本發(fā)明提供一種表達(dá)人或嵌合(例如，人源化)ntrk1和/或ngf蛋白的非人動(dòng)物及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、傳統(tǒng)的藥物研發(fā)通常使用體外篩選方法，然而這些篩選方法無(wú)法提供機(jī)體環(huán)境(如腫瘤微環(huán)境、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)成分和免疫細(xì)胞相互作用等)，導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)失敗率較高。此外，鑒于人與動(dòng)物之間的差異，使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)藥理試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)結(jié)果可能無(wú)法反映真實(shí)的疾病狀態(tài)和靶向部位的相互作用，導(dǎo)致許多臨床試驗(yàn)的結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在顯著差異。

2、因此，開(kāi)發(fā)適合人用藥篩選和評(píng)價(jià)的人源化動(dòng)物模型將顯著提高新藥開(kāi)發(fā)效率，降低藥物研發(fā)成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供一種具有人或嵌合ntrk1和/或ngf蛋白的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型可以表達(dá)人或嵌合ntrk1和/或ngf(如，人源化ntrk1和/或ngf)蛋白。它可用于ntrk1和/或ngf基因功能的研究，還可用于ntrk1和/或ngf信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑(例如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物和/或多肽藥物)的篩選和評(píng)估。此外，通過(guò)本技術(shù)所述方法制備的動(dòng)物模型可用于藥物篩選、藥效學(xué)研究、免疫疾病、癌癥、神經(jīng)疾病或炎癥的治療和人ntrk1和/或ngf靶位點(diǎn)的疾病治療；該動(dòng)物模型還可以用于促進(jìn)新藥開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)，節(jié)省時(shí)間和成本。綜上所述，本發(fā)明為研究ntrk1和/或ngf蛋白的功能提供了強(qiáng)有力的工具，為篩選相關(guān)藥物提供了平臺(tái)。

2、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含至少一條染色體，所述染色體包含編碼人或嵌合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(ntrk1)蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列可以為cdna、cds或基因組dna序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列可操作地連接至至少一條染色體的內(nèi)源ntrk1基因座的內(nèi)源調(diào)控元件(如，啟動(dòng)子和/或utr，例如5’utr和/或3’utr)。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白為人源化ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白的氨基酸序列包含與人ntrk1蛋白的至少50個(gè)到796個(gè)連續(xù)氨基酸一致的氨基酸序列，例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、370、371、372、390、391、392、400、450、500、550、600、650、700、750或796個(gè)連續(xù)氨基酸一致等。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白包含人或人源化胞外區(qū)、內(nèi)源跨膜區(qū)和內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)包括信號(hào)肽。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)不包含信號(hào)肽。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白包括人或人源化胞外區(qū)、內(nèi)源信號(hào)肽、內(nèi)源跨膜區(qū)和內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述人源化胞外區(qū)包括人ntrk1蛋白胞外區(qū)的至少50個(gè)到391個(gè)連續(xù)氨基酸一致的氨基酸序列，例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、370、371、372、390或391個(gè)連續(xù)氨基酸一致等。在一些實(shí)施例中，所述人或嵌合ntrk1蛋白的氨基酸序列包含人ntrk1(np_002520.2，seq?id?no：2)，或包含與人ntrk1(np_002520.2，seq?id?no：2)同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸，或包含與seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：7，或包含與seq?id?no：7同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如猴子、嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ntrk1相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)人或嵌合ntrk1蛋白。

3、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含在內(nèi)源ntrk1基因座處人ntrk1的核苷酸序列替換內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列可以為cdna、cds或基因組dna序列。在一些實(shí)施例中，所述的人ntrk1的核苷酸序列編碼人或嵌合ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述的人ntrk1的核苷酸序列編碼人ntrk1蛋白胞外區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列編碼人ntrk1蛋白胞外區(qū)的至少50個(gè)到391個(gè)連續(xù)氨基酸一致的核苷酸序列，例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、370、371、372、390或391個(gè)連續(xù)氨基酸一致的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人ntrk1的核苷酸序列編碼人ntrk1蛋白胞外區(qū)的全部。在一些實(shí)施例中，所述的人ntrk1的核苷酸序列包含編碼seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸，或包含編碼與seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列或編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ntrk1基因座的內(nèi)源調(diào)控元件。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源ntrk1蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ntrk1相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物基因組中修飾的ntrk1基因?qū)τ趦?nèi)源被替換的基因座為純合或雜合。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列包含編碼胞外區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列包含人ntrk1基因至少5bp至66101bp連續(xù)核苷酸，例如至少5、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1112、1113、1114、1172、1173、1174、2000、2500、2660、2668、2669、2670、5000、10000、12000、13000、13553、13554、13555、20000、30000、40000、50000、60000或66101bp連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列包含人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，人ntrk1的核苷酸序列包含外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1基因的外顯子1的部分包含外顯子1的至少5bp到282bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、50、100、109、110、111、115、116、117、120、150、200、250或282bp，優(yōu)選至少50bp至150bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述外顯子1的部分包括外顯子1中編碼胞外區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1基因的外顯子10的部分包含外顯子10的至少5bp至56bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、19、20、21、30、40、50、55或56bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1基因的外顯子11的部分包含外顯子11的至少5bp至103bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、17、18、19、20、30、38、50、100或至少103bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述外顯子11的部分包括外顯子11中編碼胞外區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1的核苷酸序列包含seq?id?no：5，或包含與seq?id?no：5所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源編碼胞外區(qū)全部或部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼seq?idno：1第35-408或34-420位的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的全部或部分。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物ntrk1基因外顯子1的部分包含外顯子1的至少5bp到230bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、50、100、109、110、111、112、113、114、120、150、200或230bp，優(yōu)選至少50bp至150bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述外顯子1的部分包括外顯子1中編碼胞外區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物ntrk1基因外顯子10的部分包含外顯子10的至少5bp至56bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、19、20、21、30、40、50、55或56bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如，猴子、嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述的嚙齒動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中修飾的基因轉(zhuǎn)錄的mrna包含seq?id?no：6，或包含與seq?id?no：6所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括其他基因編碼的人或嵌合蛋白的核苷酸序列，所述人或嵌合蛋白包括但不限于ngf、ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

4、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含在內(nèi)源ntrk1基因座處編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ntrk1基因座的內(nèi)源調(diào)控元件，并且所述非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)人或人源化ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源ntrk1蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ntrk1相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述替換編碼內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域?yàn)閮?nèi)源ntrk1胞外區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述替換編碼內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域?yàn)閮?nèi)源ntrk1胞外區(qū)、內(nèi)源跨膜區(qū)和/或內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)嵌合ntrk1蛋白，所述嵌合ntrk1蛋白包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，所述胞外區(qū)與人ntrk1胞外區(qū)一致或一致性至少為50％、60％、70％、80％、90％、95％或99.5％。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)與人ntrk1胞外區(qū)至少10、20、30、40、50、60、70、80、10或100個(gè)連續(xù)氨基酸一致。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列包含人ntrk1基因的外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列包含人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分至少500-1000、1000-5000、5000-10000、10000-13000或13000-15000bp的核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列包含人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1蛋白的核苷酸序列包含seq?id?no：5，或包含與seq?id?no：5所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的全部。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物基因組中修飾的ntrk1基因?qū)τ趦?nèi)源被替換的基因座為純合或雜合。

5、在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ntrk1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼人ntrk1蛋白胞外區(qū)的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ntrk1蛋白胞外區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼seq?id?no：7的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼seq?id?no：7或2的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ntrk1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼seq?id?no：2第35-405或33-423位的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?idno：1第35-408或34-420位的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括人ntrk1的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分替換非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子11的部分替換非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的全部的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括seq?id?no：5所示的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括seq?id?no：5所示的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?id?no：1第35-408的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括seq?id?no：6所示的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ntrk1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括seq?id?no：6所示的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。

6、在一方面，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物包含至少一個(gè)編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列的細(xì)胞，其中所述人或嵌合ntrk1蛋白包含與人相應(yīng)區(qū)域的連續(xù)氨基酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、250、300、350、370、371、372、390、391、392、400、450、500、550、600、650、700、750或796個(gè)連續(xù)氨基酸序列一致，非人動(dòng)物表達(dá)人或嵌合ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白包含人ntrk1胞外區(qū)氨基酸至少50個(gè)連續(xù)氨基酸。在一些實(shí)施例中，所述人或嵌合ntrk1蛋白包含seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸，或包含與seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸同一性至少為70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ntrk1調(diào)控元件。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列可被整合至所述非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因座。在一些實(shí)施例中，所述人或嵌合ntrk1蛋白具有至少一種非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1活性和/或人ntrk1活性。

7、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞中，在非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因座處，編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源ntrk1蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ntrk1相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分至少500-1000、1000-5000、5000-10000、10000-13000或13000-15000個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列包含seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸，或包含與seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ntrk1區(qū)域?yàn)閮?nèi)源ntrk1胞外區(qū)、內(nèi)源跨膜區(qū)和/或內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ntrk1區(qū)域?yàn)閮?nèi)源ntrk1胞外區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列包含seq?id?no：2或7，或包含與seq?id?no：2或7所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含seq?id?no：5，或包含與seq?id?no：5所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的全部。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ntrk1調(diào)控元件，如，啟動(dòng)子和/或utr。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如，猴子、嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為小鼠或大鼠。

8、在一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)人或嵌合ntrk1基因修飾非人動(dòng)物細(xì)胞的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括在非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源ntrk1基因座處，編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換，產(chǎn)生基因修飾的非人動(dòng)物細(xì)胞，所述非人動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)人或嵌合ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白包含人或人源化胞外區(qū)、內(nèi)源跨膜區(qū)和內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)包含信號(hào)肽。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)不包含信號(hào)肽。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ntrk1蛋白包含內(nèi)源信號(hào)肽、人或人源化胞外區(qū)、內(nèi)源跨膜區(qū)和內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分至少500-1000、1000-5000、5000-10000、10000-13000或13000-15000個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列包含seq?id?no：2，或包含與seq?id?no：2所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列包含seq?id?no：2第35-405或33-423位，或包含與seq?id?no：2第35-405或33-423位氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ntrk1區(qū)域?yàn)閮?nèi)源ntrk1胞外區(qū)、內(nèi)源跨膜區(qū)和/或內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ntrk1區(qū)域?yàn)閮?nèi)源ntrk1胞外區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ntrk1的調(diào)控元件，如，啟動(dòng)子和/或utr。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是小鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括其他基因編碼的人或嵌合蛋白的核苷酸序列，所述人或嵌合蛋白包括但不限于ngf、ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

9、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含至少一條染色體，所述染色體包含編碼人或嵌合神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼嵌合ngf蛋白的核苷酸序列可以為cdna、cds或基因組dna序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ngf蛋白為人源化ngf蛋白。在一些實(shí)施例中，所述嵌合ngf蛋白的氨基酸序列包含與人ngf蛋白的至少50個(gè)到241個(gè)連續(xù)氨基酸一致的氨基酸序列，例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、240或241個(gè)連續(xù)氨基酸一致等。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合ngf蛋白的核苷酸序列可操作地連接至至少一條染色體的內(nèi)源ngf基因座的內(nèi)源調(diào)控元件(如，啟動(dòng)子和/或utr，例如5’utr和/或3’utr)。在一些實(shí)施例中，所述人或嵌合ngf蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：13或18，或包含與seq?idno：13或18同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如猴子、嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ngf蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ngf相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)人或嵌合ngf蛋白。

