本發(fā)明屬于血清學(xué)檢測(cè)，具體涉及特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體及在定量檢測(cè)lps抗體水平中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、布魯氏菌病(布病)是由多種布魯氏菌感染引起的同時(shí)影響牲畜、野生動(dòng)物和人類(lèi)的人獸共患傳染病。動(dòng)物布魯氏菌感染會(huì)給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也威脅人類(lèi)公共衛(wèi)生安全。

2、目前疫苗免疫預(yù)防仍然是布病防控最有效、最經(jīng)濟(jì)的方式。我國(guó)使用的減毒活疫苗，包括a19、m5-90和s2，以及基因缺失苗a19-δvirb12、m5-90δbp26和ba0711，在我國(guó)布病防控中發(fā)揮了重要作用。目前從國(guó)外引入了羊種rev.1疫苗，適用于羊的免疫，已獲批推廣應(yīng)用。

3、對(duì)于布魯氏菌疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)以及未免疫動(dòng)物的感染診斷，主要基于血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù)。目前的血清學(xué)檢測(cè)方法包括虎紅凝集試驗(yàn)(rosebengal?test，rbt)、血清凝集試驗(yàn)(serum?agglutinationtest，sat)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement?fixation?test，cft)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect?enzyme-linked?immunosorbent?assay，ielisa)、阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(competitive?elisa，celisa)、熒光偏振試驗(yàn)等(fluorescencepolarization?assay，fpa)。sat和cft可以檢測(cè)布魯氏菌全菌的抗體效價(jià)，但敏感性較差，并且有很大的可疑區(qū)間，結(jié)果受操作人員主觀判定影響較大。rbt、sat和cft以全菌作為抗原，ielisa以全菌或lps作為抗原，fpa以lps作為抗原。但布魯氏菌lps與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌o:9的lps存在交叉抗原表位，上述技術(shù)在檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌o:9的陽(yáng)性血清時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性。celisa以lps及其單克隆抗體分別作為抗原和指示抗體，雖然具有特異性，但僅能判定陽(yáng)性和陰性，不能對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。為克服上述技術(shù)缺陷，亟需研發(fā)一種基于布魯氏菌lps單克隆抗體作為指示抗體，能特異性檢測(cè)布魯氏菌lps抗體，并且能定量檢測(cè)lps抗體水平的血清學(xué)技術(shù)，以期在布魯氏菌流行病學(xué)調(diào)查及疫苗免疫評(píng)價(jià)中提供重要技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合布魯氏菌脂多糖(lipopolysaccharides，lps)的單克隆抗體，以及該單克隆抗體在定量檢測(cè)lps抗體水平中的應(yīng)用。本發(fā)明以布魯氏菌lps作為抗原，免疫小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤sp2/0細(xì)胞融合，篩選到了一株分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株lps-2a6。本發(fā)明將lps-2a6細(xì)胞株接種小鼠腹腔，收集小鼠腹水純化抗體，得到純化的特異性結(jié)合的布魯氏菌lps的單克隆抗體，與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌o:9、衣原體、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌o:157和霍亂弧菌o11/o139均不發(fā)生反應(yīng)，保證了反應(yīng)的特異性。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有3個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)以及3個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)；

3、所述輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為：序列表seq?id?no.1中第24位至40位氨基酸，序列表seq?id?no.1中第56位至62位氨基酸，序列表seq?id?no.1中第95位至102位氨基酸；

4、所述重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為：序列表seq?id?no.3中第31位至37位氨基酸，序列表seq?id?no.3中第52位至67位氨基酸，序列表seq?id?no.3中第100位至113位氨基酸。

5、作為優(yōu)選，所述單克隆抗體包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有seq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述重鏈可變區(qū)具有seq?id?no.3所示的氨基酸序列。

6、本發(fā)明的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體能夠與布魯氏菌lps特異性結(jié)合，其與布魯氏菌lps的結(jié)合能力可被布魯氏菌陽(yáng)性血清所阻斷。

7、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼基因，用于編碼上述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體。

8、作為優(yōu)選，所述編碼基因包括如seq?id?no.2所示的dna序列，以用于編碼所述特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)；以及包括如seq?id?no.4所示的dna序列，以用于編碼所述特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)。

9、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體的制備方法，其采用雜交瘤細(xì)胞接種balb/c雌性小鼠，收集小鼠腹水并純化，得到所述特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體。

10、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體在定量檢測(cè)布魯氏菌lps抗體水平中的應(yīng)用。

11、作為優(yōu)選，所述定量檢測(cè)布魯氏菌lps抗體水平包括制備檢測(cè)布魯氏菌lps抗體的阻斷elisa試劑盒。

12、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種定量檢測(cè)布魯氏菌lps抗體的阻斷elisa試劑盒，所述阻斷elisa試劑盒包括包被布魯氏菌lps的酶標(biāo)板和上述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體。

