本發(fā)明屬于細胞生物學，具體涉及一種基于meg-01細胞生成血小板樣顆粒及其功能評估的方法。

背景技術：

1、血小板(platelet)是哺乳動物血液中的重要組成部分，在止血、凝血和血管修復中起關鍵作用。血小板功能異常或數量不足是多種疾病(如心血管疾病、血液病、免疫疾病)的重要病理基礎。此外，血小板的激活狀態(tài)還與血栓形成等疾病密切相關，因此，研究血小板的功能特性具有重要的科學和臨床意義。

2、然而，傳統(tǒng)的血小板研究依賴于從人類或動物血液中直接分離血小板。這種方法存在諸多局限性，如受限于血液樣本供給，尤其在大規(guī)模研究或特殊實驗需求時，難以保證足夠數量的血小板供實驗使用；從人體獲取血小板涉及倫理審查程序，樣本獲取受限；個體差異導致血小板功能和狀態(tài)存在高度可變性，難以保證實驗數據的重復性；天然血小板在體外條件下保存時間較短，活性難以維持。

3、為克服天然血小板研究的局限性，科學家們嘗試開發(fā)基于細胞模型的血小板研究方法。meg-01細胞是一種來源于人類巨核細胞白血病的細胞系，能夠在特定條件下分化為血小板樣顆粒(plps)。相較于直接使用天然血小板，plps模型具有資源可控、倫理風險低以及易于保存和操作等優(yōu)勢。但現有研究大多通過簡單的形態(tài)學觀察或少數表面標志物檢測來確認plps的存在，缺乏對其功能性和活化狀態(tài)的系統(tǒng)評估。

技術實現思路

1、本發(fā)明提供了一種基于meg-01細胞生成血小板樣顆粒及其功能評估的方法，利用pma誘導劑將meg-01細胞分化為具有血小板特征的plps，為血小板相關的功能性研究提供了一種經濟高效且可重復的體外模型。

2、本發(fā)明的第一個目的在于提供一種誘導meg-01細胞生成血小板樣顆粒的方法，包括對細胞密度為70～80％的meg-01細胞進行饑餓處理，而后在完全培養(yǎng)基條件下與pma混合，經培養(yǎng)后收集細胞，收集的細胞中包含所述血小板樣顆粒。

3、本發(fā)明的一個實施例中，所述pma在混合液中的終濃度為100ng/ml。

4、本發(fā)明的一個實施例中，所述pma以工作液的形式加入，pma工作液的制備方法，包括，將pma溶于dmso中制備成儲存液，利用無血清培養(yǎng)基將所述儲存液稀釋成工作液，所述工作液的濃度為0.1mg/ml。

5、本發(fā)明的一個實施例中，所述儲存液的濃度為2mg/ml。

6、本發(fā)明的一個實施例中，在加入pma后培養(yǎng)72h，收集細胞。

7、本發(fā)明的一個實施例中，還包括從收集的細胞中分離所述血小板樣顆粒，所述分離的方法包括離心。

8、本發(fā)明的一個實施例中，所述離心包括進行第一離心，對第一離心上清液進行第二離心，收集沉淀部分；

9、所述第一離心的離心力為200g，離心時間為15min；

10、所述第二離心的離心力為1600g，離心時間為15min。

11、本發(fā)明的第二個目的在于提供上述方法生產得到的血小板樣顆粒。

12、本發(fā)明的第三個目的在于提供上述活性血小板顆粒在制備血小板體外模型中的應用。

13、本發(fā)明的第四個目的在于提供上述血小板顆粒的功能評估方法，包括檢測所述血小板顆粒表面血小板特征糖蛋白的表達水平，以及使用血小板激活劑adp對所述血小板顆粒進行激活后，檢測表面cd62p的表達水平。

14、有益效果：本發(fā)明提供了一種通過誘導meg-01細胞生成plps的方法，利用pma誘導劑將meg-01細胞分化為具有血小板特征的plps。本發(fā)明實施例中通過流式細胞儀檢測plps的特征蛋白表達及功能性，驗證了plps在血小板功能研究中的適用性，包括對激活劑的響應能力評估，證實所得plps具有與天然血小板一致的特征性表面標志物表達，能夠響應激活劑adp的刺激，展現出血小板的生物學功能特性。本發(fā)明所述生成plps的方法簡單、經濟，且實驗條件高度可控，克服了傳統(tǒng)方法的不足，為血小板相關的功能性研究提供了一種經濟高效且可重復的體外模型，如可應用于化學物質(如全氟化合物)對血小板功能影響的研究，為毒理學評估和藥物篩選提供新工具。

技術特征：

1.一種誘導meg-01細胞生成血小板樣顆粒的方法，其特征在于，包括對細胞密度為70～80％的meg-01細胞進行饑餓處理，而后在完全培養(yǎng)基條件下與pma混合，經培養(yǎng)后收集細胞，收集的細胞中包含所述血小板樣顆粒。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述pma在混合液中的終濃度為100ng/ml。

3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，所述pma以工作液的形式加入，pma工作液的制備方法，包括，將pma溶于dmso中制備成儲存液，利用無血清培養(yǎng)基將所述儲存液稀釋成工作液，所述工作液的濃度為0.1mg/ml。

4.根據權利要求3所述方法，其特征在于，所述儲存液的濃度為2mg/ml。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，在加入pma后培養(yǎng)72h，收集細胞。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，還包括從收集的細胞中分離所述血小板樣顆粒，所述分離的方法包括離心。

7.根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述離心包括進行第一離心，對第一離心上清液進行第二離心，收集沉淀部分；

8.利用權利要求1～7任一項所述方法生產得到的血小板樣顆粒。

9.權利要求8所述血小板顆粒在制備血小板體外模型中的應用。

10.權利要求8所述血小板顆粒的功能評估方法，其特征在于，包括檢測所述血小板顆粒表面血小板特征糖蛋白的表達水平，以及使用血小板激活劑adp對所述血小板顆粒進行激活后，檢測表面cd62p的表達水平。

技術總結
本發(fā)明提供了一種基于MEG?01細胞生成血小板樣顆粒及其功能評估的方法，屬于細胞生物學技術領域。本發(fā)明提供了一種通過誘導MEG?01細胞生成PLPs的方法，利用PMA誘導劑將MEG?01細胞分化為具有血小板特征的PLPs。本發(fā)明所述PLPs具有與天然血小板一致的特征性表面標志物表達，能夠響應激活劑ADP的刺激，展現出血小板的生物學功能特性。本發(fā)明所述生成PLPs的方法簡單、經濟，且實驗條件高度可控，為血小板相關的功能性研究提供了一種經濟高效且可重復的體外模型。

技術研發(fā)人員：王亞韡,劉洋,朱娜麗,黎娟
受保護的技術使用者：中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/15