10、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含在內(nèi)源ngf基因座處人ngf的核苷酸序列替換內(nèi)源ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列可以為cdna、cds或基因組dna序列。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列編碼人ngf蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列編碼seq?id?no：13或18。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列或編碼人或嵌合ngf蛋白的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ngf基因座的內(nèi)源調(diào)控元件。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源ngf蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ngf相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物基因組中修飾的ngf基因?qū)τ趦?nèi)源被替換的基因座為純合或雜合。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列包含人ngf基因至少5bp至52333bp連續(xù)核苷酸，例如至少5、50、100、200、300、400、500、600、700、720、725、726、727、800、891、900、1000、1061、1100、1500、2000、2500、3000、4000、5000、10000、12000、13000、20000、30000、40000、50000或52333bp連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列包含人ngf基因的起始密碼子至終止密碼子的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列包含人ngf基因的外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述人ngf基因的外顯子3的部分包括外顯子3的至少5bp到891bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、725、726、727、730、750、800、850或891bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ngf基因的外顯子3的部分包括起始密碼子至終止密碼子的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ngf基因的外顯子3的部分包括編碼區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人ngf的核苷酸序列包含seq?id?no：16，或包含與seq?id?no：16所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼seq?id?no：12的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物ngf基因的起始密碼子至終止密碼子的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物ngf基因外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物ngf基因外顯子3的部分包括外顯子3的至少5bp到903bp的連續(xù)核苷酸序列，例如至少5、10、15、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、725、726、727、730、750、800、850、900或903bp的連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物ngf基因的外顯子3的部分包括起始密碼子至終止密碼子的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物ngf基因外顯子3的部分包括編碼區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如，猴子、嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述的嚙齒動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的基因組中修飾的基因轉(zhuǎn)錄的mrna包含seq?id?no：17，或包含與seq?id?no：17所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括其他基因編碼的人或嵌合蛋白的核苷酸序列，所述人或嵌合蛋白包括但不限于ntrk1、ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

11、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含在內(nèi)源ngf基因座處編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ngf基因座的內(nèi)源調(diào)控元件，并且所述非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)人或人源化ngf蛋白。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源ngf蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ngf相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ngf基因的外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含seq?id?no：16，或包含與seq?id?no：16所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf基因外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物基因組中修飾的ngf基因?qū)τ趦?nèi)源被替換的基因座為純合或雜合。

12、在一方面，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物包含至少一個(gè)編碼人或人源化ngf蛋白的核苷酸序列的細(xì)胞，其中所述人源化ngf蛋白包含與人相應(yīng)區(qū)域的連續(xù)氨基酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、150、200、240或241個(gè)連續(xù)氨基酸序列一致，非人動(dòng)物表達(dá)人或人源化ngf蛋白。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或人源化ngf蛋白的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ngf調(diào)控元件。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或人源化ngf蛋白的核苷酸序列可被整合至所述非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因座。在一些實(shí)施例中，所述人或人源化ngf蛋白具有至少一種非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf活性和/或人ngf活性。

13、在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼人或嵌合ngf蛋白的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ngf蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼seq?idno：13或18的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ngf蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括編碼seq?id?no：13或18的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?idno：12的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括人ngf基因外顯子3的部分的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因外顯子3的部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括人ngf基因起始密碼子至終止密碼子的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因起始密碼子至終止密碼子的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括seq?id?no：16或17的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?id?no：12的核苷酸序列。

14、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞中，在非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因座處，編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源ngf蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中ngf相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ngf基因外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述人ngf相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列包含seq?id?no：13或18，或包含與seq?id?no：13或18所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含seq?id?no：16，或包含與seq?id?no：16所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf基因外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ngf調(diào)控元件，如，啟動(dòng)子和/或utr。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如，猴子、嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為小鼠或大鼠。

15、在一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)人或嵌合ngf基因修飾非人動(dòng)物細(xì)胞的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括在內(nèi)源非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf基因座處，編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換，產(chǎn)生基因修飾的非人動(dòng)物細(xì)胞，所述非人動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)人或嵌合ngf蛋白。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人ngf基因外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述人ngf相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列包含seq?id?no：13或18，或包含與seq?id?no：13或18所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含seq?id?no：16，或包含與seq?id?no：16所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf基因外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源ngf的調(diào)控元件，如，啟動(dòng)子和/或utr。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是小鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括其他基因編碼的人或嵌合蛋白的核苷酸序列，所述人或嵌合蛋白包括但不限于ntrk1、ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

16、在一方面，本發(fā)明提供了一種所述非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物的應(yīng)用，所述應(yīng)用包含：a)涉及人類細(xì)胞的與ntrk1和/或ngf相關(guān)的免疫過(guò)程的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用；b)作為藥理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的與ntrk1和/或ngf相關(guān)的模型系統(tǒng)中的應(yīng)用；c)涉及生產(chǎn)和利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)疾病模型用于與ntrk1和/或ngf相關(guān)的病原學(xué)研究和/或用于開(kāi)發(fā)診斷策略和/或用于開(kāi)發(fā)治療策略中的應(yīng)用；d)在體內(nèi)研究人ntrk1和/或ngf信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑的篩選、藥效檢測(cè)、評(píng)估療效、驗(yàn)證或評(píng)價(jià)中的應(yīng)用；或者，e)研究ntrk1和/或ngf基因功能，研究針對(duì)人ntrk1和/或ngf靶位點(diǎn)的藥物、藥效，研究與ntrk1和/或ngf相關(guān)的癌癥、免疫疾病、神經(jīng)疾病或炎癥藥物方面的應(yīng)用。

17、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療疾病有效性或毒性的方法，所述方法包括：1)向所述非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑；2)測(cè)定治療劑對(duì)疾病或動(dòng)物的作用。在一些實(shí)施例中，所述治療劑包含靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述治療劑還包括附加治療劑，例如抗pd-1抗體、抗pd-l1抗體或抗ctla4抗體。在一些實(shí)施例中，所述疾病為癌癥、免疫疾病、神經(jīng)疾病或炎癥。

18、在一些實(shí)施例中，所述癌癥為實(shí)體瘤或血液瘤，所述實(shí)體瘤包括但不限于乳腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、內(nèi)分泌癌、頭頸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌癥、黑色素瘤、腎癌癥或肺癌；所述血液瘤包括但不限于淋巴細(xì)胞腫瘤，例如b或t細(xì)胞腫瘤。

19、在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病包括但不限于gvhd(移植物抗宿主病)、過(guò)敏性鼻炎、銀屑病、多發(fā)硬化癥、克羅恩病、強(qiáng)直性脊柱炎、過(guò)敏、哮喘、心肌炎、腎炎、肝炎(優(yōu)選為非酒精性脂肪性肝炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺功能亢進(jìn)、血小板減少性紫癜(包括原發(fā)性或特發(fā)性)、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛等。在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病為過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)硬化癥。

20、在一些實(shí)施例中，所述的炎癥包括急性炎癥和慢性炎癥。具體而言，炎癥包括但不限于退行性炎癥、滲出性炎癥(例如漿液性炎癥、纖維蛋白炎癥、化膿性炎癥、出血性炎癥、壞死性炎癥、卡他性炎癥)、增殖性炎癥、特異性炎癥(如肺結(jié)核、梅毒、麻風(fēng)病或淋巴肉芽腫)。在一些實(shí)施例中，所述的炎癥包括感染，并且感染是指由侵入人體的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)和/或其他病原體引起的局部組織和全身炎癥反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，所述炎癥為關(guān)節(jié)炎、瘙癢、特應(yīng)性皮炎或炎癥性腸病(ibd)。

21、在一些實(shí)施例中，所述神經(jīng)疾病為認(rèn)知障礙、阿爾茨海默癥、帕金森或亨廷頓舞蹈癥。

22、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療癌癥有效性的方法，所述方法包括：

23、1)向所述的非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物患有癌癥；2)測(cè)定治療劑對(duì)癌癥的抑制作用。在一些實(shí)施例中，所述癌癥為腫瘤，通過(guò)測(cè)量非人動(dòng)物的腫瘤體積，判定治療劑對(duì)腫瘤的抑制作用。在一些實(shí)施例中，所述癌癥包含向非人動(dòng)物體內(nèi)注射一個(gè)或多個(gè)癌細(xì)胞。

24、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療免疫疾病有效性的方法，所述方法包括：1)向所述非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物患有免疫疾病；2)測(cè)定治療劑對(duì)免疫疾病的治療作用。

25、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療炎癥有效性的方法，所述方法包括：

26、1)向所述的非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物具有炎癥；2)測(cè)定治療劑對(duì)治療炎癥的有效性。

27、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療神經(jīng)疾病有效性的方法，所述方法包括：1)向所述的非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物具有神經(jīng)疾??；2)測(cè)定治療劑對(duì)治療神經(jīng)疾病的有效性。

28、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑毒性的方法，所述方法包括：1)向所述的非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑；2)測(cè)定治療劑對(duì)非人動(dòng)物的作用。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定治療劑對(duì)非人動(dòng)物的作用包括但不限于測(cè)量非人動(dòng)物的體重和/或血液檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，所述血液檢測(cè)包括但不限于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容和/或血紅蛋白含量。

29、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化ntrk1蛋白，所述人源化ntrk1蛋白包含人ntrk1蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1蛋白包括人ntrk1蛋白的胞外區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1蛋白包括人或人源化胞外區(qū)、內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)和內(nèi)源跨膜區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)包含信號(hào)肽。在一些實(shí)施例中，所述胞外區(qū)不包含信號(hào)肽。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1蛋白包括內(nèi)源信號(hào)肽、人或人源化胞外區(qū)、內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)和內(nèi)源跨膜區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1蛋白包含seq?id?no：7，或包含與seqid?no：7所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。

30、在一方面，本發(fā)明一種人源化ntrk1基因，所述人源化ntrk1基因編碼所述人源化ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因包含編碼人ntrk1胞外區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因包含編碼seq?id?no：2第35-

31、405或33-423位的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因包含人ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子2-9的全部和/或外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因包含人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因包含人ntrk1基因外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因還包含非人動(dòng)物ntrk1基因外顯子1的部分、外顯子10的部分和/或外顯子11-17的全部。在一些實(shí)施例中，所述人源化ntrk1基因包含的核苷酸序列包含seq?idno：3、4、5、6、8、9、10或11，或包含與seq?id?no：3、4、5、6、8、9、10或11所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

32、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化ngf基因，所述人源化ngf基因包含下列任一核苷酸序列：

33、a)編碼seq?id?no：13或18蛋白的核苷酸序列；

34、b)seq?id?no：14、15、16、17、19、20、21、22、23、24或25；

35、c)與seq?id?no：14、15、16、17、19、20、21、22、23、24或25至少90％一致性的核苷酸序列；

36、d)與seq?id?no：14、15、16、17、19、20、21、22、23、24或25至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％一致性的核苷酸序列。

37、在一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞、組織或器官，所述細(xì)胞、組織或器官中包含所述的人源化ntrk1蛋白、所述的人源化ntrk1基因和/或所述的人源化ngf基因。

38、在一方面，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物基因組，所述非人動(dòng)物基因組包含至少一條染色體，所述染色體包含編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含人或嵌合ntrk1基因。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含編碼人ntrk1胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子10的部分。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源基因組的ntrk1被替換。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源基因組的編碼ntrk1胞外區(qū)的核苷酸序列被替換。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列被替換。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子10的全部或部分被替換。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源基因組中編碼seq?id?no：1第35-408或34-420位的核苷酸序列被替換。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含編碼人或嵌合ntrk1蛋白的核苷酸序列或人ntrk1的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源染色體的相應(yīng)部分。在一些實(shí)施例中，包含編碼seq?id?no：2第35-405或33-423位的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?id?no：1第35-408或34-420位的核苷酸序列。

