本發(fā)明屬于基因工程與發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)兩性霉素b的重組結(jié)節(jié)鏈霉菌、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，尤其是通過重組結(jié)節(jié)鏈霉菌細(xì)胞形態(tài)優(yōu)化提高兩性霉素b生產(chǎn)效率的方法。

背景技術(shù)：

1、兩性霉素b(amphotericinb，amb)是重要的抗真菌類抗生素，自1966年上市以來，一直是深部真菌感染的首選藥物。amb純品的顏色為黃色或橘黃色，由于其分子結(jié)構(gòu)中親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的不對稱分布和帶有酸堿性的特點(diǎn)，使得amb在水相及大部分有機(jī)相中的溶解度極低。amb抗真菌譜廣、活性強(qiáng)，對念珠菌、隱球菌、毛霉菌、曲霉菌、組織胞漿菌、球孢子菌等大多數(shù)深部真菌都有很強(qiáng)的抗真菌作用，還能有效抑制假絲酵母菌和用于治療利什曼病等，因此兩性霉素b及其衍生物的應(yīng)用仍然非常廣泛。

2、在兩性霉素b提產(chǎn)方面，主要集中于過表達(dá)代謝關(guān)鍵基因。2016年sweeney等通過表達(dá)amb生物合成基因簇調(diào)控基因amphriv，相比原始菌株其兩性霉素a和兩性霉素b的總產(chǎn)量提高了3倍，張博等人分析了搖瓶內(nèi)添加玻璃珠對兩性霉素b產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明，添加玻璃珠后能顯著改善菌絲聚集情況并顯著提高amb的產(chǎn)量，產(chǎn)量與對照組相比提高了341.1％，達(dá)到4563.2mg/l。同年，段寶玲等通過優(yōu)化有機(jī)復(fù)合氮源和發(fā)酵條件以降低批次間氮源對發(fā)酵代謝的影響，同時進(jìn)一步添加前體物質(zhì)，促進(jìn)兩性霉素b生物合成，最終發(fā)酵單位達(dá)到14469μg/ml，較優(yōu)化前提高103％，發(fā)酵時間縮短14％。2020年huang等在s.nodosus?zjb2016050中過表達(dá)乙酰輔酶a羧化酶、甲基丙二酰變位酶、甲基丙二酰異構(gòu)酶基因，增加合成amb前體供應(yīng)，amb產(chǎn)量最終在5l發(fā)酵罐中達(dá)到15.60g/l。同年，zhang等開發(fā)了一種聯(lián)合補(bǔ)料策略，通過添加關(guān)鍵前體及差異代謝物，進(jìn)行分階段發(fā)酵調(diào)控，使得amb產(chǎn)量達(dá)到18.39g/l，這也是迄今為止報道的最高amb產(chǎn)量。

