本發(fā)明涉及植物基因工程，特別是涉及蘋果c2h2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子mdzat1基因在花青苷合成中的應用。

背景技術(shù)：

1、蘋果作為我國重要的經(jīng)濟果樹之一，其種植面積以及產(chǎn)量均居首位，中國蘋果產(chǎn)業(yè)長足發(fā)展，但在總體上，產(chǎn)業(yè)競爭力較弱，果實的總體品質(zhì)欠佳。果實著色影響果實的外觀品質(zhì)，其主要取決于花青苷。花青苷使植物呈現(xiàn)不同的色彩，有助于吸引昆蟲或鳥類授粉，以及吸引動物傳播種子。花青苷還可以保護植物免受低溫、高光照、真菌和其他微生物的侵害。除了上述作用外，在營養(yǎng)價值方面，花青苷還可以作為一種天然抗氧化劑，來清潔細胞中的自由基和活性氧，對人類健康大有裨益。因此，開展蘋果花青素的研究具有十分重要的意義。

2、花青苷合成的直接前體為苯丙氨酸，苯丙氨酸合成為花青苷的途徑中有一系列酶的參與，將編碼參與該途徑的酶的基因稱為結(jié)構(gòu)基因，其又可以分為早期結(jié)構(gòu)基因和晚期結(jié)構(gòu)基因。其中早期結(jié)構(gòu)基因包含查爾酮合酶(chs)、查爾酮異構(gòu)酶(chi)和黃烷酮3-羥化酶(f3h)，而晚期結(jié)構(gòu)基因包括二氫黃酮4-還原酶(dfr)、花青苷合成酶(ans)和類黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(ufgt)?；ㄇ嘬盏暮铣啥际怯赊D(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，轉(zhuǎn)錄因子對花青苷合成的調(diào)控，大多數(shù)是通過調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達，來影響花青苷的生物合成的。目前研究較多的就是myb/bhlh/wd40(mbw)復合物。例如，在擬南芥中，gbmybf2可以通過下調(diào)結(jié)構(gòu)基因chs、f3h、ans和fls的表達來負向調(diào)節(jié)花青苷的生物合成；在蘋果中，同源的myb1、myb10和myba參與花青苷的生物合成，正向調(diào)控花青苷的積累。

3、c2h2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子與花青素的分子機理研究知之甚少。c2h2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的鋅指家族。越來越多研究表明，c2h2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子還參與花青苷的生物合成。例如，在擬南芥中，atzat6通過激活atdfr、atmyb12和atmyb111的轉(zhuǎn)錄促進其表達，來正向調(diào)節(jié)花青苷的生物合成。在梨中，c2h2型鋅指蛋白ppzat5，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過調(diào)節(jié)ppbbx18的表達來抑制花青苷的積累。此外，pbzat12可以上調(diào)pbdfr、pbans和pbufgt基因的表達，促進梨花青苷積累。在蘋果愈傷組織中，mdzat5可以激活花青苷生物合成相關(guān)基因的表達，促進花青苷的生物合成。前期研究發(fā)現(xiàn)，myb轉(zhuǎn)錄因子mdmyb114，可以促進愈傷組織中花青苷的積累。研究表明，mdmyb114可以激活花青苷相關(guān)基因mdans、mdufgt和mdgst的表達，不僅正向調(diào)節(jié)花青苷的生物合成，還調(diào)控花青苷的轉(zhuǎn)運。mdmyb114被認為是除mdmyb1之外的另一個重要的蘋果花青苷調(diào)節(jié)因子，發(fā)明人為了研究mdmyb114的上游調(diào)控機制，進行了酵母單雜篩庫試驗，篩選到一個c2h2型鋅指蛋白，命名為mdzat1，其是否會通過mdmyb114調(diào)控花青苷的生物合成有待進一步研究。

4、鑒于上述缺陷，本發(fā)明是經(jīng)過創(chuàng)作者長期的研究和實踐獲得的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供蘋果c2h2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子mdzat1基因在花青苷合成中的應用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，mdzat1基因與蘋果果實花青素合成呈負相關(guān)，這為蘋果果實外觀品質(zhì)的改良以及提高提供了理論基礎(chǔ)。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供蘋果c2h2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子mdzat1基因在以下任一項中的應用：

4、(1)在調(diào)控蘋果果實花色苷合成中的應用；

5、(2)在調(diào)控蘋果果實外觀品質(zhì)中的應用；

6、(3)在蘋果品種改良中的應用；

7、其中，所述mdzat1基因的核苷酸序列為如seq?id?no.1所示序列或其片段。

8、本發(fā)明還提供編碼所述mdzat1基因的蛋白在以下任一項中的應用：

9、(1)在調(diào)控蘋果果實花色苷合成中的應用；

10、(2)在調(diào)控蘋果果實外觀品質(zhì)中的應用；

11、(3)在蘋果品種改良中的應用。

12、本發(fā)明還提供包含所述mdzat1基因的載體在以下任一項中的應用：

13、(1)在調(diào)控蘋果果實花色苷合成中的應用；

14、(2)在調(diào)控蘋果果實外觀品質(zhì)中的應用；

15、(3)在蘋果品種改良中的應用。

16、本發(fā)明還提供包含所述載體的重組菌在以下任一項中的應用：

17、(1)在調(diào)控蘋果果實花色苷合成中的應用；

18、(2)在調(diào)控蘋果果實外觀品質(zhì)中的應用；

19、(3)在蘋果品種改良中的應用。

20、可選的是，所述mdzat1基因負調(diào)控蘋果果實花色苷合成。優(yōu)選的是，所述負調(diào)控包括：過表達所述mdzat1基因降低蘋果果實的花色苷合成量；以及沉默所述mdzat1基因提高蘋果果實花色苷的合成量。