39、在一方面，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物基因組，所述非人動(dòng)物基因組包含至少一條染色體，所述染色體包含編碼人或嵌合ngf蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含人或嵌合ngf基因。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含編碼人ngf蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含人ngf基因的外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源基因組的ngf被替換。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源基因組中編碼seq?id?no：12的核苷酸序列被替換。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因的外顯子3的部分被替換。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含編碼人或嵌合ngf蛋白的核苷酸序列或人ngf的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源染色體的相應(yīng)部分。在一些實(shí)施例中，包含編碼seq?id?no：13或18位的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源編碼seq?id?no：12的核苷酸序列。

40、在一方面，本發(fā)明提供了一種包含上述非人動(dòng)物基因組的細(xì)胞、組織或器官。

41、在一方面，本發(fā)明提供了一種動(dòng)物模型，在一些實(shí)施例中，所述的動(dòng)物模型包含所述的蛋白和所述的基因。

42、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“全部或部分”，“全部”為整體，“部分”為整體中的局部，或者組成整體的部分個(gè)體。

43、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“基因座”廣義上講代表基因在染色體上所占的位置，狹義上講代表某一基因上的一段dna片段，既可以是一個(gè)基因也可以是一個(gè)基因的一部分或者基因的調(diào)控區(qū)域等。例如所述的“ntrk1基因座”包括ntrk1基因外顯子1-17以及其調(diào)控區(qū)域中任選一段的dna片段。例如所述的“ngf基因座”包括ngf基因外顯子1-3以及其調(diào)控區(qū)域中任選一段的dna片段。

44、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外顯子xx的部分”表示連續(xù)或間隔幾個(gè)、幾十個(gè)或幾百個(gè)核苷酸序列與全部的外顯子核苷酸序列一致。

45、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外顯子xx至外顯子xxx”或“外顯子xx-xxx”或“外顯子xx至外顯子xxx的全部”或“外顯子xx的全部至外顯子xxx的全部”，是指包含外顯子及其期間的內(nèi)含子。

46、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外顯子x的部分至外顯子xx的部分”或“外顯子x的部分-外顯子xx的全部”包括外顯子的全部或部分及其期間的內(nèi)含子。例如“外顯子1的部分至外顯子10的全部或部分”包括外顯子1的部分、內(nèi)含子1的全部、外顯子2的全部、內(nèi)含子2的全部、外顯子3的全部、內(nèi)含子3的全部、外顯子4的全部、內(nèi)含子4的全部、外顯子5的全部、內(nèi)含子5的全部、外顯子6的全部、內(nèi)含子6的全部、外顯子7的全部、內(nèi)含子7的全部、外顯子8的全部、內(nèi)含子8的全部、外顯子9的全部、內(nèi)含子9的全部、外顯子10的全部或部分。

47、本技術(shù)術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子xx”，是指兩個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子，例如內(nèi)含子3是外顯子3和外顯子4之間的內(nèi)含子。

48、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“包含”或“包括”為開(kāi)放式寫法，含有所描述的指定成分或步驟，以及不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響的其他指定成分或步驟。當(dāng)用于描述蛋白質(zhì)或核酸的序列時(shí)，所述蛋白質(zhì)或核酸可以是由所述序列組成，或者在所述蛋白質(zhì)或核酸的一端或兩端可以具有額外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有與原序列相同或相似的活性。

49、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“和/或”包含該術(shù)語(yǔ)所連接的項(xiàng)目的所有組合，應(yīng)視為各個(gè)組合已經(jīng)單獨(dú)地在本技術(shù)列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

50、除非另有定義，本技術(shù)使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。本技術(shù)描述了用于本發(fā)明的方法和材料；可以使用本領(lǐng)域已知的其他合適的方法和材料。材料、方法和實(shí)施例僅是示例性的而非限制性的。本技術(shù)提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)條目和其他參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用整體并入。在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。

51、本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從下文的詳細(xì)描述中容易地洞察到本技術(shù)的其它方面和優(yōu)勢(shì)。

52、ntrk1

53、在人的基因組中，ntrk1基因(ncbi?gene?id：4914，uniprot?id：p04629，位于1號(hào)染色體nc_000001.11的第156815750至156881850位)包含17個(gè)外顯子，即外顯子1至外顯子17?；谵D(zhuǎn)錄本nm_002529.4及其編碼蛋白np_002520.2(seq?id?no：2)的核苷酸序列和氨基酸序列對(duì)應(yīng)位置如表1所示。

54、表1

55、

56、在小鼠的基因組中，ntrk1基因(ncbi?gene?id：18211，uniprot?id：q3ufb7，位于3號(hào)染色體nc_000069.7的第87685551至87702549位)包含17個(gè)外顯子，即外顯子1至外顯子17。基于轉(zhuǎn)錄本nm_001033124.1及其編碼蛋白np_001028296.1(seq?id?no：1)的核苷酸序列和氨基酸序列對(duì)應(yīng)位置如表2所示。

57、表2

58、

59、

60、ngf

61、在人的基因組中，ngf基因(ncbi?gene?id：4803，uniprot?id：p01138，位于1號(hào)染色體nc_000001.11的第115285917至115338249位)包含3個(gè)外顯子，即外顯子1、外顯子2和外顯子3?；谵D(zhuǎn)錄本nm_002506.3及其編碼蛋白np_002497.2(seq?id?no：13)的核苷酸序列和氨基酸序列中每個(gè)外顯子對(duì)應(yīng)位置如表3所示。

62、表3

63、

64、在小鼠的基因組中，ngf基因(ncbi?gene?id：18049，uniprot?id：p01139，位于3號(hào)染色體nc_000069.7的第102377235至102428329位)包含3個(gè)外顯子，即外顯子1、外顯子2和外顯子3?；谵D(zhuǎn)錄本nm_001112698.2及其編碼蛋白np_001106168.1(seq?id?no：12)的核苷酸序列和氨基酸序列中每個(gè)外顯子對(duì)應(yīng)位置如表4所示。

65、表4

66、

67、

68、本領(lǐng)域中其他物種的ntrk1和ngf基因、蛋白和基因位點(diǎn)也是已知的。例如，rattusnorvegicus(大鼠)、macaca?mulatta(恒河猴)、canis?lupus?familiaris(狗)和susscrofa(豬)，這些基因的相關(guān)信息(如，內(nèi)含子序列、外顯子序列和氨基酸序列)均可以在ncbi中查找到，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本技術(shù)。

69、為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較的目的對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)(例如，為了最佳比對(duì)，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)中引入間隙，并且為了比較的目的可以忽略非同源序列)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械囊粋€(gè)位置被與第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，考慮到間隙的數(shù)量和每個(gè)間隙的長(zhǎng)度，這需要引入以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。例如，序列的比較和兩個(gè)序列之間的同一性百分比的確定可以使用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的blossum?62評(píng)分矩陣來(lái)完成。

70、具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的保守殘基的百分比(同源性百分比)，例如亮氨酸和異亮氨酸，也可用于測(cè)量序列相似性。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有類似物理化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)的氨基酸，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨質(zhì)、組氨酸)。在許多情況下，同源性百分比高于同一性百分比。

71、載體

72、本發(fā)明提供了一種靶向載體，包括：a)與待改變區(qū)域的5’端同源的dna片段(5’臂或5’同源臂)，其選自ntrk1或ngf基因的基因組dna，長(zhǎng)度為100至10000個(gè)核苷酸；b)供體區(qū)域；和c)與待改變區(qū)域的3’端同源的dna片段(3’臂或3’同源臂)，其選自ntrk1或ngf基因的基因組dna，長(zhǎng)度為100至10000個(gè)核苷酸。

73、在一些實(shí)施例中，a)與待改變區(qū)域的5’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號(hào)為nc_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸序列；c)與待改變區(qū)域3’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號(hào)為nc_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸序列。

74、在一些實(shí)施例中，靶向載體所選的基因組核苷酸序列長(zhǎng)度可以超過(guò)約0.8kb、1kb、

75、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、6.5kb、7kb、7.5kb、8kb、8.5kb、9kb、9.5kb、10kb、15kb、16kb、18kb、19kb或20kb。

76、在一些實(shí)施例中，所述待改變區(qū)域位于非人動(dòng)物ntrk1基因上。在一些實(shí)施例中，所述待改變區(qū)域位于非人動(dòng)物ntrk1基因的外顯子1至外顯子10上。

77、在一些實(shí)施例中，所述待改變區(qū)域位于非人動(dòng)物ngf基因上。在一些實(shí)施例中，所述待改變區(qū)域位于非人動(dòng)物ngf基因的外顯子3上。

78、在一些實(shí)施例中，所述5’臂序列包含seq?id?no：3所示核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述3’臂序列包含seq?id?no：4所示核苷酸序列。

79、在一些實(shí)施例中，所述5’臂序列包含seq?id?no：14所示核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述3’臂序列包含seq?id?no：15所示核苷酸序列。

80、在一些實(shí)施例中，所述5’臂序列包含seq?id?no：24所示核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述3’臂序列包含seq?id?no：25所示核苷酸序列。

81、在一些實(shí)施例中，所述靶向載體包含人序列(例如，nc_000001.11的第156861037至156874590位)。例如，靶向載體中的供體區(qū)域包括編碼人ntrk1胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列。優(yōu)選人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子10的部分。優(yōu)選人ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子11的部分。在一些實(shí)施例中，靶向載體中的供體區(qū)域包括seq?id?no：5。

82、在一些實(shí)施例中，所述靶向載體包含人序列(例如，nc_000001.11的第115286070至115286795位至少99％一致性)。例如，靶向載體中的供體區(qū)域包括編碼人ngf蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選人ngf基因的外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，靶向載體中的供體區(qū)域包括seq?id?no：16。

83、在一些實(shí)施例中，所述靶向載體還包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因(或抗性基因)。例如，陽(yáng)性篩選標(biāo)記基因或陰性篩選標(biāo)記基因。在一些實(shí)施例中，陽(yáng)性克隆篩選的抗性基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶編碼序列neo或潮霉素抗性基因序列hygr。優(yōu)選的，所述的靶向載體中還包括標(biāo)記基因兩側(cè)的兩個(gè)同向排列的frt重組位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，負(fù)篩選標(biāo)記的編碼基因?yàn)榘缀矶舅豠亞基的編碼基因(dta)。

84、本發(fā)明還提供了用于構(gòu)建人源化動(dòng)物模型或敲除模型的載體。在一些實(shí)施例中，載體包含sgrna序列，其中sgrna序列靶向ngf基因，并且sgrna在待改變基因的靶序列上是唯一的，并且滿足5'-nnn(20)-ngg3'或5'-ccn-n(20)-3'的序列排列規(guī)則。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf基因中sgrna的靶向位點(diǎn)位于外顯子3。

85、在一些實(shí)施例中，靶向序列顯示為seq?id?no：31和/或32。因此，本發(fā)明提供了用于構(gòu)建基因修飾的動(dòng)物模型的sgrna序列。在一些實(shí)施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?idno：33和35中列出。在一些實(shí)施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?id?no：34和36中列出。在一些實(shí)施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?id?no：37和39中列出。

86、在一些實(shí)施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?id?no：38和40中列出。

87、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)涉及包括sgrna序列的質(zhì)粒構(gòu)建體(例如pt7-sgrna)和/或包括該構(gòu)建體的細(xì)胞。

