本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于動(dòng)態(tài)微環(huán)境的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學(xué)研究中，細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是一種用于研究不同細(xì)胞類型之間的相互作用及其對(duì)生物過程的影響的重要方法，傳統(tǒng)的細(xì)胞共培養(yǎng)方法通常通過物理隔離的方式實(shí)現(xiàn)，但物理隔離雖然實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞一定程度的分隔，但裝置結(jié)構(gòu)較為單一，無法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜微環(huán)境的動(dòng)態(tài)控制，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維空間分布。

2、微流控細(xì)胞芯片分析儀設(shè)備，可通過基于流動(dòng)灌注進(jìn)行的長期活細(xì)胞分析工作，實(shí)現(xiàn)例如實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞行為、動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件等功能，但現(xiàn)有設(shè)備的設(shè)計(jì)無法有效支持跨越多個(gè)培養(yǎng)室的多種細(xì)胞的復(fù)雜信號(hào)交換，同時(shí)由于操作繁瑣以及設(shè)備造價(jià)高昂，難以通過其他設(shè)備進(jìn)行一體化集成，限制了對(duì)不同細(xì)胞共培養(yǎng)以及多細(xì)胞復(fù)雜關(guān)系的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于動(dòng)態(tài)微環(huán)境的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，方法包括：

2、步驟一，芯片處理：將微流控培養(yǎng)板、蓋板進(jìn)行滅菌處理并清洗、干燥后放置備用，微流控培養(yǎng)板包括進(jìn)樣孔一、進(jìn)樣孔二、培養(yǎng)腔、開放孔和終端孔，培養(yǎng)腔為封閉式培養(yǎng)室，培養(yǎng)腔一側(cè)分別連通進(jìn)樣孔一和進(jìn)樣孔二，另一側(cè)通過液體通道連通開放孔，終端孔連通開放孔形成由培養(yǎng)腔至終端孔的細(xì)胞培養(yǎng)通路，微流控培養(yǎng)板上由培養(yǎng)腔至開放孔方向具有逐漸降低的坡度差；

3、步驟二，制備待培養(yǎng)a細(xì)胞懸液：將待培養(yǎng)a細(xì)胞配制為a細(xì)胞懸液后備用；

4、步驟三，制備待培養(yǎng)b細(xì)胞懸液：將待培養(yǎng)b細(xì)胞配制為b細(xì)胞懸液后備用；

5、步驟四，細(xì)胞接種：在步驟一處理后的微流控培養(yǎng)板中，將進(jìn)樣孔一、進(jìn)樣孔二和開放孔中液體吸干，取步驟二和步驟三中制備的a細(xì)胞懸液和b細(xì)胞懸液，通過進(jìn)樣孔二先后注入培養(yǎng)腔中，完成兩種細(xì)胞的接種；

6、步驟五，細(xì)胞培養(yǎng)，在步驟四完成細(xì)胞接種的微流控培養(yǎng)板中，通過進(jìn)樣孔一向培養(yǎng)腔內(nèi)持續(xù)灌注培養(yǎng)基，在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)，開放孔和終端孔收集來自培養(yǎng)腔的培養(yǎng)基和細(xì)胞代謝物；

7、步驟六，完成培養(yǎng)：在步驟五中細(xì)胞培養(yǎng)完成后，得到a、b細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

8、具體的，步驟二和步驟三中a細(xì)胞懸液和b細(xì)胞懸液中，a細(xì)胞和b細(xì)胞密度均為3×106cells/ml，步驟四中注入培養(yǎng)腔中a細(xì)胞懸液和b細(xì)胞懸液的體積各為7.5μl。

9、具體的，步驟三替換為：制備待培養(yǎng)b細(xì)胞混合凝膠，將b細(xì)胞和水凝膠混合配置為b細(xì)胞混合凝膠后備用；

10、步驟四替換為：細(xì)胞接種，在步驟一處理后的微流控培養(yǎng)板中，將進(jìn)樣孔一、進(jìn)樣孔二和開放孔中液體吸干，將步驟二中制備的a細(xì)胞懸液通過進(jìn)樣孔二注入培養(yǎng)腔中，將步驟三中制備的b細(xì)胞混合凝膠轉(zhuǎn)移至開放孔中，完成兩種細(xì)胞的接種；

11、步驟五替換為：細(xì)胞培養(yǎng)，在步驟四完成細(xì)胞接種的微流控培養(yǎng)板中，通過進(jìn)樣孔一向培養(yǎng)腔內(nèi)持續(xù)灌注培養(yǎng)基，在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)，終端孔收集來自培養(yǎng)腔和開放孔的培養(yǎng)基和細(xì)胞代謝物。

