本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種限制性核酸內(nèi)切酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序方法。

背景技術(shù)：

1、dna保持高度的精確性和完整性對于物種穩(wěn)定具有十分重要的意義，但dna不可避免會受到來自內(nèi)外致突變因素的影響，內(nèi)源的如核酸的自發(fā)水解、細(xì)胞氧化應(yīng)激、脫氨反應(yīng)、堿基切除反應(yīng)等，外源的如輻射、化學(xué)誘變劑等。在這些內(nèi)外致突變因素的影響下，產(chǎn)生多種含量較低的微量修飾，包括尿嘧啶（uracil，u）、ap位點(diǎn)（apyrimidinic/apurinicsites，ap）、8-氧鳥嘌呤（8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8og）和次黃嘌呤等。

2、研究表明，微量修飾會增加dna斷裂產(chǎn)生的風(fēng)險，對基因組的穩(wěn)定性有重大威脅，例如ap位點(diǎn)和尿嘧啶等微量修飾的修復(fù)過程中會產(chǎn)生dna斷裂，阻礙dna復(fù)制酶的進(jìn)行，影響基因組的穩(wěn)定性和完整性。研究還發(fā)現(xiàn)，微量修飾積極參與多種生物過程，包括乳腺癌、肺癌、巨幼細(xì)胞貧血的發(fā)生與發(fā)展等，微量修飾的異常變化是多種疾病發(fā)生的重要誘因。

3、為了深入研究微量修飾在多種生物過程中的作用機(jī)制，需要對基因上微量修飾進(jìn)行高效且精確的單堿基分辨率定位分析。目前針對微量修飾的全基因組測序方法已經(jīng)開發(fā)了很多，例如染色質(zhì)免疫沉淀或者化學(xué)標(biāo)記的方法將含有微量修飾的dna富集出來并結(jié)合二代測序技術(shù)（next-generation?sequence，ngs）來實(shí)現(xiàn)基因組dna中微量修飾的定位分析。但是，抗體富集或者化學(xué)分子富集的方法存在諸多缺陷，包括分辨率低、靈敏度低、特異性不足且定位分析僅局限于特定的修飾等。目前還報道了一些糖苷酶輔助的斷點(diǎn)測序方法，例如檢測尿嘧修飾的ucaps-seq、檢測8og的claps-seq等。這些方法雖然都實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率定位分析微量修飾，但是均存在一定的缺陷和不足。由于微量修飾在dna中含量較低，這些方法仍需要通過抗體富集等手段將含有微量修飾的dna富集出來，但是對于不同微量修飾的的富集方式差異巨大，需要針對單一修飾開發(fā)針對性的富集策略，開發(fā)難度較大。因此，需要開發(fā)一種操作簡單、準(zhǔn)確性高、普適性高的微量修飾富集后測序分析方法。

4、基于限制性內(nèi)切酶能夠?qū)崿F(xiàn)dna的快速酶切，本發(fā)明提供一種限制性核酸內(nèi)切酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種限制性核酸內(nèi)切酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序方法，該方法能夠達(dá)到單堿基分辨率，具有靈敏度高、高特異性、操作簡單的優(yōu)勢。