3、基因水平的多組學(xué)分析及分子生物學(xué)技術(shù)的革新，運(yùn)用基于基因分子水平的基因工程育種將是一種精準(zhǔn)快速高效的育種方法。隨著s.nodosus菌株的全基因測序，amb合成過程的關(guān)鍵基因被解析，通過基因工程的方法理性構(gòu)建高產(chǎn)amb的工程菌株更具合理性。構(gòu)建鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株研究中，普遍為對次級代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控、過表達(dá)合成前體相關(guān)的酶及過表達(dá)基因簇中的關(guān)鍵酶等策略來提高鏈霉菌中次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，而鏈霉菌屬的成員以其復(fù)雜的形態(tài)而聞名，多數(shù)鏈霉菌屬的成員不但具有菌絲極性生長的絲狀真菌特性，而且鏈霉菌屬的成員也具有好氧真菌的特性，其產(chǎn)蛋白過程和線粒體的呼吸代謝緊密相關(guān)。大量的實(shí)驗(yàn)室研究及工業(yè)化生產(chǎn)都證明，鏈霉菌中菌絲體的形態(tài)能顯著影響amb的分泌和生產(chǎn)。一般來說，結(jié)節(jié)鏈霉菌是多細(xì)胞生長始于單個孢子的萌發(fā)，通過線形頂端延伸和菌絲分枝生長成營養(yǎng)菌絲體，然后形成氣生菌絲體，最后分化成單核細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)育成孢子，故其結(jié)節(jié)鏈霉菌的菌絲體在液體深層發(fā)酵中主要呈微球狀或網(wǎng)絡(luò)狀，不同的菌絲體形態(tài)會改變發(fā)酵液的流變性質(zhì)和產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，通過控制菌絲的形態(tài)可以提高生產(chǎn)所需求的不同產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，由于粘度高的菌絲嚴(yán)重阻礙攪拌和氧氣傳遞，導(dǎo)致培養(yǎng)異質(zhì)性、溶氧較差，細(xì)胞生長代謝活動減慢，進(jìn)而使得鏈霉菌生長發(fā)育遲緩甚至凋亡，加大了對菌絲形態(tài)的人為控制難度，也影響了amb的合成和分泌，因而，對于amb合成和分泌而言，使菌絲體處于叢狀或自由、分散狀，尤其是自由、分散的形態(tài)被認(rèn)為是提高amb產(chǎn)量的理想形態(tài)。然而，目前的結(jié)節(jié)鏈霉菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，菌絲體易于互相纏繞而結(jié)成塊狀，嚴(yán)重地抑制amb的分泌和“核”區(qū)菌絲的生長，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量，嚴(yán)重限制了其工業(yè)化生產(chǎn)，形態(tài)學(xué)基因改造將作為進(jìn)一步提高次級代謝物產(chǎn)量的策略被廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)兩性霉素b的重組結(jié)節(jié)鏈霉菌、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，通過過表達(dá)結(jié)節(jié)鏈霉菌細(xì)胞形態(tài)相關(guān)基因ftsz，獲得菌絲形態(tài)突變的基因工程菌株，緩解發(fā)酵過程中高粘稠度、鏈霉菌發(fā)酵過程中凝結(jié)成團(tuán)，耗能高、產(chǎn)量低的問題，縮短了發(fā)酵周期并有效提升了amb的生產(chǎn)效率。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種產(chǎn)兩性霉素b的重組結(jié)節(jié)鏈霉菌，其特征在于：所述重組結(jié)節(jié)鏈霉菌包括紅霉素強(qiáng)啟動子ermep*與纖維蛋白同源蛋白基因ftsz。

4、作為本技術(shù)的優(yōu)選，所述外源紅霉素強(qiáng)啟動子ermep*的核苷酸序列如seq?idno.1所示。

5、作為本技術(shù)的優(yōu)選，所述纖維蛋白同源蛋白基因ftsz的核苷酸序列如seq?idno.2所示。

6、本發(fā)明還提供了一種所述重組結(jié)節(jié)鏈霉菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

7、(1)將紅霉素強(qiáng)啟動子ermep*插入pjtu1278質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處，得到重組質(zhì)粒pjtu1278-ermep*；

8、(2)將纖維蛋白同源蛋白基因ftsz插入重組質(zhì)粒pjtu1278-ermep*中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pjtu1278-ftsz*；

9、(3)將重組表達(dá)質(zhì)粒pjtu1278-ftsz*導(dǎo)入供體菌大腸桿菌中，獲得含有重組表達(dá)質(zhì)粒的供體菌株大腸桿菌；

10、(4)通過接合轉(zhuǎn)移方法將步驟(3)構(gòu)建的含有重組質(zhì)粒的供體菌株大腸桿菌導(dǎo)入保藏編號為cctccno：m202301的底盤菌株結(jié)節(jié)鏈霉菌s.nodosus?zjb2016050d224a中，得到基因工程菌s.nodosus?zjb2016050d224a-ftsz*，即為產(chǎn)兩性霉素b的重組結(jié)節(jié)鏈霉菌。

11、本發(fā)明還提供了所述重組結(jié)節(jié)鏈霉菌在微生物發(fā)酵制備兩性霉素b中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于：在基礎(chǔ)質(zhì)粒上包括紅霉素強(qiáng)啟動子ermep*與纖維蛋白同源蛋白基因ftsz。

