本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、心肌纖維化是一種常見(jiàn)的心臟疾病病理過(guò)程，其特征是心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular?matrix,ecm)的異常積累，導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮活動(dòng)受損，并最終引發(fā)心力衰竭。心臟成纖維細(xì)胞(cardiac?fibroblasts,cfbs)在纖維化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們可以被激活并轉(zhuǎn)化為心肌成纖維細(xì)胞，分泌大量異常的ecm成分，改變ecm的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能。然而，目前對(duì)心肌纖維化的研究受限于缺乏能夠準(zhǔn)確模擬體內(nèi)病理過(guò)程的體外模型。

2、心臟類器官模型是通過(guò)體外培養(yǎng)ipscs或其他干細(xì)胞，模擬心臟發(fā)育過(guò)程形成的三維結(jié)構(gòu)，能夠再現(xiàn)心臟的關(guān)鍵特征和生理功能。這種模型為研究心臟發(fā)育、疾病機(jī)制及藥物篩選提供了有力的工具。然而，如何在心臟類器官模型中實(shí)現(xiàn)特定基因的時(shí)空特異性調(diào)控，特別是如何高效、穩(wěn)定地誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中基因過(guò)表達(dá)，是當(dāng)前面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)。

3、piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一種目前常用的哺乳動(dòng)物基因工程研究工具，具有插入并精確切離靶位點(diǎn)特性，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因及功能基因研究中。通過(guò)piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，可以將外源基因整合至基因組中，實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。這一特性使得piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)成為構(gòu)建可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的理想工具。目前未見(jiàn)基于piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)形成的成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型構(gòu)建的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，通過(guò)piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建質(zhì)粒，建立可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的ipscs細(xì)胞系，再結(jié)合ipscs定向分化構(gòu)建了心臟類器官模型，為實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌纖維化機(jī)制的深入研究提供了有力工具。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

4、基于piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的ipscs穩(wěn)定細(xì)胞系；

5、將所述ipscs穩(wěn)定細(xì)胞系定向分化為心臟成纖維細(xì)胞，得到ipscs來(lái)源的心臟成纖維細(xì)胞；

6、將所述ipscs來(lái)源的心臟成纖維細(xì)胞和ipscs來(lái)源的心肌細(xì)胞球共培養(yǎng)形成類器官，再用多西環(huán)素誘導(dǎo)，得到成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型。

7、可選的是，所述定向分化包括以下步驟：

8、將所述ipscs穩(wěn)定細(xì)胞系誘導(dǎo)分化為心臟祖細(xì)胞；

9、將所述心臟祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心外膜細(xì)胞；

10、將所述心外膜細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心臟成纖維細(xì)胞。

11、可選的是，所述ipscs穩(wěn)定細(xì)胞系誘導(dǎo)分化為心臟祖細(xì)胞包括以下步驟：

12、將ipscs穩(wěn)定細(xì)胞系消化成單個(gè)細(xì)胞后，再按照7×105cells/皿的密度接種培養(yǎng)；

13、待細(xì)胞密度達(dá)到80％-90％時(shí)，加入含有g(shù)sk3抑制劑的rpmi/b27?minus?insulin，靜置培養(yǎng)2天；其中，第2天更換為不含gsk3抑制劑的rpmi/b27?minus?insulin；

14、培養(yǎng)至第3天時(shí)，更換為含有wnt抑制劑的rpmi/b27?minus?insulin進(jìn)行培養(yǎng)；

15、培養(yǎng)至第5天，更換為不含wnt抑制劑的rpmi/b27?minus?insulin進(jìn)行培養(yǎng)，獲得所述心臟祖細(xì)胞；

16、所述rpmi/b27?minus?insulin培養(yǎng)基為含1×b27?minus?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基。

17、可選的是，所述心臟祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心外膜細(xì)胞包括以下步驟：