2、本發(fā)明原理見圖1，首先通過對片段化的dna進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接的方式在dna兩端添加含有限制性核酸內(nèi)切酶（例如：sal??。┪稽c(diǎn)的接頭1，然后使用糖苷酶切割dna上的微量修飾，形成ap位點(diǎn)，并添加ap內(nèi)切酶1（ap?endonuclease?1，ape1）斷裂a(bǔ)p位點(diǎn)形成一個單核苷酸間隙，后續(xù)延伸得到終止于微量修飾前一位且不含有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的截短dna；或者，使用ape1酶切割dna上的內(nèi)源性ap位點(diǎn)，形成一個單核苷酸間隙，后續(xù)延伸得到終止于ap位點(diǎn)前一位且不含有限制性核酸內(nèi)切酶位位點(diǎn)的截短dna；而不含有微量修飾或者不含ap位點(diǎn)的dna未被切割，延伸得到5’端含有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna。然后，通過dna連接酶連接接頭p5。接頭p5連接后，采用限制性核酸內(nèi)切酶切割背景dna形成雙鏈斷裂，導(dǎo)致全長dna無法作為后續(xù)pcr擴(kuò)增的模版；而截短dna未被限制性核酸內(nèi)切酶位切割，其可以作為后續(xù)pcr擴(kuò)增的模版。使用和接頭p5對應(yīng)的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，僅含有微量修飾或內(nèi)源性ap位點(diǎn)的dna的延伸產(chǎn)物可以被擴(kuò)增，即實(shí)現(xiàn)了特異性擴(kuò)增含微量修飾dna的目標(biāo)，且擴(kuò)增產(chǎn)物中與接頭p5連接的位置即為微量修飾或內(nèi)源性ap位點(diǎn)的前一位。最后結(jié)合測序技術(shù)（例如：ngs）實(shí)現(xiàn)對dna上微量修飾的定位分析，如此便可以在不依賴于復(fù)雜的親和反應(yīng)的同時實(shí)現(xiàn)微量修飾的富集和定位分析。只要微量修飾位點(diǎn)在生物酶的處理下發(fā)送單鏈斷裂，利用本發(fā)明的方法便可實(shí)現(xiàn)微量修飾dna的富集和定位分析。本發(fā)明方法操作簡單、準(zhǔn)確性高且具有較高的普適性，為定位分析dna上微量修飾提供強(qiáng)大的工具。

3、單堿基分辨率定位分析微量修飾的原理如下：接頭p5和dna的連接位置為微量修飾或內(nèi)源性ap位點(diǎn)的前一位。在處理實(shí)際樣品時，首先將dna進(jìn)行片段化，末端修復(fù)并連接含有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的接頭1（adaptor?1），使dna都帶有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后一組使用dna聚合酶延伸未對微量修飾進(jìn)行切割處理的dna樣品，延伸產(chǎn)物為包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna，并連接接頭p5；一組使用dna聚合酶延伸對微量修飾進(jìn)行切割處理后的dna樣品，此時，該組不包含微量修飾的dna不會被切割延伸得到包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna，而包含微量修飾的dna其微量修飾被切割延伸形成不包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的截斷產(chǎn)物，并連接接頭p5。分別向兩組中添加限制性核酸內(nèi)切酶，則微量修飾未經(jīng)切割處理組的全長dna全被切割，無法作為后續(xù)pcr的模版，無pcr產(chǎn)物生成，而微量修飾被切割的處理組中，不含微量修飾的dna被限制性核酸內(nèi)切酶切割，無法作為后續(xù)pcr擴(kuò)增的模版，含微量修飾的dna不會被限制性核酸內(nèi)切酶切割，可以作為后續(xù)pcr擴(kuò)增的模版，則pcr產(chǎn)物即為含有微量修飾的dna且斷點(diǎn)位置位于微量修飾前一位。基于此，實(shí)驗過程中將樣品均等分為兩份，一份對微量修飾進(jìn)行切割處理（利用糖苷酶特異性切割尿嘧啶或8og，或者利用ape1酶特異性切割內(nèi)源性ap位點(diǎn)），另一份不進(jìn)行切割處理，兩份樣品再利用dna聚合酶進(jìn)行延伸，并連接接頭p5，然后將連接頭p5的產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶處理去除不含微量修飾的dna，將限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)物通過pcr擴(kuò)增和測序獲得對應(yīng)dna序列，根據(jù)接頭p5和基因組dna連接序列的差異確定微量修飾的位置。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

5、第一方面，本發(fā)明提供一種限制性核酸內(nèi)切酶輔助的dna中微量修飾堿基的單堿基分辨率測序方法，包括如下步驟：

6、（1）將dna進(jìn)行片段化處理，然后進(jìn)行末端修復(fù)，并與帶有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的接頭1連接；

7、（2）將經(jīng)步驟（1）處理的dna樣品均等分為兩份，將至少一份dna樣品用糖苷酶和/或ape1酶進(jìn)行處理；

8、（3）在兩份dna樣品中分別加入相同的dna探針，用dna聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)；所述dna探針一部分與adaptor?1完全互補(bǔ)配對，配對部分不包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，另一部分與adaptor?1不配對，用于后續(xù)的pcr擴(kuò)增；

