本發(fā)明涉及以高親和力結合人和小鼠肝細胞生長因子(hgf)受體(也被稱為met)的抗體和抗原結合片段。該抗體和抗原結合片段是人和小鼠中met的激動劑，從而產(chǎn)生類似于hgf結合作用的分子和細胞效應。本發(fā)明還涉及抗體和抗原結合片段作為met激動劑的治療用途。

背景技術：

1、hgf是間充質來源的多效細胞因子，其介導包括細胞增殖、運動、分化和存活的生物功能特征性陣列。hgf受體，也被稱為met，由多種組織表達，多種組織包括：所有上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肌細胞、神經(jīng)元細胞、成骨細胞、造血細胞以及免疫系統(tǒng)的各種組分。

2、hgf和met信號傳導在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用，它可以引導前體細胞的遷移并決定細胞的存活或死亡。在成人中，hgf/met信號傳導通常是靜止的并且在傷口愈合和組織再生期間恢復。一些癌癥和腫瘤篡奪hgf/met信號傳導，以促進腫瘤在宿主生物體中的存活和增殖。因此，盡管成功有限，但抑制hgf-met軸已成為抗癌治療的流行靶標。

3、由于其在組織愈合和再生中的作用，重組hgf也已被研究用于治療許多病癥，包括：退行性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、代謝疾病和移植相關病癥。然而，重組hgf具有差的藥理學性質：它需要蛋白水解活化以具有生物活性；一旦激活，它具有極短的體內(nèi)半衰期；并且其工業(yè)制造復雜且昂貴。

4、已經(jīng)提出了以模擬hgf的方式激活met的激動性抗met抗體作為替代物。

5、已經(jīng)描述了至少部分模擬hgf活性的以下抗體：(i)3d6小鼠抗人met抗體(美國專利第6,099,841號)；(ii)5d5小鼠抗人met抗體(美國專利第5,686,292號)；(iii)no-23小鼠抗人met抗體(美國專利第7,556,804b2號)；(iv)b7人幼稚抗人met抗體(美國專利申請第2014/0193431a1號)；(v)do-24小鼠抗人met抗體(prat等人,mol?cell?biol.11,5954-5962,1991；prat等人,j?cell?sci.111,237-247,1998)；以及(vi)dn-30小鼠抗人met抗體(prat等人,mol?cell?biol.11,5954-5962,1991；prat等人,j?cell?sci.111,237-247,1998)。

技術實現(xiàn)思路

1、迄今為止產(chǎn)生的激動性抗met抗體，例如背景技術部分中描述的那些，經(jīng)常作為旨在識別拮抗性分子的過程的副產(chǎn)物而被獲得，并且未被明確設計成為治療用途的激動劑分子。此外，現(xiàn)有技術抗met抗體的最顯著限制是它們已在小鼠系統(tǒng)中產(chǎn)生(除了使用人幼稚噬菌體文庫識別的b7外)；結果，這些抗體不太可能展示與小鼠met發(fā)生的交叉反應性。即使與自身抗原的微小交叉反應性原則上是可能的，這些相互作用也通常具有非常低的親和力。

2、雖然沒有交叉反應性不是小鼠癌癥模型的關注(因為他們使用人異種移植物)，但是人和小鼠met之間的抗體的交叉反應性是再生醫(yī)學或非腫瘤學人疾病的臨床前小鼠模型的重要需求，這需要抗體在小鼠組織和細胞上發(fā)揮作用。

3、不僅需要激動性抗met抗體與小鼠met交叉反應以便在臨床前模型中評估抗體，而且還期望抗體以與其對人met的親和力相同或者相似的親和力結合小鼠met，以及抗體在小鼠系統(tǒng)中引發(fā)與其在人系統(tǒng)中引起的效果相同或相似的效果——否則在臨床前模型中進行的實驗將不能預測人的情況。如實施例中所證明的，現(xiàn)有技術的抗met激動性抗體都沒有表現(xiàn)出對小鼠met的親和力，并且當然現(xiàn)有技術抗體都沒有在小鼠和人系統(tǒng)中表現(xiàn)出相同或相似的結合和激動作用。

