hchigg1質?；騢2-pab20-hchigg1質粒，序列分別如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示；表達第一抗原結合片段輕鏈可變區(qū)-連接肽-第二抗原結合輕鏈可變區(qū)的質粒為l1-pab20-hck質粒或l2-pab20-hck質粒，序列分別如seq?id?no.21和seq?id?no.22所示。

7.根據(jù)權利要求6所述的工程菌，其特征在于：將表達重鏈可變區(qū)的質量與表達輕鏈可變區(qū)的質粒按照1:3的比例混合并轉染到293f細胞中。

8.抗人her2/ccr4的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于：培養(yǎng)權利要求5-7中任一所述的工程菌，置于co2震蕩培養(yǎng)箱中170rmp/min，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)過程通入5％co2，收集工程菌表達得到的蛋白，分離純化得到抗人her2/ccr4的雙特異性抗體。

9.權利要求1-4中任一所述的抗人her2/ccr4的雙特異性抗體在制備藥物中的應用。

10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于：用于制備抗腫瘤藥物；或者用于制備治療或預防免疫性疾病藥物，免疫性疾病為移植物抗宿主病。

技術總結
本發(fā)明涉及一種抗人HER2/CCR4的雙特異性抗體及其應用，提供一種雙特異性抗體，能夠同時靶向HER2靶點和CCR4靶點，雙特異性抗體包括第一抗原結合區(qū)、第二抗原結合區(qū)和Fc結構域，其中，第一抗原結合區(qū)具有HER2結合活性，第二抗原結合區(qū)具有CCR4結合活性，F(xiàn)c結構域為Trastuzumab單克隆抗體的Fc結構域。雙特異性抗體能高特異性、高親和力結合HER2，高特異性、相對低親和力結合CCR4；促進效應細胞殺傷腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中的Treg細胞，有效避免CCR4單克隆抗體引起的外周血Treg細胞的耗竭，具有良好的抗癌活性以及更高的安全性。

技術研發(fā)人員：郗日沫,王超坤
受保護的技術使用者：南開大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/4/7