9、（4）回收延伸產(chǎn)物，連接接頭p5；步驟（2）中，未經(jīng)糖苷酶處理的dna中只包含含有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna；經(jīng)過糖苷酶處理的dna中，含微量修飾的dna被糖苷酶切割形成一個單核苷酸間隙，經(jīng)過步驟（3）延伸得到終止于微量修飾前一位的截短dna（不包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)），而不包含微量修飾的dna不會被糖苷酶切割，經(jīng)過步驟（3）延伸得到包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna；上述的截短dna和全長dna都和接頭p5連接；所述接頭p5為5’端帶有磷酸根的接頭。

10、（5）使用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行處理，然后通過與p5和探針互補(bǔ)配對的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測序，根據(jù)斷點(diǎn)位置位于微量修飾前一位的原則測序基因組中微量修飾。

11、進(jìn)一步地，步驟（2）中對所述dna樣品進(jìn)行處理，根據(jù)所要測序的微量修飾堿基選擇相應(yīng)的處理方法；當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，步驟（2）具體如下：將經(jīng)步驟（1）處理的dna樣品均等分為兩份，一份不用糖苷酶處理（添加對應(yīng)的蛋白緩沖液，不加蛋白），另一份用糖苷酶處理，兩份dna樣品再使用ape1酶處理；當(dāng)所要測序的微量修飾為ap位點(diǎn)（內(nèi)源性ap位點(diǎn)）時，步驟（2）具體如下：將經(jīng)步驟（1）處理的dna樣品均等分為兩份，一份不用ape1酶處理（添加對應(yīng)的蛋白緩沖液，不加蛋白），另一份用ape1酶處理。

12、當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，步驟（2）中，若不加入糖苷酶，dna未被切割，則含微量修飾和不含微量修飾的dna在步驟（3）都延伸產(chǎn)生含有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna，該類型dna在步驟（5）被限制性核酸內(nèi)切酶切除，無pcr產(chǎn)物生成；若在步驟（2）中進(jìn)行處理，dna上的微量修飾被切割，形成單堿基缺口，則含有微量修飾的dna在步驟（3）延伸產(chǎn)生終止于微量修飾前一位且不包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的截短dna，該類型dna在步驟（5）不會被限制性核酸內(nèi)切酶切割，作為pcr模版產(chǎn)生pcr產(chǎn)物，而不含微量修飾的dna未被切割且延伸產(chǎn)生包含限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的全長dna，該類型dna在步驟（5）被限制性核酸內(nèi)切酶切割，無法作為pcr的模版，所以此時pcr產(chǎn)物中只包括來自含微量修飾的截短dna，且與接頭p5連接的位置即為微量修飾的位置。當(dāng)所要測序的微量修飾為ap位點(diǎn)時，步驟（2）中，采用ape1酶對其中一份dna樣品進(jìn)行處理的原理同上。

13、更進(jìn)一步地，步驟（2）中，當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，采用所述糖苷酶處理dna樣品的條件為糖苷酶對應(yīng)的適宜條件；當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶時，條件如下：將udgx-h109s糖苷酶在udgx-h109s緩沖液（50?mm?tris-hcl?ph?8.0，1?mm?na2edta，1?mm?dtt，25?μg/ml?bsa）中與dna樣品在37?℃反應(yīng)0.3-12?h；當(dāng)所要測序的微量修飾為8og時，條件如下：將pab-agog糖苷酶在糖苷酶緩沖液（20?mm?tris-hcl,?5?mm?dtt,?8%glycerol,?ph?8.0）中與dna樣品在37?℃反應(yīng)5?min-12?h。

14、更進(jìn)一步地，當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，經(jīng)糖苷酶處理之后，采用所述ape1酶處理dna樣品的的條件為：向反應(yīng)體系中加入ape1酶和ape1?buffer，于37?℃反應(yīng)1-16?h。

15、更進(jìn)一步地，當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶或8og時，采用所述糖苷酶，以及經(jīng)糖苷酶處理之后，采用ape1酶處理dna樣品的具體步驟如下：