4、本技術提供了通過設計以高親和力結合人和小鼠met而制備的抗met激動性抗體。這些抗體：(i)在人和小鼠met生物系統(tǒng)中表現(xiàn)出激動活性——即它們誘導met信號傳導——一些具有與hgf相比相似或更高的效力；(ii)引發(fā)全譜的hgf誘導的生物活性，因此代表重組hgf的有效替代物；(iii)當與現(xiàn)有技術抗體直接比較時表現(xiàn)出優(yōu)秀的與小鼠met的結合；(iv)在低至1pm的濃度下表現(xiàn)出生物學上顯著的激動活性；(v)在小鼠中表現(xiàn)出數(shù)日的血漿半衰期，劑量為1μg/kg時已經(jīng)達到藥理學飽和濃度，這對于治療性抗體來說是非常低的；(vi)在急性腎損傷的小鼠模型中保持腎功能和腎完整性；(vii)在急性肝損傷小鼠模型中預防肝功能衰竭并且拮抗肝細胞損傷；(viii)在慢性肝損傷的小鼠模型中表現(xiàn)出抗纖維化、抗炎和促再生活性；(ix)在潰瘍性結腸炎的小鼠模型和炎性腸病的小鼠模型中預防體重減輕、減輕腸出血、保持結腸完整性、抑制炎癥并且促進上皮再生；(x)在i型糖尿病的小鼠模型中促進胰島素依賴性葡萄糖攝?。?xi)在ii型糖尿病的小鼠模型中克服胰島素抵抗；(xii)在非酒精性脂肪性肝炎(nash)的小鼠模型中改善脂肪肝、抑制纖維化并且恢復肝功能；(xiii)在糖尿病性潰瘍的小鼠模型中加速傷口愈合；(xiv)與褐家鼠(rattusnorvegicus)met和食蟹猴(macaca?fascicularis)met交叉反應，從而允許在申請首次人試驗之前需要的對這兩種脊椎動物進行毒理學和藥理學研究；(xv)識別在人、小鼠、大鼠和食蟹猴中保守的表位，從而在動物模型中提供更大的效用。

5、因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段以高親和力結合人met蛋白(hmet)，并且以高親和力結合小鼠met蛋白(mmet)，其中，所述抗體或其抗原結合片段是hmet激動劑和mmet激動劑。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段包含至少一個重鏈可變域(vh)和至少一個輕鏈可變域(vl)，其中，所述vh和vl域，當作為fab片段進行測試時，對hmet表現(xiàn)出1×10-3s-1至1×10-2s-1、任選地1×10-3s-1至6×10-3s-1的解離速率(通過biacore測得的k解離)，并且對mmet表現(xiàn)出1×10-3s-1至1×10-2s-1、任選地1×10-3s-1至6×10-3s-1的解離速率(通過biacore測得的k解離)。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段對hmet和mmet具有等同的親和力。

6、在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段誘導hmet的磷酸化，并且誘導mmet的磷酸化。在某些實施方式中，所述抗體或抗原結合片段以小于3.0nm、任選地小于2.0nm的ec50(通過磷酸化-met?elisa測得)誘導hmet的磷酸化，并且以小于3.0nm、任選地小于2.0n?m的ec50(通過磷酸化-met?elisa測得)誘導mmet的磷酸化。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段等同地誘導hmet和mmet的磷酸化。

7、在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段對hmet表現(xiàn)出高的磷酸化效力，并且對mmet表現(xiàn)出高的磷酸化效力。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段以小于1nm的ec50和/或至少80％的emax(以磷酸化met?elisa中hgf誘導激活的百分比表示)誘導hmet的磷酸化，并且以小于1nm的ec50和/或至少80％的emax(以磷酸化met?elisa中hgf誘導激活的百分比表示)誘導mmet的磷酸化。在某些替代實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段對hmet表現(xiàn)出低的磷酸化效力，并且對mmet表現(xiàn)出低的磷酸化效力。在某些這樣的實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段以1nm～5nm的ec50和/或60～80％的emax(以磷酸化metelisa中hgf誘導激活的百分比表示)誘導hmet的磷酸化，并且以1nm～5nm的ec50和/或60～80％的emax(以磷酸化met?elisa中hgf誘導激活的百分比表示)誘導mmet的磷酸化。