12、具體的，步驟二中，a細(xì)胞懸液中a細(xì)胞密度為1-5×106cells/ml。

13、具體的，步驟三中，b細(xì)胞混合凝膠的制備方法為：

14、步驟3.1：使用含10％血清的培養(yǎng)基與b細(xì)胞配制密度為2.67-4×106cells/ml的b細(xì)胞懸液a；

15、步驟3.2：將步驟3.1得到的b細(xì)胞懸液a與100％胎牛血清進(jìn)行1：1混合，得到含50％胎牛血清的b細(xì)胞懸液b；

16、步驟3.3：配置水凝膠與稀釋液1:2的水凝膠稀釋液，最終以1：4的比例將步驟3.2得到的b細(xì)胞懸液b和水凝膠稀釋液混合，得到b細(xì)胞混合凝膠。

17、具體的，步驟四中包括：步驟4.1，a細(xì)胞接種

18、將進(jìn)樣孔一和進(jìn)樣孔二中的液體吸干，在進(jìn)樣孔一中加入含血清的培養(yǎng)基350μl，在進(jìn)樣孔二中加入15μl的a細(xì)胞懸液并設(shè)定壓力為0.25psi,時(shí)間為8秒，將a細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)腔。

19、具體的，步驟四還包括：步驟4.2，b細(xì)胞接種

20、將開放孔中的液體吸干，用無菌pbs清洗2-3遍，吸走終端孔中的液體，將30μl-40μl的b細(xì)胞混合凝膠轉(zhuǎn)移到開放孔，室溫靜置20min后，向開放孔中加入含有血清的培養(yǎng)基30μl，完成b細(xì)胞的接種。

21、具體的，步驟五包括：進(jìn)樣孔一中培養(yǎng)基靠自然重力持續(xù)灌流至培養(yǎng)腔，開放孔接收來自培養(yǎng)腔的灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24h-72h。

22、具體的，步驟二中，待培養(yǎng)a細(xì)胞為人結(jié)直腸癌細(xì)胞caco-2，步驟三中，待培養(yǎng)b細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞hepg2。

23、優(yōu)點(diǎn)效果

24、本發(fā)明在微流控芯片設(shè)備的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)基礎(chǔ)上，通過分別在培養(yǎng)腔和開放孔中連通培養(yǎng)兩種細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)模擬體內(nèi)代謝流程的兩種細(xì)胞共培養(yǎng)；通過發(fā)明中基質(zhì)膠類型、培養(yǎng)方式以及細(xì)胞、溶液的配制實(shí)現(xiàn)在原本不適于培養(yǎng)環(huán)境條件下的良好生長，同時(shí)在開放孔內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。

技術(shù)特征：

1.一種基于動(dòng)態(tài)微環(huán)境的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟二和步驟三中a細(xì)胞懸液和b細(xì)胞懸液中，a細(xì)胞和b細(xì)胞密度均為3×106cells/ml，所述步驟四中注入培養(yǎng)腔中a細(xì)胞懸液和b細(xì)胞懸液的體積各為7.5μl。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟三替換為：制備待培養(yǎng)b細(xì)胞混合凝膠，將b細(xì)胞和水凝膠混合配置為b細(xì)胞混合凝膠后備用；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟二中，a細(xì)胞懸液中a細(xì)胞密度為1-5×106cells/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟三中，b細(xì)胞混合凝膠的制備方法為：

6.根據(jù)權(quán)利要求1或3任一所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟四中包括：步驟4.1，a細(xì)胞接種

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟四還包括：步驟4.2，b細(xì)胞接種

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟五包括：進(jìn)樣孔一中培養(yǎng)基靠自然重力持續(xù)灌流至培養(yǎng)腔，開放孔接收來自培養(yǎng)腔的灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24h-72h。

9.根據(jù)權(quán)利要求1或3任一所述的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟二中，待培養(yǎng)a細(xì)胞為人結(jié)直腸癌細(xì)胞caco-2，所述步驟三中，待培養(yǎng)b細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞hepg2。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基與動(dòng)態(tài)微環(huán)境的細(xì)胞仿生共培養(yǎng)方法，方法包括：步驟一，芯片處理；步驟二，制備A細(xì)胞懸液，將A細(xì)胞配制為細(xì)胞懸液后備用；步驟三，制備B細(xì)胞混合液；步驟四，細(xì)胞接種，將步驟二中制備的A細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)腔中，將步驟三中制備的B細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板，完成兩種細(xì)胞的接種；步驟五，細(xì)胞培養(yǎng)，向培養(yǎng)腔中持續(xù)灌注培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基依次流經(jīng)培養(yǎng)腔和開放孔，在細(xì)胞培養(yǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，通過實(shí)施本發(fā)明實(shí)現(xiàn)模擬體內(nèi)代謝流程的兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)。

技術(shù)研發(fā)人員：楊倬,范志宣,卓勤,宮照龍,王晶波,秦文
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15