16、1）當(dāng)所要測序的微量修飾為尿嘧啶時，采用如下反應(yīng)體系（20?μl）：50?mm?tris-hcl?ph?8.0，1?mm?na2edta，1?mm?dtt，25?μg/ml?bsa，8?pmol?udgx-h109s，1-10?μg?dna樣品，加水補(bǔ)至10?μl；將反應(yīng)體系置于37?℃反應(yīng)0.3-12?h；當(dāng)所要測序的微量修飾為8og時，采用如下反應(yīng)體系（20?μl）：20?mm?tris-hcl,?5?mm?dtt,?8%?glycerol,?ph?8.0，0.2?μmpab-agog，1-10?μg?dna樣品，加水補(bǔ)至20?μl；將反應(yīng)體系置于37?℃反應(yīng)5?min-12?h。

17、2）步驟1）反應(yīng)結(jié)束后，添加1?μl?10?u/μl?ape1酶，2?μl?10?×?ape1?buffer，將反應(yīng)體系置于37?℃反應(yīng)1-16?h。

18、更進(jìn)一步地，當(dāng)所要測序的微量修飾為ap位點(diǎn)時，采用所述ape1酶處理dna樣品的條件為：將ape1酶在ape1酶緩沖液（50?mm?potassium?acetate，20?mm?tris-acetate，10mm?magnesium?acetate，1?mm?dtt，ph?7.9）中與dna樣品在37?℃反應(yīng)1-12?h。

19、更進(jìn)一步地，當(dāng)所要測序的微量修飾為ap位點(diǎn)時，采用所述ape1酶處理dna樣品的反應(yīng)體系如下（20?μl）：50?mm?potassium?acetate，20?mm?tris-acetate，10?mmmagnesium?acetate，1?mm?dtt，ph?7.9，1?u?ape1，1-10?μg?dna樣品，加水補(bǔ)至20?μl；反應(yīng)體系置于37?℃反應(yīng)1-12?h。

20、進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述dna聚合酶為taq?dna聚合酶。

21、進(jìn)一步地，步驟（5）中，所述限制性核酸內(nèi)切酶為sal?ⅰ。

22、進(jìn)一步地，步驟（5）中，采用所述限制性核酸內(nèi)切酶處理的具體操作如下：添加1?u限制性核酸內(nèi)切酶，2?μl?10?×?quickcut?buffer，將反應(yīng)體系置于37?℃反應(yīng)1-16?h。

23、第二方面，本發(fā)明提供一種定位檢測dna中微量修飾的試劑盒，包含糖苷酶、ape1酶、dna聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶。

24、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包含相應(yīng)蛋白或酶的反應(yīng)緩沖液。

25、本發(fā)明基于限制性核酸內(nèi)切酶的切割特性實(shí)現(xiàn)了單堿基分辨率定位檢測dna中微量修飾，基于此，本發(fā)明進(jìn)一步提供所述限制性核酸內(nèi)切酶在輔助定位檢測dna中微量修飾的應(yīng)用，以及所述限制性核酸內(nèi)切酶在制備定位檢測dna中微量修飾的試劑盒中的應(yīng)用。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：

27、（1）簡便易行：本發(fā)明的方法設(shè)計簡潔，易于理解和執(zhí)行。整個實(shí)驗流程不僅成本低廉，對儀器的要求也不高，極大地便于在各種實(shí)驗室環(huán)境中推廣應(yīng)用。

28、（2）精準(zhǔn)定位：本發(fā)明能夠精確定位dna中的微量修飾，為研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

29、（3）快速評估：無需復(fù)雜的優(yōu)化步驟，通過qpcr擴(kuò)增，本發(fā)明即可快速定位基因組上不同位點(diǎn)的微量修飾，提高了研究效率。

30、（4）疾病研究工具：本發(fā)明可用于分析生物樣品中關(guān)鍵微量修飾位點(diǎn)的變化，為深入探究微量修飾在多種疾病中的作用提供了強(qiáng)有力的工具，具有重要的科學(xué)和臨床價值。

31、（5）本發(fā)明提供的方法靈敏度高，特異性好，操作簡單，效率高，不僅可以用于豐度低的生物樣品中微量修飾的單堿基分辨率定位測定，同時為微量修飾在生物體中的功能研究提供了新方法。