8、在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段在與人細胞接觸時誘導hgf樣細胞應答，并且在與小鼠細胞接觸時誘導hgf樣細胞應答。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段在與人細胞接觸時和在與小鼠細胞接觸時完全誘導hgf樣細胞應答。在某些實施方式中，hgf樣細胞應答的完全誘導在出現(xiàn)以下中的一者、任何兩者或全部情況時是可測量的：

9、(i)在細胞分散檢測中，當所述抗體或其抗原結合片段的濃度為0.1～1.0nm時，所述抗體或其抗原結合片段誘導與最大hgf誘導的分散相當?shù)募毎稚ⅲ?/p>

10、(ii)在抗凋亡細胞檢測中，所述抗體或其抗原結合片段表現(xiàn)出ec50小于hgf的ec50的1.1倍，和/或emax(作為非凋亡對照細胞的總atp含量的％被測量)大于對hgf觀察到的emax的90％；和/或

11、(iii)在分枝化形態(tài)發(fā)生檢測中，經(jīng)所述抗體處理的細胞表現(xiàn)出每個由相同(非零)濃度的hgf誘導的球狀體大于90％的分枝數(shù)

12、在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段在與人細胞接觸時和在與小鼠細胞接觸時部分誘導hgf樣細胞應答。在某些實施方式中，hgf樣細胞應答的部分誘導在出現(xiàn)以下(i)-(iii)的情況時是可測量的：

13、(i)在細胞分散檢測中，當所述抗體的濃度為1nm或更低時，所述抗體或其抗原結合片段誘導由0.1nm同源hgf誘導的至少25％的細胞分散；

14、(ii)在抗凋亡細胞檢測中，所述抗體或其抗原結合片段表現(xiàn)出ec50不大于hgf的ec50的7.0倍，和/或emax細胞存活率為對hgf觀察到的至少50％；和/或

15、(ii)在分枝化形態(tài)發(fā)生檢測中，經(jīng)所述抗體處理的細胞表現(xiàn)出每個由相同(非零)濃度的hgf誘導的球狀體至少25％的分枝數(shù)；

16、并且所述抗體或抗原結合片段不能完全誘導hgf樣細胞應答。

17、在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是hgf競爭劑。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段以不大于5nm的ic50和/或至少50％的imax與hhgf競爭結合hmet，并且以不大于5nm的ic50和/或至少50％的imax與mhgf競爭結合mmet。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段與hhgf和mhgf等同地競爭。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是完全hgf競爭劑。在某些這樣的實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段以小于2nm的ic50和/或大于90％的imax與hhgf競爭，并且以小于2nm的ic50和/或大于90％的imax與mhgf競爭。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是部分hgf競爭劑。在某些這樣的實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段以2～5nm的ic50和/或50％～90％的imax與hhgf競爭，并且以2～5nm的ic50和/或50％～90％的imax與mhgf競爭。

18、本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段可以表現(xiàn)出與猴來源的met如食蟹猴(macacacynomolgus)met的交叉反應性，并且可以表現(xiàn)出與大鼠來源的met(褐家鼠(rattusnorvegicus))的交叉反應性。

19、本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段可以結合人met的氨基酸殘基123至223的人met的表位(在整個文件中，人met的編號是指genbank序列x54559號)。還提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其可以結合人met的氨基酸224-311之間的人met的表位。還提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其可以結合人met的氨基酸314-372之間的人met的表位。還提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其可以結合人met的氨基酸546-562之間的人met的表位。

20、還提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其可以結合包含氨基酸殘基ile367的人met的表位。還提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其可結合包含人met的氨基酸殘基asp372的人met的表位。在某些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合包含人met的氨基酸殘基ile367和asp372的人met的表位。