21、本發(fā)明還提供一種抑制蘋果果實花色苷合成的方法，包括構(gòu)建所述重組菌，將所述重組菌轉(zhuǎn)入蘋果中過表達mdzat1基因的步驟，所述mdzat1基因的核苷酸序列為如seq?idno.1所示序列或其片段。

22、可選的是，所述片段包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的片段。

23、本發(fā)明還提供一種提高蘋果果實花色苷合成的方法，包括構(gòu)建所述重組菌，將所述重組菌轉(zhuǎn)入蘋果中抑制mdzat1基因表達的步驟，所述mdzat1基因的核苷酸序列為如seqid?no.1所示序列或其片段。

24、可選的是，所述片段包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的片段。

25、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

26、(1)本發(fā)明有利于從分子機制上闡明mdzat1基因在調(diào)控蘋果果皮花青苷合成的作用機理，為蘋果果皮花青苷積累的分子育種提供理論基礎(chǔ)和基因資源，為實施綠色農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發(fā)利用有利于降低農(nóng)業(yè)成本和實現(xiàn)環(huán)境友好。

27、(2)通過蘋果瞬時注射實驗、生理數(shù)據(jù)測定及基因表達分析表明：過表達mdzat1能夠顯著抑制果實著色，花青苷的含量與生物合成相關(guān)基因的相對表達量顯著下調(diào)，而沉默mdzat1能夠促進果實花青苷累積，花青苷的含量也顯著高于對照，花青苷生物合成相關(guān)基因的相對表達量有明顯的上調(diào)，說明mdzat1在抑制花青苷合成方面有明顯作用。

28、(3)本發(fā)明將mdzat1在蘋果愈傷組織中過表達，驗證其抑制花青苷生物合成的功能，轉(zhuǎn)基因愈傷組織與野生型相比，著色較淺，花青苷的含量低，并經(jīng)生物學功能驗證，表明本發(fā)明克隆的mdzat1與mdchi、mdans和mdmyb114基因相互作用抑制梨果皮花青苷生物合成的功能。

29、(4)可利用基因工程手段，將本發(fā)明的mdzat1基因?qū)牖ㄇ嘬蘸康偷奶O果品種中改良蘋果品種。

技術(shù)特征：

1.蘋果c2h2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子mdzat1基因在以下任一項中的應用：

2.編碼權(quán)利要求1中所述mdzat1基因的蛋白在以下任一項中的應用：

3.包含權(quán)利要求1中所述mdzat1基因的載體在以下任一項中的應用：

4.包含權(quán)利要求3中所述載體的重組菌在以下任一項中的應用：

5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的應用，其特征在于，所述mdzat1基因負調(diào)控蘋果果實花色苷合成。

6.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述負調(diào)控包括：過表達所述mdzat1基因降低蘋果果實的花色苷合成量；以及沉默所述mdzat1基因提高蘋果果實花色苷的合成量。

7.一種抑制蘋果果實花色苷合成的方法，其特征在于，包括構(gòu)建權(quán)利要求4中所述重組菌，將所述重組菌轉(zhuǎn)入蘋果中過表達mdzat1基因的步驟，所述mdzat1基因的核苷酸序列為如seq?id?no.1所示序列或其片段。

8.如權(quán)利要求7所述的抑制蘋果果實花色苷合成的方法，其特征在于，所述片段包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的片段。

9.一種提高蘋果果實花色苷合成的方法，其特征在于，包括構(gòu)建權(quán)利要求4中所述重組菌，將所述重組菌轉(zhuǎn)入蘋果中抑制mdzat1基因表達的步驟，所述mdzat1基因的核苷酸序列為如seq?id?no.1所示序列或其片段。

10.如權(quán)利要求9所述的提高蘋果果實花色苷合成的方法，其特征在于，所述片段包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的片段。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了蘋果C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子MdZAT1基因在花青苷合成中的應用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從蘋果中分離到的一個C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子MdZAT1基因，并通過實驗發(fā)現(xiàn)MdZAT1基因表達量與蘋果發(fā)育期果實花青苷含量呈負相關(guān)。在蘋果愈傷組織中過表達MdZAT1抑制花青苷的合成；在蘋果果皮中瞬時過表達和沉默實驗中發(fā)現(xiàn)MdZAT1是蘋果果皮花青苷積累的負調(diào)節(jié)劑。通過酵母單雜交、EMSA和雙熒光素酶實驗驗證了MdZAT1蛋白結(jié)合并負調(diào)控MdMYB114、MdCHI和MdANS。MdZAT1基因?qū)φ{(diào)控蘋果果實花色苷具有實際的應用價值，為蘋果果實外觀品質(zhì)的改善提供依據(jù)。

技術(shù)研發(fā)人員：姜生輝,霍文平,王鐘康,張玉剛,陳敏,劉莎莎,任艷雪,宋繼峰,陳奕州,徐小龍,侯鴻敏,徐吉花,孫曉紅,柏素花,董超華
受保護的技術(shù)使用者：青島農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15