88、本發(fā)明還涉及包含如上所述的靶向載體或sgrna載體的細(xì)胞。

89、此外，本發(fā)明還提供了一種非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其具有上述靶向載體中的任何一種，以及本技術(shù)所述構(gòu)建體的一種或多種體外轉(zhuǎn)錄物。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞包含cas9mrna或其體外轉(zhuǎn)錄物。

90、在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞中基因是雜合的。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞中的基因是純合的。

91、在一些實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞是受精卵細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。

92、基因修飾的非人動(dòng)物

93、本發(fā)明所述“基因修飾的非人動(dòng)物”是指該非人動(dòng)物基因組中至少一條染色體具有外源dna的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，例如，基因修飾的非人動(dòng)物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的細(xì)胞具有外源dna。具有外源性dna的細(xì)胞可以是各種細(xì)胞，例如，體細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)、生殖細(xì)胞、囊胚或腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物，所述非人動(dòng)物包含被修飾的內(nèi)源ntrk1或ngf基因座，包含外源序列(如，人源序列)，例如，用一個(gè)或多個(gè)人源序列替換一個(gè)或多個(gè)非人序列，或插入一個(gè)或多個(gè)人源和/或非人序列。非人動(dòng)物通常能夠通過(guò)種系傳播將基因修飾傳遞給后代。

94、本發(fā)明所述“嵌合(x)基因”或“嵌合(x)核酸”是指基因或核酸，其中所述基因或核酸的兩個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自不同物種，或者該基因或核酸的至少一個(gè)序列與野生型動(dòng)物中的核酸不同。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸具有至少一部分序列具有兩個(gè)或多個(gè)不同的物種來(lái)源，例如，編碼不同蛋白的序列或編碼兩個(gè)或多個(gè)不同物種的相同(或同源)蛋白的序列。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是指人源化(x)基因或人源化(x)核酸。

95、本發(fā)明所述“嵌合(x)蛋白”或“嵌合(x)多肽”是指蛋白或多肽，其中所述多肽或蛋白的兩個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自不同物種，或者該蛋白或多肽的至少一個(gè)序列與野生型動(dòng)物中的氨基酸序列不同。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽的至少一部分序列具有兩個(gè)或多個(gè)不同物種來(lái)源，例如，不同物種的相同(或同源)蛋白。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是指人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽。

96、本發(fā)明所述“人源化(x)蛋白”或“人源化(x)多肽”是指蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽的至少一部分來(lái)自人蛋白或人多肽。在一些實(shí)施例中，人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽是指人蛋白或多肽。

97、本發(fā)明所述“人源化(x)核酸”是指核酸，其中所述核酸的至少一部分來(lái)自人。在一些實(shí)施例中，人源化(x)核酸中的核酸全部來(lái)源于人。在一些實(shí)施例中，人源化(x)核酸是指人源化外顯子，所述人源化外顯子可以是人的外顯子或嵌合外顯子。

98、在一些實(shí)施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是人源化ntrk1基因或人源化ntrk1核酸。在一些實(shí)施例中，所述基因或核酸的至少一部分來(lái)源于人ntrk1基因，所述基因或核酸的至少一部分來(lái)源于非人ntrk1基因。在一些實(shí)施例中，所述基因或核酸包含編碼ntrk1蛋白的序列。編碼的ntrk1蛋白至少具有一種人ntrk1蛋白或非人動(dòng)物ntrk1蛋白的活性。

99、在一些實(shí)施例中，所述嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是人源化ntrk1蛋白或人源化ntrk1多肽。在一些實(shí)施例中，所述蛋白或多肽氨基酸序列的至少一個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自人ntrk1蛋白，并且，所述蛋白或者多肽氨基酸序列的至少一個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自非人動(dòng)物ntrk1蛋白。人源化ntrk1蛋白或人源化ntrk1多肽是功能性的，或至少具有一種人ntrk1蛋白或非人動(dòng)物ntrk1蛋白的活性。

100、在一些實(shí)施例中，ntrk1胞外區(qū)是人或人源化的。在一些實(shí)施例中，ntrk1信號(hào)肽是人或人源化的。在一些實(shí)施例中，ntrk1胞質(zhì)區(qū)是人或人源化的。在一些實(shí)施例中，ntrk1跨膜區(qū)是人的或人源化的。

101、基因修飾的非人動(dòng)物包括內(nèi)源非人動(dòng)物ntrk1基因位點(diǎn)的修飾。在一些實(shí)施例中，所述修飾包含編碼至少一部分成熟ntrk1蛋白的核苷酸序列(例如，與成熟的ntrk1蛋白氨基酸序列至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性)。雖然在本發(fā)明中提供了可包含本技術(shù)所述基因修飾的細(xì)胞(例如，es細(xì)胞、體細(xì)胞)，但在許多實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物包括對(duì)非人動(dòng)物中內(nèi)源ntrk1基因位點(diǎn)的修飾。

102、基因修飾的非人動(dòng)物可以在內(nèi)源性非人動(dòng)物(例如小鼠)基因座表達(dá)人ntrk1和/或嵌合(例如人源化)ntrk1，其中所述內(nèi)源性非人動(dòng)物(例如小鼠)ntrk1基因已被人ntrk1的基因和/或編碼人ntrk1序列區(qū)域的核苷酸序列或與人ntrk1序列至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列取代或插入。在一些實(shí)施例中，內(nèi)源性非人動(dòng)物ntrk1基因座被包含編碼成熟ntrk1蛋白的人全部或部分核酸序列修飾。

103、在一些實(shí)施例中，經(jīng)基因修飾的非人動(dòng)物(例如小鼠)可以在非人動(dòng)物(例如小鼠)啟動(dòng)子和/或非人動(dòng)物(例如小鼠)調(diào)控元件的控制下，表達(dá)人ntrk1和/或嵌合ntrk1(例如，人源化ntrk1)。在非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源性基因座處進(jìn)行插入或替換提供了在合適的細(xì)胞中表達(dá)人ntrk1或嵌合ntrk1(例如人源化ntrk1)并且以不導(dǎo)致在本領(lǐng)域已知的一些其它轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如小鼠)中觀察到的潛在病理的方式的非人動(dòng)物。在非人動(dòng)物中表達(dá)的人ntrk1或嵌合ntrk1(例如人源化ntrk1)可以在非人動(dòng)物中維持野生型非人動(dòng)物(例如小鼠)或人ntrk1的一種或多種功能。此外，在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物不表達(dá)內(nèi)源性ntrk1。在一些實(shí)施例中，與野生型動(dòng)物中的ntrk1表達(dá)水平相比，非人動(dòng)物內(nèi)源性ntrk1表達(dá)水平降低。如本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性ntrk1”是指在任何基因修飾之前由非人動(dòng)物(例如小鼠)的內(nèi)源性ntrk1核苷酸序列表達(dá)的ntrk1蛋白。

104、基因修飾的非人動(dòng)物可以具有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)人或嵌合ntrk1(例如人源化ntrk1)的細(xì)胞，所述細(xì)胞從n末端到c末端具有信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。在許多情況下，人ntrk1和非人ntrk1(例如，小鼠ntrk1)序列是不同的，所以與人ntrk1結(jié)合的抗體不一定與非人ntrk1具有相同的親和力或?qū)Ψ侨薾trk1具有相同的作用。因此，具有人或人源化胞外區(qū)的基因修飾的非人動(dòng)物可以用于更好地評(píng)估抗人ntrk1抗體在動(dòng)物模型中的作用。

105、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的人源化ntrk1的整個(gè)信號(hào)肽，整個(gè)跨膜區(qū)和整個(gè)胞質(zhì)區(qū)都來(lái)源于內(nèi)源ntrk1序列。

106、在一些實(shí)施例中，人源化ntrk1基因座包含人的5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化ntrk1基因座包含內(nèi)源性(例如小鼠)5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化ntrk1基因座包含人的3’utr。在一些實(shí)施例中，人源化ntrk1基因座包含內(nèi)源性(例如小鼠)

107、3’utr。在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以合理地假設(shè)，基于小鼠和人ntrk1基因5’側(cè)翼序列的相似性，它們似乎受到類似的調(diào)節(jié)。如本技術(shù)所示，在內(nèi)源性小鼠ntrk1基因座包含插入或替換的人源化ntrk1小鼠，其保留小鼠調(diào)控元件但包含ntrk1編碼序列的人源化，不表現(xiàn)出病理現(xiàn)象。人源化ntrk1雜合或純合的兩種基因修飾小鼠都是正常的。

108、在一些實(shí)施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是人源化ngf基因或人源化ngf核酸。在一些實(shí)施例中，所述基因或核酸的至少一部分來(lái)源于人ngf基因，所述基因或核酸的至少一部分來(lái)源于非人ngf基因。在一些實(shí)施例中，所述基因或核酸包含編碼ngf蛋白的序列。編碼的ngf蛋白至少具有一種人ngf蛋白或非人動(dòng)物ngf蛋白的活性。

109、在一些實(shí)施例中，所述嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是人源化ngf蛋白或人源化ngf多肽。在一些實(shí)施例中，所述蛋白或多肽氨基酸序列的至少一個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自人ngf蛋白，并且，所述蛋白或者多肽氨基酸序列的至少一個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自非人動(dòng)物ngf蛋白。人源化ngf蛋白或人源化ngf多肽是功能性的，或至少具有一種人ngf蛋白或非人動(dòng)物ngf蛋白的活性。

110、基因修飾的非人動(dòng)物可以是各種動(dòng)物，例如，小鼠、大鼠、兔子、豬、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)。對(duì)于不容易獲得合適的可遺傳修飾胚胎干細(xì)胞(es)的非人動(dòng)物，采用其他方法來(lái)構(gòu)建包含遺傳修飾的非人動(dòng)物。這樣的方法包括，例如，修飾非es細(xì)胞基因組(例如，成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)并采用核移植將修飾的基因組轉(zhuǎn)移到合適的細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞，以及在適當(dāng)?shù)臈l件下在非人動(dòng)物中孕育修飾的細(xì)胞(例如，修飾的卵母細(xì)胞)以形成胚胎。上述所述構(gòu)建方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且在“a.nagy,et?al.,

111、“manipulating?the?mouse?embryo:a?laboratory?manual(third?edition),”cold?spring?harbor?laboratory?press,2006”有所描述，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本技術(shù)。

112、在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。嚙齒動(dòng)物可以選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。在一些實(shí)施例中，所述嚙齒動(dòng)物選自鼠家族。在一些實(shí)施例中，所述基因修飾的動(dòng)物選自麗倉(cāng)鼠科(例如小鼠樣倉(cāng)鼠)、倉(cāng)鼠科(例如倉(cāng)鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠總科(小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、馬島鼠科(登山小鼠、巖小鼠、有尾大鼠、馬達(dá)加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼴形鼠科(例如摩爾大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一些實(shí)施例中，所述基因修飾的嚙齒動(dòng)物選自小鼠或大鼠(鼠總科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一些實(shí)施例中，所述基因修飾的小鼠來(lái)自鼠科家族成員。在一些實(shí)施例中，所述動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是小鼠。