21、還提供了本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其可結合包含人met的氨基酸殘基thr555的人met的表位。

22、本發(fā)明還提供了一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包括h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，所述輕鏈可變域包括l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，其中：

23、h-cdr1包含選自seq?id?no:2、9、16、23、30、37、44、51、58、65和72的氨基酸序列；

24、h-cdr2包含選自seq?id?no:4、11、18、25、32、39、46、53、60、67和74的氨基酸序列；

25、h-cdr3包含選自seq?id?no:6、13、20、27、34、41、48、55、62、69和76的氨基酸序列；

26、l-cdr1包含選自seq?id?no:79、86、93、100、107、114、121、128、135、142和149的氨基酸序列；

27、l-cdr2包含選自seq?id?no:81、88、95、102、109、116、123、130、137、144和151的氨基酸序列；并且

28、l-cdr3包含選自seq?id?no:83、90、97、104、111、118、125、132、139、146和153的氨基酸序列。

29、[71g2]在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包括h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，所述輕鏈可變域包括l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，其中：

30、h-cdr1包含seq?id?no:44所示的氨基酸序列；

31、h-cdr2包含seq?id?no:46所示的氨基酸序列；

32、h-cdr3包含seq?id?no:48所示的氨基酸序列；

33、l-cdr1包含seq?id?no:121所示的氨基酸序列；

34、l-cdr2包含seq?id?no:123所示的氨基酸序列；并且

35、l-cdr3包含seq?id?no:125所示的氨基酸序列。

36、[71g2]在一個這樣的實施方式中，所述抗體或片段的重鏈可變域包含seq?id?no:167的氨基酸序列，或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述輕鏈可變域包含seq?id?no:168的氨基酸序列，或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。

37、[71d6]在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包括h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，所述輕鏈可變域包括l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，其中：

38、h-cdr1包含seq?id?no:30所示的氨基酸序列；

39、h-cdr2包含seq?id?no:32所示的氨基酸序列；

40、h-cdr3包含seq?id?no:34所示的氨基酸序列；

41、l-cdr1包含seq?id?no:107所示的氨基酸序列；

42、l-cdr2包含seq?id?no:109所示的氨基酸序列；并且

43、l-cdr3包含seq?id?no:111所示的氨基酸序列。

44、[71d6]在一個這樣的實施方式中，所述抗體或抗原結合片段的重鏈可變域包含seq?id?no:163的氨基酸序列，或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述輕鏈可變域包含seq?id?no:164的氨基酸序列，或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。

45、[71g3]在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包括h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3，所述輕鏈可變域包括l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，其中：

46、h-cdr1包含seq?id?no:9所示的氨基酸序列；

47、h-cdr2包含seq?id?no:11所示的氨基酸序列；

48、h-cdr3包含seq?id?no:13所示的氨基酸序列；

49、l-cdr1包含seq?id?no:86所示的氨基酸序列；

50、l-cdr2包含seq?id?no:88所示的氨基酸序列；并且

51、l-cdr3包含seq?id?no:90所示的氨基酸序列。

52、[71g3]在一個實施方式中，所述抗體或抗原結合片段的重鏈可變域包含seq?idno:157的氨基酸序列，或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列；并且所述輕鏈可變域包含seq?id?no:158的氨基酸序列，或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。

53、在另外實施方式中，本發(fā)明提供了一種抗體或抗原結合片段，其包含含有h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3的重鏈可變域和含有l(wèi)-cdr1、l-cdr2和l-cdr3的輕鏈可變域，其中，h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3選自表3中所示的fab的一組cdr(cdr1、cdr2和cdr3)，并且l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3是表4中所示的相同fab的相應cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。

54、在某些實施方式中，抗體或抗原結合片段的重鏈可變域包含表5的vh氨基酸序列或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列，并且輕鏈可變域包含表5中的相應vl氨基酸序列或與其至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。