13、作為優(yōu)選，所述布魯氏菌lps的包被濃度為2μg/ml；和/或

14、所述單克隆抗體的稀釋倍數(shù)為1:6000。

15、本發(fā)明提供的試劑盒以布魯氏菌lps作為抗原，以制備的特異性單克隆抗體作為檢測(cè)指示抗體，制備檢測(cè)布魯氏菌lps血清抗體的阻斷elisa試劑盒，可定量檢測(cè)布魯氏菌lps的抗體水平，填補(bǔ)了目前布魯氏菌elisa抗體檢測(cè)試劑盒相關(guān)技術(shù)的空白。本發(fā)明的試劑盒利用阻斷elisa技術(shù)，以與布魯氏菌lps特異性結(jié)合的鼠單克隆抗體作為檢測(cè)指示抗體，可檢測(cè)多種動(dòng)物來(lái)源的血清抗體，避免了樣本來(lái)源的種屬限制(如表1所示)。另外，試劑盒重復(fù)性良好，與目前在售的布魯氏菌抗體檢測(cè)試劑盒均具有95％以上的符合率，且保存期長(zhǎng)。試劑盒操作時(shí)技術(shù)要求比較寬松，可在生產(chǎn)中廣泛推廣使用，應(yīng)用于布魯氏菌流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫水平監(jiān)測(cè)。

16、本發(fā)明的阻斷elisa試劑盒可對(duì)目前養(yǎng)羊業(yè)中使用的布魯氏菌滅活疫苗的免疫抗體水平進(jìn)行定量和評(píng)價(jià)，也可對(duì)未免疫布魯氏菌疫苗的羊進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查和診斷。

17、定量檢測(cè)布魯氏菌lps血清抗體的elisa診斷試劑一直是牛羊養(yǎng)殖業(yè)中亟需的產(chǎn)品，本發(fā)明的阻斷elisa試劑盒可對(duì)目前養(yǎng)羊業(yè)中使用的布魯氏菌弱毒疫苗的免疫抗體水平進(jìn)行定量和評(píng)價(jià)，也可對(duì)未免疫布魯氏菌疫苗的羊進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查和診斷，實(shí)現(xiàn)了對(duì)疫苗免疫效果和野毒感染情況的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。本發(fā)明以鼠源單克隆抗體作為檢測(cè)指示抗體，易于大量制備和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，相關(guān)專(zhuān)業(yè)人員根據(jù)說(shuō)明書(shū)就可操作，具有普遍性。

技術(shù)特征：

1.特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體具有3個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)以及3個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有seq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述重鏈可變區(qū)具有seq?id?no.3所示的氨基酸序列。

3.編碼基因，其特征在于：用于編碼權(quán)利要求1或2所述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因包括如seq?id?no.2所示的dna序列，以用于編碼所述特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)；以及包括如seq?id?no.4所示的dna序列，以用于編碼所述特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)。

5.一種特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體的制備方法，其特征在于：其采用雜交瘤細(xì)胞接種balb/c雌性小鼠，收集小鼠腹水并純化，得到所述特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體。

6.權(quán)利要求1或2所述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體、權(quán)利要求3或4所述的編碼基因在定量檢測(cè)布魯氏菌lps抗體水平中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述定量檢測(cè)布魯氏菌lps抗體水平包括制備檢測(cè)布魯氏菌lps抗體的阻斷elisa試劑盒。

8.一種定量檢測(cè)布魯氏菌lps抗體的阻斷elisa試劑盒，其特征在于：所述阻斷elisa試劑盒包括包被布魯氏菌lps的酶標(biāo)板和權(quán)利要求1或2所述的特異性結(jié)合布魯氏菌lps的單克隆抗體。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的阻斷elisa試劑盒，其特征在于：所述布魯氏菌lps的包被濃度為2μg/ml；和/或

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供特異性結(jié)合布魯氏菌LPS的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有3個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)以及3個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)；所述輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為：序列表SEQ?ID?NO.1中第24位至40位氨基酸，序列表SEQ?ID?NO.1中第56位至62位氨基酸，序列表SEQ?ID?NO.1中第95位至102位氨基酸；所述重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列分別為：序列表SEQ?ID?NO.3中第31位至37位氨基酸，序列表SEQ?ID?NO.3中第52位至67位氨基酸，序列表SEQ?ID?NO.3中第100位至113位氨基酸。本發(fā)明還公開(kāi)了其制備方法及其在定量檢測(cè)布魯氏菌LPS抗體水平中的應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：儲(chǔ)岳峰,鄭福英,宋國(guó)棟,葛家振,高鵬程,劉一健
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心蘭州分中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15