113、在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物可以是免疫缺陷的非人哺乳動(dòng)物。例如免疫缺陷的嚙齒動(dòng)物、免疫缺陷的兔子、免疫缺陷的豬、免疫缺陷的猴子等。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是c57bl品系的小鼠，所述c57bl品系選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl6、c57bl/10、c57bl10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些實(shí)施例中，小鼠是選自129/j、129/rej、129/olahsd、129/sv、129/svj、129/re、129/rrj、129/sv-ter/+的129品系。這些小鼠描述于例如festing?et?al.,revised?nomenclature?for?strain129mice,mammalian?genome?10:836(1999)；auerbach?et?al.,establishment?and?chimeraanalysis?of?129/svev-and?c57bl/6-derived?mouse?embryonic?stem?cell?lines(2000)，上述文獻(xiàn)相關(guān)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本技術(shù)。在一些實(shí)施例中，遺傳修飾的小鼠是129品系和c57bl/6品系的雜交。在一些實(shí)施例中，小鼠是129品系的雜交，或c57bl/6品系的雜交。在一些實(shí)施例中，小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在一些實(shí)施例中，小鼠是balb品系和另一品系的雜交。在一些實(shí)施例中，小鼠來(lái)自雜交系(例如，50％?balb/c-50％12954/sv；或50％?c57bl/6-50％129)。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物是具有balb/c、balb/chean、balb/cj、balb/crl、balb/cwt、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl(c57bl/10cr和c57bl/ola)、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st或cba/h品系的小鼠在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物是大鼠。大鼠可以選自wistar大鼠、lea品系、sprague-dawley品系、fischer品系、f344、f6和dark?agouti。在一些實(shí)施例中，大鼠品系是選自wistar、lea、sprague-dawley、fischer、f344、f6和dark?agouti的兩種或多種品系的雜交物種。

114、非人動(dòng)物可以具有一個(gè)或多個(gè)其他基因修飾和/或其他修飾，其適合于制備人源化動(dòng)物的特定目的。例如，用于維持異種移植物(例如人類癌癥或腫瘤)的合適非人動(dòng)物(例如小鼠)可以有一個(gè)或多個(gè)修飾，這些修飾會(huì)損害、滅活或破壞非人動(dòng)物的全部或部分免疫系統(tǒng)。非人動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的損害、失活或破壞可以包括例如通過(guò)化學(xué)手段(例如施用毒素)、物理手段(例如照射動(dòng)物)，和/或基因修飾(例如敲除一個(gè)或多個(gè)基因)。這類小鼠的非限制性實(shí)例包括，例如，nod小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠，il2rγ敲除小鼠，nod/scid/γcnull小鼠(ito,m.et?al.,nod/scid/γcnull?mouse:an?excellent?recipient?mousemodel?for?engraftment?of?human?cells,blood?100(9):3175-3182,2002)，裸鼠，以及rag1和/或rag2敲除小鼠。這些小鼠可以任選地被照射，或以其他方式被處理以破壞一種或多種免疫細(xì)胞類型。因此，在各種實(shí)施例中，提供了一種基因修飾小鼠，其可以包括至少一部分內(nèi)源性非人基因座的人源化，并且還包括損害、失活或部分破壞非人動(dòng)物的免疫系統(tǒng)(或免疫系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞類型)的修飾。在一些實(shí)施例中，小鼠修飾類型選自nod小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠，il-2rγ敲除小鼠、nod/scid/γcnull小鼠、裸鼠、rag1和/或rag2敲除小鼠，nod?prkdcscid?il-2rγnull小鼠、nod?rag?1-/-il2rg-/-

115、(nrg)小鼠、rag2-/-il2rg-/-(rg)小鼠及其組合的修飾。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被描述在例如us10820580b2中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本技術(shù)。在一些實(shí)施例中，小鼠可以包括分別用人成熟ntrk1編碼序列的全部或部分替換小鼠內(nèi)源成熟的ntrk1編碼序列的全部或部分。

116、本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)上述方法產(chǎn)生的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，其基因組包含人的基因。

117、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選地，非人哺乳動(dòng)物為小鼠。

118、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物表達(dá)由人源化ntrk1基因編碼的蛋白。

119、此外，本發(fā)明還提供了一種攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物模型，所述非人哺乳動(dòng)物模型是通過(guò)本技術(shù)所述方法獲得的。在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物(如，小鼠)。

120、本發(fā)明還提供了一種來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞系，或原代細(xì)胞培養(yǎng)物，其來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物、來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的組織、器官或其培養(yǎng)物。當(dāng)其攜帶腫瘤時(shí)來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的腫瘤組織或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物。

121、本發(fā)明提供了一種通過(guò)本技術(shù)描述的任一方法產(chǎn)生的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，提供了非人哺乳動(dòng)物、基因修飾的非人動(dòng)物，所述基因修飾的非人動(dòng)物基因組包含人或人源化ntrk1的dna。

122、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物包括本技術(shù)所述基因構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中，提供了一種表達(dá)人或人源化ntrk1蛋白的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，提供了一種特異性表達(dá)人或人源化ntrk1蛋白的組織。

123、在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物人或人源化ntrk1蛋白的表達(dá)是可控的。如通過(guò)添加特異性誘導(dǎo)物或阻遏物。在一些實(shí)施例中，所述特異性誘導(dǎo)物選自四環(huán)素系統(tǒng)(tet-offsystem/tet-on?system)或他莫昔芬系統(tǒng)(tamoxifen?system)。

124、基因修飾的非人動(dòng)物包括內(nèi)源非人動(dòng)物ngf基因位點(diǎn)的修飾。在一些實(shí)施例中，所述修飾包含編碼至少一部分成熟ngf蛋白的核苷酸序列(例如，與成熟的ngf蛋白氨基酸序列至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性)。雖然在本發(fā)明中提供了可包含本技術(shù)所述基因修飾的細(xì)胞(例如，es細(xì)胞、體細(xì)胞)，但在許多實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物包括對(duì)非人動(dòng)物中內(nèi)源ngf基因位點(diǎn)的修飾。

125、基因修飾的非人動(dòng)物可以在非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源基因座表達(dá)人ngf和/或嵌合(例如人源化)ngf，其中所述非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源ngf基因已被人ngf的基因和/或編碼人ngf序列區(qū)域的核苷酸序列或與人ngf序列至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列取代或插入。在各種實(shí)施例中，內(nèi)源非人動(dòng)物ngf基因座被包含編碼成熟ngf蛋白的人全部或部分核酸序列修飾。

126、在一些實(shí)施例中，經(jīng)基因修飾的非人動(dòng)物(例如小鼠)可以在非人動(dòng)物(例如小鼠)啟動(dòng)子和/或非人動(dòng)物(例如小鼠)調(diào)控元件的控制下，表達(dá)人ngf和/或嵌合ngf(例如，人源化ngf)。在非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源基因座處進(jìn)行插入或替換提供了在合適的細(xì)胞中表達(dá)人ngf或嵌合ngf(例如人源化ngf)并且以不導(dǎo)致在本領(lǐng)域已知的一些其它轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如小鼠)中觀察到的潛在病理的方式的非人動(dòng)物。在非人動(dòng)物中表達(dá)的人ngf或嵌合ngf(例如人源化ngf)可以在非人動(dòng)物中維持野生型非人動(dòng)物(例如小鼠)或人ngf的一種或多種功能。此外，在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物不表達(dá)內(nèi)源ngf。在一些實(shí)施例中，與野生型動(dòng)物中的ngf表達(dá)水平相比，非人動(dòng)物內(nèi)源ngf表達(dá)水平降低。如本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源ngf”是指在任何基因修飾之前由非人動(dòng)物(例如小鼠)的內(nèi)源ngf核苷酸序列表達(dá)的ngf蛋白。

127、在一些實(shí)施例中，人源化ngf基因座包含人的5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化ngf基因座包含非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化ngf基因座包含人的3’utr。在一些實(shí)施例中，人源化ngf基因座包含非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源3’utr。在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以合理地假設(shè)，基于小鼠和人ngf基因5’側(cè)翼序列的相似性，它們似乎受到類似的調(diào)節(jié)。如本技術(shù)所示，在內(nèi)源小鼠ngf基因座包含插入或替換的人源化ngf小鼠，其保留小鼠調(diào)控元件但包含ngf編碼序列的人源化，不表現(xiàn)出病理現(xiàn)象。人源化ngf雜合或純合的兩種基因修飾小鼠都是正常的。

128、本發(fā)明進(jìn)一步涉及人源化非人動(dòng)物(例如小鼠)的ngf基因組dna序列，通過(guò)mrna逆轉(zhuǎn)錄獲得的dna序列與該dna序列一致或互補(bǔ)；表達(dá)其氨基酸序列的構(gòu)建體；包含其構(gòu)建體的細(xì)胞；包括其細(xì)胞的組織。

129、本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)上述方法產(chǎn)生的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，其基因組包含人的基因。

130、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選地，非人哺乳動(dòng)物為小鼠。

131、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物表達(dá)由人源化ngf基因編碼的蛋白。

132、此外，本發(fā)明還提供了一種攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物模型，所述非人哺乳動(dòng)物模型是通過(guò)本技術(shù)所述方法獲得的。在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物(如，小鼠)。

133、本發(fā)明還提供了一種來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞系，或原代細(xì)胞培養(yǎng)物，其來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物、來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的組織、器官或其培養(yǎng)物。當(dāng)其攜帶腫瘤時(shí)來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的腫瘤組織或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物。

134、本發(fā)明提供了一種通過(guò)本技術(shù)描述的任一方法產(chǎn)生的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，提供了非人哺乳動(dòng)物、基因修飾的非人動(dòng)物，所述基因修飾的非人動(dòng)物基因組包含人或人源化ngf的dna。

135、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物包括本技術(shù)所述基因構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中，提供了一種表達(dá)人或人源化ngf蛋白的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，提供了一種特異性表達(dá)人或人源化ngf蛋白的組織。

136、在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物人或人源化ngf蛋白的表達(dá)是可控的。如通過(guò)添加特異性誘導(dǎo)物或阻遏物。在一些實(shí)施例中，所述特異性誘導(dǎo)物選自四環(huán)素系統(tǒng)(tet-offsystem/tet-on?system)或他莫昔芬系統(tǒng)(tamoxifen?system)。非人哺乳動(dòng)物可以是本領(lǐng)域已知的任何非人動(dòng)物，其可用于本技術(shù)所述方法中。優(yōu)選的非人哺乳動(dòng)物是哺乳動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物)。在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是小鼠。

137、對(duì)上述描述的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行遺傳、分子和行為分析。本發(fā)明提供了一種與相同基因型或其他基因型非人哺乳動(dòng)物交配產(chǎn)生的后代。

138、本發(fā)明提供了一種來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。例如可以通過(guò)以下方法制備基于細(xì)胞培養(yǎng)的模型。細(xì)胞培養(yǎng)物可以通過(guò)從非人哺乳動(dòng)物中分離獲得，或者可以使用相同構(gòu)建體和用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得細(xì)胞。包含編碼人ntrk1或ngf蛋白的dna序列的遺傳結(jié)構(gòu)的整合可以通過(guò)多種方法檢測(cè)。

139、有許多分析方法可用于檢測(cè)外源性dna，包括核酸水平的方法(包含使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)或southern?blot以及原位雜交)和蛋白水平的方法(包括組織化學(xué)分析，免疫印跡分析和體外結(jié)合研究)。此外，目的基因的表達(dá)水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的elisa方法進(jìn)行量化。許多標(biāo)準(zhǔn)的分析方法可用于完成定量檢測(cè)。例如，可以使用rt-pcr和雜交方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平，包括rna酶保護(hù)分析法，southern?blot，rna斑點(diǎn)雜交分析(rnadot)。免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)、western?blot也可用于檢測(cè)人源或人源化ntrk1或ngf蛋白的存在。