13、作為本技術(shù)的優(yōu)選，所述外源紅霉素強(qiáng)啟動子ermep*的核苷酸序列如seq?idno.1所示；所述纖維蛋白同源蛋白基因ftsz的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。纖維蛋白同源蛋白基因ftsz為結(jié)節(jié)鏈霉菌細(xì)胞形態(tài)相關(guān)基因，該基因能編碼一種細(xì)胞分裂蛋白，該蛋白在結(jié)節(jié)鏈霉菌生長分裂過程中起著至關(guān)重要的作用，過表達(dá)結(jié)節(jié)鏈霉菌細(xì)胞形態(tài)相關(guān)基因ftsz的突變菌株具有更為單一分散菌絲，突變菌株菌絲分散生長，不易形成顆粒絮狀，進(jìn)而有效抑制了鏈霉菌發(fā)酵過程中凝結(jié)成團(tuán)，降低發(fā)酵液粘度并能提高菌絲對氧氣及培養(yǎng)基基質(zhì)的利用率，從而提高amb產(chǎn)量。此外，該工程菌株可將amb發(fā)酵進(jìn)程縮短12小時即可在自然發(fā)酵狀態(tài)下達(dá)到產(chǎn)量最大值，這是前期所構(gòu)建的形態(tài)學(xué)工程菌株streptomyces?nodosuszjb2016050-ssga*所不具有的。

14、作為本技術(shù)的優(yōu)選，所述基礎(chǔ)質(zhì)粒為pjtu1278質(zhì)粒。

15、本發(fā)明還提供了一種所述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：將所述紅霉素強(qiáng)啟動子ermep*與纖維蛋白同源蛋白基因ftsz通過酶切方式連接到基礎(chǔ)質(zhì)粒上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。

16、本發(fā)明還提供了一種所述重組質(zhì)粒在發(fā)酵制備兩性霉素b中的應(yīng)用和/或在制備產(chǎn)兩性霉素b的重組結(jié)節(jié)鏈霉菌中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明還提供了一種兩性霉素b的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：將所述的重組結(jié)節(jié)鏈霉菌經(jīng)種子培養(yǎng)后獲得的種子液以體積濃度2～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在26～31℃、400～500r/min條件下培養(yǎng)96～168h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化獲得兩性霉素b。

18、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述種子培養(yǎng)過程如下：將所述重組結(jié)節(jié)鏈霉菌接種在gym平板上，25～28℃生長3～7天，收集灰色的孢子制成孢子懸液；將孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基25～28℃培養(yǎng)24～48h，獲得種子液。

19、具體的，所述種子培養(yǎng)過程如下：將所述重組結(jié)節(jié)鏈霉菌接種在gym平板上，26℃生長7天，獲得灰色的孢子，使用棉花棒將表面孢子洗脫至無菌水中，將洗下的孢子懸液用含有棉花的注射器過濾，過濾后的孢子離心去上清，加入無菌水重懸，獲得孢子懸液；孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)48h，獲得種子液。

20、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述gym平板的組成如下：葡萄糖1～5g/l，酵母粉1～5g/l，麥芽提取物5～29g/l，碳酸鈣1～3g/l，瓊脂15～20g/l，溶劑為水，ph?7.0～7.5，115℃滅菌30min。

21、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述種子培養(yǎng)基的組成如下：蛋白胨10～20g/l，nacl5～10g/l，葡萄糖10～15g/l，酵母粉5～10g/l，caco3?0.5～1g/l，溶劑為水，ph?7.0～7.2，115℃滅菌30min。

22、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖60～80g/l，牛肉膏5～10g/l，大豆蛋白粉5～10g/l，棉子粉8～30g/l，caco3?5～10g/l，kh2po40.1～0.4g/l，溶劑為水，ph?7.0，115℃滅菌30min。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

24、1、通過基因工程、代謝工程的技術(shù)手段對出發(fā)菌株進(jìn)行改造，通過過表達(dá)結(jié)節(jié)鏈霉菌細(xì)胞形態(tài)相關(guān)基因ftsz，構(gòu)建出產(chǎn)兩性霉素b的基因工程菌，該工程菌在發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)發(fā)生突變，具有更為單一粗壯菌絲，突變菌株菌絲分散生長，抑制了鏈霉菌發(fā)酵過程中凝結(jié)成團(tuán)，便于工業(yè)化生產(chǎn)中降低發(fā)酵液粘稠度，提升菌株的質(zhì)量和生產(chǎn)能力；

25、2、通過增強(qiáng)表達(dá)上述基因，該工程菌在108h?amb產(chǎn)量達(dá)到最大值9.31g/l較對照菌株提高了9.1％，同時縮短菌株發(fā)酵周期，時間縮短了12h，達(dá)到提升生產(chǎn)效率的目的；

26、3、兩性霉素b作為微生物發(fā)酵抗生素類藥物，藥物的純度和質(zhì)量在生產(chǎn)中至關(guān)重要；本發(fā)明不僅能提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以縮短發(fā)酵時間，有效提升了企業(yè)在工業(yè)化大生產(chǎn)中的總體效率。