本發(fā)明屬于獸藥殘留快速檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、氟甲喹(flu)是一種氟喹諾酮類抗生素。作為一種動(dòng)物專用抗菌藥物，氟甲喹被廣泛用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)，其主要作用是抑制細(xì)菌核酸的合成，進(jìn)而使蛋白質(zhì)的合成受干擾，導(dǎo)致細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂，從而起到殺菌的作用。近年來(lái)，氟甲喹在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，氟甲喹的大量使用可能會(huì)導(dǎo)致病原體對(duì)其的抵抗力增加，同時(shí)，氟甲喹及其代謝產(chǎn)物很容易在動(dòng)物源性食品中積蓄，從而通過(guò)食物鏈流入人體。已有研究表明，氟甲喹會(huì)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)造成損傷，還存在致癌風(fēng)險(xiǎn)。

2、目前，用于檢測(cè)氟甲喹殘留的方法主要有微生物法、色譜法、免疫分析法、熒光光譜法等。其中，免疫層析法因其操作簡(jiǎn)便、成本低、檢測(cè)時(shí)間短且兼具高靈敏度高特異性的優(yōu)點(diǎn)，能滿足大量樣品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，具有良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)行的《gb?31650.1—2022食品中41種獸藥最大殘留限量》對(duì)部分靶組織中氟甲喹的殘留限量規(guī)定僅為10μg/kg，然而，已被報(bào)道的特異性檢測(cè)氟甲喹的免疫層析方法中尚未出現(xiàn)檢測(cè)限達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)的免疫層析試紙條。

3、金納米花(aunf)是一類金球表面分布著不規(guī)則刺突，外觀形似花狀的納米顆粒，與市面上應(yīng)用最為廣泛的膠體金顆粒相比，其比表面積更大，能結(jié)合更多抗體，可以進(jìn)一步提高免疫層析試紙條的靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于上述背景，本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條及其制備方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種分泌抗氟甲喹單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4，所述小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4已于2024年11月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為cgmccno.46134。

4、一種抗氟甲喹單克隆抗體，所述抗氟甲喹單克隆抗體由上述的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4分泌產(chǎn)生。

5、上述的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4或抗氟甲喹單克隆抗體在制備檢測(cè)氟甲喹的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6、一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條，所述金納米花免疫層析試紙條包括以下組分：塑料外殼、樣品墊、免疫探針結(jié)合墊、吸水墊、硝酸纖維膜和pvc底板；所述免疫探針結(jié)合墊上滴加有抗氟甲喹單克隆抗體標(biāo)記的金納米花免疫探針；所述抗氟甲喹單克隆抗體由小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4分泌；所述小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4已于2024年11月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為cgmcc?no.46134。

7、上述一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

8、(1)膠體金的制備：采用檸檬酸還原法制備膠體金；

9、(2)金納米花的制備：以步驟(1)制備的膠體金為金種子，采用種子生長(zhǎng)法制備金納米花；

10、(3)抗氟甲喹單克隆抗體標(biāo)記的金納米花免疫探針的制備：向每1ml步驟(2)制備的金納米花中先后添加2.5μl?0.1m碳酸鉀、3μg抗氟甲喹單克隆抗體，體系穩(wěn)定后加入bsa封閉未結(jié)合位點(diǎn)，最后加入peg20000，離心重懸后得到抗氟甲喹單克隆抗體標(biāo)記的金納米花免疫探針；

11、(4)免疫探針結(jié)合墊、樣品墊及吸水墊的預(yù)處理：將未處理的免疫探針結(jié)合墊裁剪成寬1cm的長(zhǎng)條狀，將其置于大培養(yǎng)皿中，用提前配好的封閉液浸泡，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱封閉2h，然后從培養(yǎng)箱取出后濾去封閉液并繼續(xù)置于培養(yǎng)箱37℃烘干后于常溫封存，后續(xù)使用按照長(zhǎng)為1cm、寬為4mm裁剪；封閉液的組成為：5wt％bsa+1vol％tween-20；樣品墊無(wú)需處理，后續(xù)使用按照長(zhǎng)為1cm、寬為4mm裁剪；吸水墊無(wú)需處理，后續(xù)使用按照長(zhǎng)為1.5cm、寬為4mm裁剪；

12、(5)硝酸纖維素膜劃線：將硝酸纖維素膜粘貼固定于pvc底板上，取羊抗鼠二抗在硝酸纖維素膜上進(jìn)行劃c線，取采用碳二亞胺法合成的完全抗原flu-ova在硝酸纖維素膜上進(jìn)行劃t線，同一張硝酸纖維素膜上的c、t線之間距離為0.6cm；