140、基因修飾的非人動(dòng)物的構(gòu)建方法

141、基因修飾的非人動(dòng)物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)制備獲得，包括利用胚胎干細(xì)胞的基因打靶技術(shù)、同源重組技術(shù)、crispr/cas9技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)、歸巢核酸內(nèi)切酶或其他分子生物學(xué)技術(shù)。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選使用同源重組技術(shù)。在一些實(shí)施例中，crispr/cas9基因編輯技術(shù)可以構(gòu)建基因修飾的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，crispr-cas9基因編輯技術(shù)用于產(chǎn)生基因修飾的非人動(dòng)物。這些基因組編輯技術(shù)中的許多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且在yin等人的“delivery?technologies?forgenome?editing,”nature?reviews?drug?discovery?16.6(2017):387-399,中進(jìn)行了描述，該內(nèi)容經(jīng)引用并入本技術(shù)。本發(fā)明還提供了許多其他方法用于基因組編輯，例如，將基因修飾的細(xì)胞顯微注射到去核卵母細(xì)胞中，并將去核卵母細(xì)胞與另一個(gè)基因修飾的細(xì)胞融合。

142、在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)源基因組中編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1蛋白表達(dá)量與野生型相比降低或缺失。在一些實(shí)施例中，替換發(fā)生在生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、囊胚或成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中。體細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核可以插入去核卵母細(xì)胞中。

143、優(yōu)選的，所述的非人動(dòng)物進(jìn)一步包含其他基因修飾，更優(yōu)選的，所述其他基因包括但不限于ntrk2、ngf、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

144、優(yōu)選的，所述的人或人源化ntrk1基因和/或其他基因?qū)τ趦?nèi)源被修飾(優(yōu)選替換或插入)基因座為純合。

145、優(yōu)選的，所述的人或人源化ntrk1基因和/或其他基因?qū)τ趦?nèi)源被修飾(優(yōu)選替換或插入)基因座為雜合。

146、優(yōu)選的，所述的非人動(dòng)物可以選自嚙齒動(dòng)物、豬、兔子、猴子等任何可以進(jìn)行基因編輯制備基因人源化的非人動(dòng)物。

147、優(yōu)選的，所述的非人動(dòng)物為非人哺乳動(dòng)物。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的非人哺乳動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的嚙齒動(dòng)物為大鼠或小鼠。

148、因此，本發(fā)明提供了一種ntrk1基因人源化的非人動(dòng)物的構(gòu)建方法，所述的非人動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)人或人源化ntrk1蛋白，和/或，所述的非人動(dòng)物的基因組中包含人ntrk1基因的部分或人源化ntrk1基因。

149、在一些實(shí)施例中，修飾小鼠的ntrk1基因座以表達(dá)嵌合人/小鼠ntrk1多肽的方法可以包括用編碼人ntrk1的核苷酸序列替換內(nèi)源性小鼠ntrk1基因座處編碼小鼠ntrk1的核苷酸序列，從而產(chǎn)生編碼嵌合人/小鼠ntrk1序列。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法可以包括在內(nèi)源性小鼠ntrk1基因座處插入編碼嵌合人/小鼠ntrk1的核苷酸序列，從而產(chǎn)生編碼嵌合人/小鼠ntrk1序列。

150、本發(fā)明還提供了一種建立ntrk1基因人源化動(dòng)物模型的方法，包括以下步驟：

151、(a)基于本技術(shù)所述的方法提供細(xì)胞(例如受精卵細(xì)胞)；

152、(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞，優(yōu)選在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞；

153、(c)將培養(yǎng)的細(xì)胞移植到受體雌性非人哺乳動(dòng)物的輸卵管或子宮，允許細(xì)胞在雌性非人哺乳類動(dòng)物的子宮中發(fā)育；

154、(d)在步驟(c)中鑒定懷孕雌性的經(jīng)基因修飾的人源化非人哺乳動(dòng)物的后代中的種系傳播。

155、在一些實(shí)施例中，上述方法中的非人哺乳動(dòng)物是小鼠(例如c57bl/6小鼠)。

156、在一些實(shí)施例中，步驟(c)中的非人哺乳動(dòng)物是具有假妊娠或妊娠的雌性。

157、在一些實(shí)施例中，用于上述方法的受精卵是c57bl/6受精卵。也可用于本技術(shù)所述方法的其他受精卵包括但不限于fvb/n受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵和dba/2受精卵。

158、受精卵可以來(lái)自任何非人動(dòng)物，例如本技術(shù)所述的任何非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，受精卵細(xì)胞來(lái)源于嚙齒動(dòng)物?；驑?gòu)建體可以通過(guò)顯微注射將dna導(dǎo)入受精卵。例如，通過(guò)在顯微注射后培養(yǎng)受精卵，可以將培養(yǎng)的受精卵轉(zhuǎn)移到假孕的非人動(dòng)物身上，然后假孕的非人動(dòng)物生下非人哺乳動(dòng)物，從而產(chǎn)生上述方法中提到的非人哺乳動(dòng)物。

159、在一些實(shí)施例中，制備經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的方法包括修飾非人動(dòng)物的ntrk1基因的編碼框架，例如，通過(guò)在非人動(dòng)物的ntrk1基因內(nèi)源調(diào)控元件控制下，用編碼人ntrk1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源ntrk1區(qū)域的核酸序列(例如，cds、基因組dna或cdna序列)。例如，非人動(dòng)物的ntrk1基因的一個(gè)或多個(gè)功能區(qū)序列可以被敲除或插入序列，使得非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1蛋白不能表達(dá)或表達(dá)水平降低。

160、在一些實(shí)施例中，制備遺傳修飾的非人動(dòng)物的方法包括在非人動(dòng)物的ntrk1基因的內(nèi)源調(diào)控元件之后插入編碼人或人源化ntrk1蛋白的核苷酸序列和/或輔助序列。在一些實(shí)施方案中，輔助序列可以是終止密碼子，使得ntrk1基因人源化動(dòng)物模型可以在體內(nèi)表達(dá)人或人源化ntrk1蛋白，但不表達(dá)非人動(dòng)物的ntrk1蛋白。在一些實(shí)施例中，輔助序列包括wpre(whp轉(zhuǎn)錄后反應(yīng)元件)、loxp、stop和/或polya。

161、在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括使用上述載體獲得。在一些實(shí)施例中，所述載體為靶向載體和/或sgrna載體。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括將靶向載體導(dǎo)入非人動(dòng)物或其細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括將靶向載體和sgrna載體導(dǎo)入非人動(dòng)物或其細(xì)胞。

162、在一些實(shí)施例中，用于制備基因修飾非人動(dòng)物的方法包括：

163、(1)提供包含人ntrk1基因片段的質(zhì)粒(例如所述靶向載體)，所述質(zhì)粒側(cè)翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向內(nèi)源ntrk1；

164、(2)提供一種或多種靶向內(nèi)源ntrk1基因的指導(dǎo)rna(sgrna)；

165、(3)通過(guò)使用步驟(1)的質(zhì)粒、步驟(2)的sgrna和cas9來(lái)修飾受精卵或胚胎干細(xì)胞的基因組；

166、(4)將步驟(3)中獲得的受精卵移植到假妊娠或妊娠雌性非人動(dòng)物(例如小鼠)的輸卵管中，或者將步驟(3)中獲得地胚胎干細(xì)胞移植到囊胚中，然后將囊胚移植到假孕雌性非人動(dòng)物(例如小鼠)的輸卵管中以產(chǎn)生功能性表達(dá)人源化ntrk1蛋白的子代非人動(dòng)物(例如小鼠)；

167、(5)將步驟(4)中獲得的子代非人動(dòng)物(例如小鼠)交配以獲得純合非人動(dòng)物(例如小鼠)。

168、在一些實(shí)施例中，受精卵被crispr用靶向5’-末端靶向位點(diǎn)和3’-末端靶向位點(diǎn)的sgrna修飾。

169、在一些實(shí)施例中，編碼人源化ntrk1蛋白的序列與內(nèi)源ntrk1基因座處的內(nèi)源調(diào)控元件可操作地連接。

170、在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)內(nèi)源ntrk1蛋白。

171、在一些實(shí)施例中，用于制備基因修飾非人動(dòng)物的方法包括：

172、(1)提供包含人或嵌合ntrk1基因片段的質(zhì)粒(例如所述靶向載體)，所述質(zhì)粒側(cè)翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向內(nèi)源ntrk1；

173、(2)提供一種或多種靶向內(nèi)源ntrk1基因的指導(dǎo)rna(sgrna)；

174、(3)通過(guò)將所述人或嵌合ntrk1基因片段插入到所述基因組中來(lái)修飾受精卵或胚胎干細(xì)胞的基因組。

175、在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ntrk1蛋白的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ntrk1的胞外區(qū)的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ntrk1基因的外顯子1的部分至外顯子10的全部或部分缺失。

176、在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)源基因組中編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列被編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ngf蛋白表達(dá)量與野生型相比降低或缺失。在一些實(shí)施例中，替換發(fā)生在生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、囊胚或成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中。體細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核可以插入去核卵母細(xì)胞中。

177、優(yōu)選的，所述的非人動(dòng)物進(jìn)一步包含其他基因修飾，更優(yōu)選的，所述其他基因包括但不限于ntrk2、ntrk1、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

178、為了實(shí)現(xiàn)非人動(dòng)物(例如小鼠)ngf基因座的人源化打靶策略。靶向載體包含5’同源臂、人或人源化ngf基因片段和3’同源臂組成的載體。該過(guò)程涉及利用同源重組將人或人源化ngf序列替換內(nèi)源相應(yīng)ngf序列。在一些實(shí)施例中，靶位點(diǎn)上游和下游的切割(例如，通過(guò)鋅指核酸酶、talen或crispr)可導(dǎo)致dna雙鏈斷裂，利用同源重組將人或人源化ngf序列替換非人動(dòng)物(例如小鼠)內(nèi)源ngf序列。

179、因此，在一些實(shí)施例中，制備基因修飾的人源化非人動(dòng)物的方法包括在內(nèi)源ngf基因座(或位點(diǎn))用編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核苷酸序列。

180、本發(fā)明還提供了一種建立ngf基因人源化動(dòng)物模型的方法，包括以下步驟：

181、(a)基于本技術(shù)所述的方法提供細(xì)胞(例如受精卵細(xì)胞)；

182、(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞，優(yōu)選在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞；

183、(c)將培養(yǎng)的細(xì)胞移植到受體雌性非人哺乳動(dòng)物的輸卵管或子宮，允許細(xì)胞在雌性非人哺乳類動(dòng)物的子宮中發(fā)育；

184、(d)在步驟(c)中鑒定懷孕雌性的經(jīng)基因修飾的人源化非人哺乳動(dòng)物的后代中的種系傳播。

185、在一些實(shí)施例中，上述方法中的非人哺乳動(dòng)物是小鼠(例如c57bl/6小鼠)。

186、在一些實(shí)施例中，步驟(c)中的非人哺乳動(dòng)物是具有假妊娠或妊娠的雌性。

187、在一些實(shí)施例中，用于上述方法的受精卵是c57bl/6受精卵。也可用于本技術(shù)所述方法的其他受精卵包括但不限于fvb/n受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵和dba/2受精卵。

188、受精卵可以來(lái)自任何非人動(dòng)物，例如本技術(shù)所述的任何非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，受精卵細(xì)胞來(lái)源于嚙齒動(dòng)物。基因構(gòu)建體可以通過(guò)顯微注射將dna導(dǎo)入受精卵。例如，通過(guò)在顯微注射后培養(yǎng)受精卵，可以將培養(yǎng)的受精卵轉(zhuǎn)移到假孕的非人動(dòng)物身上，然后假孕的非人動(dòng)物生下非人哺乳動(dòng)物，從而產(chǎn)生上述方法中提到的非人哺乳動(dòng)物。

