本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種293t-cymr-1-2-f6細胞株及其構(gòu)建方法和應用。
背景技術：
1、隨著基因調(diào)控技術的不斷發(fā)展，研究者們一直在尋找高效、精確且可調(diào)控的基因表達系統(tǒng)。cumate基因調(diào)控系統(tǒng)正是在這一背景下應運而生的一種新型基因調(diào)控工具，它為哺乳動物細胞中的基因表達提供了更為靈活和精細的控制手段。
2、cumate基因調(diào)控系統(tǒng)的核心在于其獨特的調(diào)控機制。該系統(tǒng)利用了一種名為cymr的蛋白作為調(diào)控元件，該蛋白能夠結(jié)合到特定的dna序列(cuo)上，從而抑制下游基因的表達。然而，當加入cumate這種小分子時，cymr與cuo的結(jié)合能力會被解除，進而允許下游基因的表達。這種開關式的調(diào)控方式使得研究者們能夠通過簡單地添加或去除cumate來控制基因的表達狀態(tài)。
3、cumate基因調(diào)控系統(tǒng)在疫苗研發(fā)、基因工程藥物生產(chǎn)等領域具有巨大的應用潛力。通過構(gòu)建基于cumate基因開關系統(tǒng)的疫苗表達載體，研究者們可以實現(xiàn)對疫苗抗原的精確控制，從而提高疫苗的安全性和有效性。在基因工程藥物生產(chǎn)方面，該系統(tǒng)則可以實現(xiàn)藥物的高效、可控表達，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。隨著該技術的不斷發(fā)展和完善，相信它將在未來的生物醫(yī)學研究中發(fā)揮越來越重要的作用。
技術實現(xiàn)思路
1、鑒于此，本發(fā)明提供了一種293t-cymr-1-2-f6細胞株及其構(gòu)建方法和應用，293t-cymr-2-1-f6的單克隆細胞株能夠顯著抑制插入cuo序列后的cmv啟動子的表達效率。
2、為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
3、第一方面，本發(fā)明提供了一種293t-cymr-1-2-f6細胞株，該細胞株能夠表達cumate基因開關中的cymr基因。
4、第二方面，本發(fā)明提供了一種所述的293t-cymr-1-2-f6細胞株的制備方法，包括以下步驟：
5、s10、將cumate系統(tǒng)中的cymr蛋白基因序列構(gòu)建到crispr-cas9?工具質(zhì)粒py93中，得到py93-cymr，并制備線性化片段py93-cymr-arm；
6、s20、尋找人類基因組安全港ccr5中合適的外源基因插入位點，設計grna序列，構(gòu)建crispr-cas9工具質(zhì)粒px330-ccr5-3；
7、s30、將py93-cymr-arm和px330-ccr5-3共轉(zhuǎn)染hek293t細胞，并通過含puro的dmem培養(yǎng)基篩選，獲得293t-cymr-1-2-f6細胞株。
8、優(yōu)選地，在步驟s10中，px330-ccr5-3在制備的過程中，選用的grna序列為cttgtgacacggactcaagt，經(jīng)u6啟動子轉(zhuǎn)錄，cas9蛋白酶經(jīng)cmv啟動子表達。
9、優(yōu)選地，在步驟s20中，py93-cymr-arm轉(zhuǎn)染方法步驟為：以py93-cymr為模板，從py93-cymr的ccr5同源區(qū)域設計pcr引物，pcr獲得py93-cymr-arm。
10、優(yōu)選地，pcr引物包括py86(egfp)-cymr-f和py86(egfp)-cymr-r，py86(egfp)-cymr-f的序列為：ggtcttcattacacctgc；py86(egfp)-cymr-r的序列為：cctggttctaagtcagtg。
11、第三方面，本發(fā)明提供了一種所述的293t-cymr-1-2-f6細胞株的鑒定方法，鑒定步驟為：在293t-cymr-2-1-f6的ccr5的插入位點兩側(cè)設計引物，插入后進行pcr鑒定，293t-cymr-1-2-f6細胞株存在6122bp大小的陽性條帶。
12、優(yōu)選地，引物包括ccr5-outside-f2和ccr5-outside-r3，ccr5-outside-f2序列為：cttctggtttgtctggagaag；ccr5-outside-r3的序列為：caacatagtgtgatcttgtatc。
13、第四方面，本發(fā)明提供了一種所述的293t-cymr-2-1-f6細胞株在以cuo為調(diào)控元件的基因表達及功能研究中的應用。
14、第五方面，本發(fā)明提供了一種所述的293t-cymr-2-1-f6細胞株在以cuo為調(diào)控元件的病毒改造及其生產(chǎn)中的應用。
15、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
16、本發(fā)明通過試驗驗證了293t-cymr-2-1-f6的功能，證明293t-cymr-2-1-f6的單克隆細胞株能夠顯著抑制插入cuo序列后的cmv啟動子的表達效率，與轉(zhuǎn)染正常的hek293t細胞相比，轉(zhuǎn)染293t-cymr-1-2-f6細胞的綠色熒光蛋白的表達量降低了10倍。
1.一種293t-cymr-1-2-f6細胞株，其特征在于，該細胞株能夠表達cumate基因開關中的cymr基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的293t-cymr-1-2-f6細胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟s10中，px330-ccr5-3在制備的過程中，選用的grna序列為cttgtgacacggactcaagt，經(jīng)u6啟動子轉(zhuǎn)錄，cas9蛋白酶經(jīng)cmv啟動子表達。
4.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟s20中，py93-cymr-arm轉(zhuǎn)染方法步驟為：以py93-cymr為模板，從py93-cymr的ccr5同源區(qū)域設計pcr引物，pcr獲得py93-cymr-arm。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，pcr引物包括py86(egfp)-cymr-f和py86(egfp)-cymr-r，py86(egfp)-cymr-f的序列為：ggtcttcattacacctgc；py86(egfp)-cymr-r的序列為：cctggttctaagtcagtg。
6.根據(jù)權利要求1所述的293t-cymr-1-2-f6細胞株的鑒定方法，其特征在于，鑒定步驟為：在293t-cymr-2-1-f6的ccr5的插入位點兩側(cè)設計引物，插入后進行pcr鑒定，293t-cymr-1-2-f6細胞株存在6122bp大小的陽性條帶。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，引物包括ccr5-outside-f2和ccr5-outside-r3，ccr5-outside-f2序列為：cttctggtttgtctggagaag；ccr5-outside-r3的序列為：caacatagtgtgatcttgtatc。
8.根據(jù)權利要求1所述的293t-cymr-1-2-f6細胞株在以cuo為調(diào)控元件的基因表達及功能研究中的應用。
9.根據(jù)權利要求1所述的293t-cymr-1-2-f6細胞株在以cuo為調(diào)控元件的病毒改造及其生產(chǎn)中的應用。