55、vh域的氨基酸序列表現(xiàn)出與限定的vh域氨基酸序列(例如seq?id?no:x)小于100％序列同一性的實施方式盡管可以包含與seq?id?no:x的vh的hcdr1、hcdr2和hcdr3相同的重鏈cdr，但是在骨架區(qū)內(nèi)表現(xiàn)出氨基酸序列變異。例如，骨架區(qū)的一個或多個氨基酸殘基可被在由人種系編碼的人vh域中的等同位置中出現(xiàn)的氨基酸殘基所取代。同樣地，vl域的氨基酸序列表現(xiàn)出與限定的vl域氨基酸序列(例如seq?id?no:y)小于100％序列同一性的實施方式盡管可以包含與seq?id?no:y的vh的lcdr1、lcdr2和lcdr1相同的輕鏈cdr，但是在骨架區(qū)內(nèi)表現(xiàn)出氨基酸序列變異。例如，骨架區(qū)的一個或多個氨基酸殘基可被在由人種系編碼的人vl域中的等同位置中出現(xiàn)的氨基酸殘基所取代。

56、本發(fā)明還提供了抗體和抗原結合片段，其包含前述抗體的vh和vl域的人源化/種系變體，和親和變體以及如本文所定義的保守氨基酸取代的變體。具體提供了嵌合抗體，其含有上述大羊駝衍生的fab的vh和vl域，或其與人抗體(特別是人igg1、igg2、igg3或igg4)的恒定域融合的人種系變體。前述抗體的重鏈和輕鏈可變域，或其種系變體、親和變體或其保守變體可被包括于常規(guī)四鏈抗體或其他抗原結合蛋白，例如fab、fab'、f(ab')2、雙特異性fab、和fv片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、單鏈可變片段(scfv)和多特異性抗體。重鏈可變域或其種系變體、親和變體或其保守變體也可被用作單域抗體。

57、在另外方面中，本發(fā)明還提供了：一種分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段；一種表達載體，其包含與調(diào)節(jié)序列可操作地連接的所述多核苷酸，所述調(diào)節(jié)序列允許所述抗體或其抗原結合片段在宿主細胞或無細胞表達系統(tǒng)中表達；以及一種宿主細胞或無細胞表達系統(tǒng)，其含有所述表達載體。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)重組抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在允許表達所述抗體或抗原結合片段的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞或無細胞表達系統(tǒng)并且回收表達的抗體或抗原結合片段。

58、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體或抗原結合片段和至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑。

59、在另一方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體或抗原結合片段或本發(fā)明的藥物組合物在治療中的應用。

60、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種治療或預防人患者肝損傷的方法，所述肝損傷任選為急性肝損傷或慢性肝損傷，所述方法包括向有需要的患者給藥治療有效量的met激動劑抗體。在某些實施方式中，met激動劑抗體是根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段。

61、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種治療或預防人患者腎損傷的方法，所述腎損傷任選為急性腎損傷，所述方法包括向有需要的患者給藥治療有效量的met激動劑抗體。在某些實施方式中，met激動劑抗體是根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段。

62、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種治療或預防人患者炎性腸病的方法，所述炎性腸病任選為潰瘍性結腸炎，所述方法包括向有需要的患者給藥治療有效量的met激動劑抗體。在某些實施方式中，met激動劑抗體是根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段。

63、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種治療或預防人患者糖尿病的方法，所述糖尿病任選為i型或ii型糖尿病，所述方法包括向有需要的患者給藥治療有效量的met激動劑抗體。在某些實施方式中，met激動劑抗體是根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段。

64、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種治療或預防人患者非酒精性脂肪性肝炎的方法，所述方法包括向有需要的患者給藥治療有效量的met激動劑抗體。在某些實施方式中，met激動劑抗體是根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段。

65、在另一方面中，本發(fā)明提供了一種治療或促進人患者傷口愈合的方法，所述人患者任選為患有糖尿病的患者，所述方法包括向有需要的患者給藥治療有效量的met激動劑抗體。在某些實施方式中，met激動劑抗體是根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗原結合片段。