189、在一些實(shí)施例中，制備經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的方法包括修飾非人動(dòng)物的ngf基因的編碼框架，例如，通過(guò)在非人動(dòng)物的ngf基因內(nèi)源調(diào)控元件控制下，用編碼人ngf相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換編碼內(nèi)源ngf區(qū)域的核酸序列(例如，dna或cdna序列)。例如，非人動(dòng)物的ngf基因的一個(gè)或多個(gè)功能區(qū)序列可以被敲除或插入序列，使得非人動(dòng)物內(nèi)源ngf蛋白不能表達(dá)或表達(dá)水平降低。

190、在一些實(shí)施例中，制備遺傳修飾的動(dòng)物的方法包括在非人動(dòng)物的ngf基因的內(nèi)源調(diào)控元件之后插入編碼人或人源化ngf蛋白的核苷酸序列和/或輔助序列。在一些實(shí)施方案中，輔助序列可以是終止密碼子，使得ngf基因人源化動(dòng)物模型可以在體內(nèi)表達(dá)人或人源化ngf蛋白，但不表達(dá)非人動(dòng)物的ngf蛋白。在一些實(shí)施例中，輔助序列包括wpre(whp轉(zhuǎn)錄后反應(yīng)元件)、loxp、stop和/或polya。

191、在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括使用上述載體獲得。在一些實(shí)施例中，所述載體為靶向載體和/或sgrna載體。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括將靶向載體導(dǎo)入非人動(dòng)物或其細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述構(gòu)建方法包括將靶向載體和sgrna載體導(dǎo)入非人動(dòng)物或其細(xì)胞。

192、在一些實(shí)施例中，用于制備基因修飾非人動(dòng)物的方法包括：

193、(1)提供包含人ngf基因片段的質(zhì)粒(例如所述靶向載體)，所述質(zhì)粒側(cè)翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向內(nèi)源ngf；

194、(2)提供一種或多種靶向內(nèi)源ngf基因的指導(dǎo)rna(sgrna)；

195、(3)通過(guò)使用步驟(1)的質(zhì)粒、步驟(2)的sgrna和cas9來(lái)修飾受精卵或胚胎干細(xì)胞的基因組；

196、(4)將步驟(3)中獲得的受精卵移植到假妊娠或妊娠雌性非人動(dòng)物(例如小鼠)的輸卵管中，或者將步驟(3)中獲得地胚胎干細(xì)胞移植到囊胚中，然后將囊胚移植到假孕雌性非人動(dòng)物(例如小鼠)的輸卵管中以產(chǎn)生功能性表達(dá)人源化ngf蛋白的子代非人動(dòng)物(例如小鼠)；

197、(5)將步驟(4)中獲得的子代非人動(dòng)物(例如小鼠)交配以獲得純合非人動(dòng)物(例如小鼠)。

198、在一些實(shí)施例中，受精卵被crispr用靶向5’-末端靶向位點(diǎn)和3’-末端靶向位點(diǎn)的sgrna修飾。

199、在一些實(shí)施例中，編碼人源化ngf蛋白的序列與內(nèi)源ngf基因座處的內(nèi)源調(diào)控元件可操作地連接。

200、在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物不表達(dá)內(nèi)源ngf蛋白。

201、在一些實(shí)施例中，用于制備基因修飾非人動(dòng)物的方法包括：

202、(1)提供包含人或嵌合ngf基因片段的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒側(cè)翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向內(nèi)源ngf；

203、(2)提供一種或多種靶向內(nèi)源ngf基因的指導(dǎo)rna(sgrna)；

204、(3)通過(guò)將所述人或嵌合ngf基因片段插入到所述基因組中來(lái)修飾受精卵或胚胎干細(xì)胞的基因組。

205、在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源編碼ngf蛋白的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因的外顯子3的部分缺失。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源ngf基因的起始密碼子至終止密碼子缺失。

206、基因修飾的非人動(dòng)物的應(yīng)用

207、在內(nèi)源非人動(dòng)物基因座并在內(nèi)源啟動(dòng)子和/或調(diào)控元件的控制下，用同源或直系同源人類基因或人類序列替換非人動(dòng)物基因或?qū)⑼椿蛑毕低慈祟惢蚧蛉诵蛄胁迦敕侨藙?dòng)物中，可以產(chǎn)生具有可能與典型的敲除加轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯著不同的品質(zhì)和特征的非人動(dòng)物。在典型的敲除加轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，內(nèi)源基因座被移除或破壞，全人轉(zhuǎn)基因被插入動(dòng)物的基因組中，并可能隨機(jī)整合到基因組中。通常，整合轉(zhuǎn)基因的位置是未知的；通過(guò)人基因和/或蛋白質(zhì)測(cè)定和/或功能測(cè)定的轉(zhuǎn)錄來(lái)測(cè)量人類蛋白質(zhì)的表達(dá)。在人轉(zhuǎn)基因中，人序列的上游和/或下游為轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或調(diào)節(jié)提供合適的支持。

208、表達(dá)人或人源化ntrk1和/或ngf蛋白的基因修飾動(dòng)物，例如，以生理學(xué)上合適的方式，提供了多種用途，包括但不限于開(kāi)發(fā)人類疾病和病癥的治療方法，以及評(píng)估這些人類治療方法在動(dòng)物模型中的毒性和/或功效。

209、本發(fā)明還提供了一種上述ntrk1基因修飾的非人動(dòng)物、上述任一構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物的應(yīng)用。

210、在一些實(shí)施例中，所述應(yīng)用包含：

211、a)涉及人類細(xì)胞的與ntrk1和/或ngf相關(guān)的免疫過(guò)程的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用；

212、b)作為藥理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的與ntrk1和/或ngf相關(guān)的模型系統(tǒng)中的應(yīng)用；

213、c)涉及生產(chǎn)和利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)疾病模型用于與ntrk1和/或ngf相關(guān)的病原學(xué)研究和/或用于開(kāi)發(fā)診斷策略和/或用于開(kāi)發(fā)治療策略中的應(yīng)用；

214、d)在體內(nèi)研究人ntrk1和/或ngf信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑的篩選、藥效檢測(cè)、評(píng)估療效、驗(yàn)證或評(píng)價(jià)中的應(yīng)用；或者，

215、e)研究ntrk1和/或ngf基因功能，研究針對(duì)人ntrk1和/或ngf靶位點(diǎn)的藥物、藥效，研究與ntrk1和/或ngf相關(guān)的癌癥、炎癥、免疫疾病或神經(jīng)疾病藥物方面的應(yīng)用。

216、本發(fā)明提供了一種表達(dá)人或人源化ntrk1和/或ngf蛋白的非人動(dòng)物，該非人動(dòng)物可用于人ntrk1特異性治療劑的篩選。所述治療劑可減少或阻斷ntrk1和ntrk1受體復(fù)合物之間的相互作用，測(cè)試治療劑是否可以增加或減少免疫應(yīng)答，和/或確定治療劑是否是ntrk1和/或ngf激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是人疾病動(dòng)物模型。如，疾病是遺傳誘導(dǎo)的(敲入或敲除)。在不同的實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物還包含受損的免疫系統(tǒng)，如，經(jīng)過(guò)基因修飾的人源性組織異種移植，包括人實(shí)體瘤(例如，乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、內(nèi)分泌癌、頭頸癌、肝癌或肺癌)或血液瘤(例如，淋巴細(xì)胞腫瘤、如b或t細(xì)胞腫瘤)。

217、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf抗體、核酸藥物和/或多肽藥物)在治療各種免疫疾病方面的有效性。在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病包括但不限于gvhd(移植物抗宿主病)、過(guò)敏性鼻炎、銀屑病、多發(fā)硬化癥、克羅恩病、強(qiáng)直性脊柱炎、過(guò)敏、哮喘、心肌炎、腎炎、肝炎(優(yōu)選為非酒精性脂肪性肝炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺功能亢進(jìn)、血小板減少性紫癜(包括原發(fā)性或特發(fā)性)、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性肝病、糖尿病或疼痛等。在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病為過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏、哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)硬化癥。

218、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf抗體、核酸藥物和/或多肽藥物)在治療各種炎癥方面的有效性。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的炎癥包括急性炎癥和慢性炎癥。具體而言，炎癥包括但不限于退行性炎癥、滲出性炎癥(例如漿液性炎癥、纖維蛋白炎癥、化膿性炎癥、出血性炎癥、壞死性炎癥、卡他性炎癥)、增殖性炎癥、特異性炎癥(如肺結(jié)核、梅毒、麻風(fēng)病或淋巴肉芽腫)。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的炎癥包括感染，并且感染是指由侵入人體的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)和/或其他病原體引起的局部組織和全身炎癥反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，所述炎癥為關(guān)節(jié)炎、瘙癢、特應(yīng)性皮炎或炎癥性腸病(ibd)。

219、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf抗體、核酸藥物和/或多肽藥物)在治療各種神經(jīng)疾病方面的有效性。在一些實(shí)施例中，所述為認(rèn)知障礙、阿爾茨海默癥、帕金森或亨廷頓舞蹈癥。

220、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf抗體、核酸藥物和/或多肽藥物)在治療癌癥方面的有效性。在一些實(shí)施例中，所述方法涉及如本技術(shù)所述向非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物患有癌癥或腫瘤；以及確定治療劑對(duì)癌癥或腫瘤的抑制作用?？梢源_定的抑制作用包括，例如，腫瘤大小或腫瘤體積的減少，腫瘤生長(zhǎng)的減少，受試者中腫瘤體積增加率的降低(例如，與治療前同一受試者或未經(jīng)這種治療的另一受試物中腫瘤體積的增加率相比)，降低發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)或發(fā)生一個(gè)或多個(gè)額外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，提高生存率和延長(zhǎng)預(yù)期壽命等。受試者的腫瘤體積可以通過(guò)各種方法確定，例如通過(guò)直接測(cè)量、mri或ct確定。在一些實(shí)施例中，腫瘤包含注射到非人動(dòng)物中的一個(gè)或多個(gè)癌癥細(xì)胞(例如，人類或小鼠癌癥細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，抗體激活ntrk1信號(hào)通路。在一些實(shí)施例中，抗體不激活ntrk1信號(hào)通路。在一些實(shí)施例中，所述癌癥為實(shí)體瘤或血液瘤，實(shí)體瘤例如乳腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、內(nèi)分泌癌、頭頸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌癥、黑色素瘤、腎癌癥或肺癌；血液瘤包括但不限于淋巴細(xì)胞腫瘤，例如b或t細(xì)胞腫瘤。

221、在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物可用于確定抗體是否為ntrk1和/或ngf激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的方法還被設(shè)計(jì)為確定治療劑(例如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物)對(duì)ntrk1和/或ngf的作用，例如，所述治療劑是否可以上調(diào)免疫應(yīng)答或下調(diào)免疫應(yīng)答，和/或該治療劑是否可以誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(cmc)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)。在一些實(shí)施例中，基因修飾非人動(dòng)物可用于確定治療劑的有效劑量，以治療對(duì)象中的疾病，例如癌癥。

222、對(duì)腫瘤的抑制作用也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定，例如，測(cè)量動(dòng)物中的腫瘤體積，和/或確定腫瘤(體積)抑制率(tgitv)。腫瘤生長(zhǎng)抑制率可使用公式tgitv(％)＝(1–tvt/tvc)×100計(jì)算，其中tvt和tvc是治療組和對(duì)照組的平均腫瘤體積(或重量)。