13、(6)免疫探針結(jié)合墊的制備：在預(yù)處理后的免疫探針結(jié)合墊上滴加步驟(3)制備的抗氟甲喹單克隆抗體標(biāo)記的金納米花免疫探針，37℃烘干待用；

14、(7)免疫層析試紙條的組裝：將步驟(5)劃線后的硝酸纖維素膜、步驟(6)制備的免疫探針結(jié)合墊、步驟(4)預(yù)處理的樣品墊與吸水墊組裝在底板上；其中免疫探針結(jié)合墊和樣品墊重疊交錯(cuò)粘貼，同端相隔2mm，吸水墊與硝酸纖維素膜首尾重疊2mm，蓋上塑料外殼蓋子，干燥封裝，置于4℃保存。

15、其中，步驟(3)中所述抗氟甲喹單克隆抗體的制備方法為：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4注射到石蠟致敏過(guò)的balb/c小鼠腹腔，待小鼠腹部膨大鼓脹時(shí)抽取腹水，經(jīng)分離純化獲得抗氟甲喹單克隆抗體。

16、本發(fā)明所述一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條的檢測(cè)原理：當(dāng)試紙條開始用于檢測(cè)時(shí)，首先將制備好的金納米花免疫探針滴加在免疫探針結(jié)合墊，待干燥后再按照示意圖(圖1)的組裝方式進(jìn)行組裝，并將樣品滴加在樣品墊上，液體通過(guò)層析作用向吸水紙一端流過(guò)去，經(jīng)過(guò)t線時(shí)，未與樣品中的抗原結(jié)合的金納米花免疫探針與t線完全抗原結(jié)合，就會(huì)停留在t線，結(jié)果t線顯色，液體會(huì)繼續(xù)向前流走，當(dāng)經(jīng)過(guò)c線時(shí)，與樣品中抗原結(jié)合或者未結(jié)合的金納米花免疫探針都會(huì)與c線結(jié)合，直至飽和，結(jié)合的金標(biāo)探針會(huì)停留在c線，結(jié)果c線顯色。完整的顯色反應(yīng)過(guò)程需要10min左右。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、(1)本發(fā)明首次提出一種利用金納米花結(jié)合抗氟甲喹單克隆抗體檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條技術(shù)；

19、(2)利用本發(fā)明提供的金納米花免疫層析試紙條特異性檢測(cè)氟甲喹的最低視覺檢測(cè)限為1.5625ng/ml，不需要任何特殊儀器，且檢測(cè)時(shí)間只需要10min，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中最高的靈敏度要求。

技術(shù)特征：

1.一種分泌抗氟甲喹單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4，其特征在于：所述小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4已于2024年11月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為cgmcc?no.46134。

2.一種抗氟甲喹單克隆抗體，其特征在于：所述抗氟甲喹單克隆抗體由權(quán)利要求1所述的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4分泌產(chǎn)生。

3.權(quán)利要求1所述的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4或權(quán)利要求2所述的抗氟甲喹單克隆抗體在制備檢測(cè)氟甲喹的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

4.一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條，其特征在于：所述試紙條包括金納米花免疫探針，金納米花免疫探針由金納米花與抗氟甲喹單克隆抗體通過(guò)靜電吸附形成；所述抗氟甲喹單克隆抗體由權(quán)利要求1所述的小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4分泌產(chǎn)生。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金納米花免疫層析試紙條，其特征在于：所述抗氟甲喹單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：將小鼠雜交瘤細(xì)胞3b4注射以石蠟預(yù)致敏過(guò)的balb/c小鼠，收集腹水，純化即得抗氟甲喹單克隆抗體。

6.如權(quán)利要求4~5任一項(xiàng)所述的金納米花免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

7.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：封閉液的組成為：5wt%?bsa+1vol%tween-20。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：c線的劃線濃度為0.4mg/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：t線的劃線濃度為100μg/ml。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：抗氟甲喹單克隆抗體標(biāo)記的金納米花免疫探針的滴加量為1.75μl。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條及其制備方法。本發(fā)明篩選了一株小鼠雜交瘤細(xì)胞3B4，保藏編號(hào)為CGMCC?No.46134，采用該小鼠雜交瘤細(xì)胞3B4分泌得到抗氟甲喹單克隆抗體，并用該抗氟甲喹單克隆抗體制備金納米花免疫探針，最后制備得到檢測(cè)氟甲喹的金納米花免疫層析試紙條。本發(fā)明制備的金納米花免疫層析試紙條測(cè)定時(shí)間短且易于操作，成本低，具有優(yōu)異的特異性和靈敏度，可以簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)氟甲喹。

技術(shù)研發(fā)人員：汪世華,劉宇軒,凌素美,孫夢(mèng)晗,蔣康,李娜,李曉莉,袁軍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15