223、在一些實(shí)施例中，治療劑(例如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物)被設(shè)計(jì)用于治療各種癌癥。如本技術(shù)所用，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指具有自主生長(zhǎng)能力的細(xì)胞，即以快速增殖細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的異常狀態(tài)或狀態(tài)。該術(shù)語(yǔ)旨在包括所有類型的癌生長(zhǎng)或致癌過(guò)程、轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，而不考慮組織病理學(xué)類型或侵襲性階段。本技術(shù)中使用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”是指癌細(xì)胞，例如癌細(xì)胞團(tuán)。可使用本技術(shù)所述方法治療或診斷的癌癥包括各種器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，例如影響肺、乳腺、甲狀腺、淋巴、胃腸和生殖泌尿道的惡性腫瘤以及腺癌，其包括惡性腫瘤，如大多數(shù)結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌癥和/或睪丸腫瘤，非小細(xì)胞肺癌。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的治療劑被設(shè)計(jì)用于治療或診斷受試者中的癌癥。術(shù)語(yǔ)“癌”是公認(rèn)的，是指上皮或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑色素瘤。在一些實(shí)施例中，癌癥是腎癌或黑色素瘤。示例性癌包括由宮頸、肺、前列腺、乳腺、頭頸部、結(jié)腸和卵巢組織形成的癌。該術(shù)語(yǔ)還包括癌肉瘤，例如，包括由癌組織和肉瘤組織組成的惡性腫瘤。“腺癌”是指來(lái)源于腺組織或腫瘤細(xì)胞形成可識(shí)別的腺結(jié)構(gòu)的癌癥。術(shù)語(yǔ)“肉瘤”是公認(rèn)，指的是間充質(zhì)來(lái)源的惡性腫瘤。

224、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的癌癥是淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、白血病、卵巢癌癥、鼻咽癌、乳腺癌癥、子宮內(nèi)膜癌癥、結(jié)腸癌、直腸癌、癌癥、膀胱癌癥、膠質(zhì)瘤、癌癥、支氣管癌癥、骨癌癥、前列腺癌癥、胰腺癌癥、肝和膽管癌癥、食管癌癥、腎癌癥、甲狀腺癌癥、頭頸部癌癥、睪丸癌癥、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生異常綜合征和肉瘤。在一些實(shí)施例中，所述白血病選自急性淋巴細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)白血病、急性髓細(xì)胞白血病、髓系白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞白血病和慢性髓細(xì)胞性白血病。在一些實(shí)施例中，淋巴瘤選自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤和t細(xì)胞淋巴瘤，以及waldenstrom巨球蛋白血癥。在一些實(shí)施例中，肉瘤選自骨肉瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和軟骨肉瘤。在具體實(shí)施例中，腫瘤是乳腺癌、卵巢癌癥、子宮內(nèi)膜癌癥、黑色素瘤、腎癌癥或肺癌。在一些實(shí)施例中，所述癌癥為乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、內(nèi)分泌癌、實(shí)體瘤、血液瘤、頭頸癌、肝癌或肺癌。

225、在一些實(shí)施例中，治療劑(例如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物)被設(shè)計(jì)用于治療各種免疫疾病，包括但不限于gvhd(移植物抗宿主病)、過(guò)敏性鼻炎、銀屑病、多發(fā)硬化癥、克羅恩病、強(qiáng)直性脊柱炎、過(guò)敏、哮喘、心肌炎、腎炎、肝炎(優(yōu)選為非酒精性脂肪性肝炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺功能亢進(jìn)、血小板減少性紫癜(包括原發(fā)性或特發(fā)性)、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛等。因此，本技術(shù)所述的方法可用于確定治療劑(例如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物)在抑制免疫應(yīng)答中的有效性。在一些實(shí)施例中，治療劑(例如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物)被設(shè)計(jì)用于治療各種炎癥，例如病毒性炎癥。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的炎癥包括急性炎癥和慢性炎癥。具體而言，炎癥包括但不限于退行性炎癥、滲出性炎癥(例如漿液性炎癥、纖維蛋白炎癥、化膿性炎癥、出血性炎癥、壞死性炎癥、卡他性炎癥)、增殖性炎癥、特異性炎癥(如肺結(jié)核、梅毒、麻風(fēng)病或淋巴肉芽腫)。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的炎癥包括感染，并且感染是指由侵入人體的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)和/或其他病原體引起的局部組織和全身炎癥反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，炎癥為關(guān)節(jié)炎、瘙癢、特應(yīng)性皮炎或炎癥性腸病(ibd)。

226、本發(fā)明還提供了一種確定治療劑(如，靶向人ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物)毒性的檢測(cè)方法。所述檢測(cè)方法包括向上述所述非人動(dòng)物施用治療劑，評(píng)估非人動(dòng)物的體重變化或血液檢測(cè)，所述血液檢測(cè)包括但不限于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容和/或血紅蛋白含量。在一些實(shí)施例中，治療劑可使紅細(xì)胞(rbc)、血細(xì)胞比容或血紅蛋白降低20％、30％、40％或50％以上。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的體重與對(duì)照組(如，未用治療劑處理的動(dòng)物的平均體重)相比至少小5％、10％、20％、30％或40％。

227、本發(fā)明還提供了一種通過(guò)本技術(shù)所述方法構(gòu)建的動(dòng)物模型在開(kāi)發(fā)與人類細(xì)胞免疫過(guò)程相關(guān)的產(chǎn)品、制造人抗體、或用于藥理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的模型系統(tǒng)。

228、在一些實(shí)施例中，提供了一種通過(guò)本技術(shù)描述的方法生成的動(dòng)物模型在生產(chǎn)和利用人體細(xì)胞的免疫過(guò)程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)疾病模型、研究病原體、或制定新的診斷策略和/或治療策略。

229、本發(fā)明還提供了通過(guò)本技術(shù)所述方法生成的動(dòng)物模型來(lái)篩選、驗(yàn)證、評(píng)估或研究ntrk1和/或ngf基因功能、靶向人ntrk1和/或ngf的藥物(例如免疫疾病、炎癥、癌癥或神經(jīng)疾病的藥物)或有效性。

230、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)提供了一種驗(yàn)證tcr-t、car-t和/或其他免疫療法(例如，t細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移療法)的體內(nèi)療效的方法。例如，所述方法包括將人腫瘤細(xì)胞移植到本技術(shù)所述的動(dòng)物中，并將人car-t應(yīng)用于具有人腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物。car-t治療的有效性可以確定和評(píng)估。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物選自通過(guò)本技術(shù)所述方法制備的ntrk1和/或ngf基因人源化非人動(dòng)物、本技術(shù)所述的ntrk1和/或ngf基因人源化非人動(dòng)物，通過(guò)本技術(shù)所描述的方法產(chǎn)生的雙重或多重基因人源化非人動(dòng)物(或其后代)，表達(dá)人或人源化ntrk1和/或ngf蛋白的非人動(dòng)物，或本技術(shù)所述的攜帶腫瘤或炎性動(dòng)物模型。在一些實(shí)施例中，tcr-t、car-t和/或其他免疫療法可以治療本技術(shù)所述的ntrk1和/或ngf相關(guān)疾病。在一些實(shí)施例中，tcr-t、car-t和/或其他免疫療法提供了用于治療本技術(shù)所述的ntrk1和/或ngf相關(guān)疾病的評(píng)估方法。

231、兩個(gè)或多個(gè)人或嵌合(x)基因的非人動(dòng)物模型

232、本發(fā)明還提供了一種用于產(chǎn)生具有兩個(gè)或多個(gè)人或嵌合(x)基因的基因修飾動(dòng)物模型的方法。該動(dòng)物模型可以包含人或嵌合ntrk1和/或ngf基因和編碼額外的人或嵌合(x)蛋白的序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物包括人或人源化ntrk1和/或ngf基因。

233、在一些實(shí)施例中，所述額外的人或嵌合(x)蛋白包括但不限于ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種基因修飾的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，上述所述非人動(dòng)物還表達(dá)人或人源化的ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4蛋白中的至少一種。

234、本發(fā)明還提供了一種兩個(gè)或多個(gè)人或嵌合(x)基因的非人動(dòng)物的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：

235、(一)提供上述的構(gòu)建方法獲得非人動(dòng)物；

236、(二)將步驟(一)提供的非人動(dòng)物與其他基因修飾的非人動(dòng)物交配、體外受精或直接進(jìn)行基因編輯，并進(jìn)行篩選，得到多基因修飾的非人動(dòng)物。

237、在一些實(shí)施例中，所述其他基因修飾的非人動(dòng)物包括但不限于基因ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的一種或兩種以上的組合人源化的非人動(dòng)物。

238、在一些實(shí)施例中，人源化直接在具有人或嵌合ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4基因中的至少一種修飾的非人動(dòng)物上進(jìn)行。

239、由于這些蛋白可能涉及不同的機(jī)制，因此靶向其中兩種或多種蛋白的聯(lián)合療法可能是一種更有效的治療方法。事實(shí)上，許多相關(guān)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，并顯示出良好的效果。多基因修飾的非人動(dòng)物模型可用于確定靶向兩種或多種蛋白的聯(lián)合療法的有效性，例如，靶向ntrk1和/或ngf的治療劑，例如靶向人ntrk1和/或ngf的抗體、核酸藥物或多肽藥物，以及用于治療癌癥或免疫疾病(例如，過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、哮喘或多發(fā)性硬化癥)或炎癥或神經(jīng)疾病的附加治療劑。所述方法包括向非人動(dòng)物施用靶向ntrk1和/或ngf的治療劑和附加治療劑，其中非人動(dòng)物具有腫瘤或免疫疾病，并確定聯(lián)合治療對(duì)免疫腫瘤或免疫疾病的影響。在一些實(shí)施例中，所述附加治療劑是特異性結(jié)合ntrk2、icos、nkp46、tfr1、il31、shh、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中至少一種的抗體。在一些實(shí)施例中，所述附加治療劑是抗ctla4抗體(例如，ipilimumab)、抗pd-1抗體(例如，納武利尤單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗)或抗pd-l1抗體。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括編碼人或人源化pd-1的序列、編碼人或人源化pd-l1的序列、或編碼人或人源化ctla-4的序列。在一些實(shí)施例中，上述所述腫瘤包括一個(gè)或多個(gè)表達(dá)pd-l1和/或pd-l2的腫瘤細(xì)胞。

240、在一些實(shí)施例中，該組合治療用于治療本技術(shù)所述的各種癌癥，例如，乳腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、內(nèi)分泌癌、頭頸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌癥、黑色素瘤、腎癌癥或肺癌。在一些實(shí)施例中，組合治療被設(shè)計(jì)用于治療本技術(shù)所述的免疫疾病，例如銀屑病、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或多發(fā)性硬化癥。

241、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的方法可用于評(píng)估與一些其他方法的組合治療?？蓡为?dú)使用或與本技術(shù)所述方法結(jié)合使用的治療癌癥的方法包括，例如，用化學(xué)療法治療受試者，例如，樟腦堿、多柔比星、順鉑、卡鉑、丙卡巴嗪、甲氯雷他明、環(huán)磷酰胺、阿霉素、異環(huán)酰胺、馬法蘭、氯丁嘧啶、比硫芬、亞硝基脲、達(dá)克寧、柔紅霉素、博萊霉素、普利霉素、絲裂霉素、依托泊苷、維拉帕米、鬼臼毒素、三苯氧胺、紫杉醇、轉(zhuǎn)鉑、5-氟脲酸、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花素和/或甲氨蝶呤?；蛘撸酥?，所述方法可以包括對(duì)受試者進(jìn)行手術(shù)，以移除癌癥的至少一部分，例如，從患者身上移除腫瘤的一部分或全部。