18、將培養(yǎng)5天所得的心臟祖細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞后，按照2×104cells/cm2的密度接種在matrigel包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，在第6天更換為含有5μm?gsk3抑制劑、2μm視黃酸、1％胎牛血清的advanced?dmem/glutamax培養(yǎng)基培養(yǎng)；

19、培養(yǎng)至第9天時(shí)，更換為advanceddmem/glutamax培養(yǎng)基培養(yǎng)；

20、培養(yǎng)至第11天時(shí)，更換為含有2μm?tgfβ抑制劑的advanced?dmem/glutamax培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

21、培養(yǎng)至第12天及以后，每隔一天更換一次含有2μm?tgfβ抑制劑的advanced?dmem/glutamax培養(yǎng)基，直到得到所述心外膜細(xì)胞；

22、所述advanced?dmem/glutamax培養(yǎng)基為含1×glutamax的advanced?dmem培養(yǎng)基。

23、可選的是，所述心外膜細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心臟成纖維細(xì)胞包括以下步驟：

24、將培養(yǎng)13天得到的所述心外膜細(xì)胞進(jìn)行消化，按照1×104cells/cm2的密度接種在matrigel包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，在第14天更換為含有20ng/l?fgf?2和10μm?tgfβ抑制劑的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

25、培養(yǎng)至第16天，更換新鮮的含有20ng/mlfgf?2和10μm?tgfβ抑制劑的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

26、培養(yǎng)至第18天，再次消化細(xì)胞并以1×104cells/cm2的相同密度重新接種，繼續(xù)培養(yǎng)；

27、培養(yǎng)至第20天及以后，每隔一天更換含有10μm?tgfβ抑制劑的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，直到獲得ipscs來(lái)源的心臟成纖維細(xì)胞。所述tgfβ抑制劑包括但不限于sb431542。

28、可選的是，所述ipscs來(lái)源的心肌細(xì)胞球是將ipscs細(xì)胞系進(jìn)行懸浮、培養(yǎng)得到細(xì)胞球，所述細(xì)胞球再定向分化得到；

29、其中，以ipscs細(xì)胞系進(jìn)行3d懸浮培養(yǎng)得到ipsc細(xì)胞球階段作為第-8至-1天；以3dipsc細(xì)胞球懸浮液培養(yǎng)開(kāi)始誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞球的當(dāng)天作為第0天；

30、懸浮培養(yǎng)用的3d?ipsc培養(yǎng)基為含10μm?rock抑制劑的tesr-aof?3d培養(yǎng)基。

31、可選的是，所述ipscs細(xì)胞球定向誘導(dǎo)分化得到的心肌細(xì)胞球，包括以下步驟：

32、第0天，將所述細(xì)胞球懸浮液接種于含有10μm?y27632、6μm?chir99021和b27minus?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

33、第1天，更換為新鮮的含有1×b27?minus?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

34、第3天，將培養(yǎng)基的一半更換為含有10μm?wnt抑制劑和1×b27?minus?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

35、第5天，將培養(yǎng)基更換為含有1×b27?minus?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

36、第7天，將培養(yǎng)基更換為含有1×b27?with?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

37、第9天，將培養(yǎng)基更換為不含葡萄糖的rpmi?1640培養(yǎng)基，并添加0.12％的dl-乳酸鈉進(jìn)行純化；

38、在第12天及之后，將培養(yǎng)基更換為含1×b27?with?insulin的rpmi?1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換一半培養(yǎng)基，獲取所述ipscs來(lái)源的心肌細(xì)胞球。

39、可選的是，所述心臟類器官模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：將心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及所述ipscs來(lái)源的心臟成纖維細(xì)胞混合接種培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每2天吸出3/4培養(yǎng)基后再加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)得到類器官；

40、培養(yǎng)至第7天以及以后，將所述類器官轉(zhuǎn)移到低粘附的培養(yǎng)板中搖床培養(yǎng)，每4-7天更換一次培養(yǎng)基，直至所述類器官達(dá)到成熟狀態(tài)，即形成所述心臟類器官模型。

41、可選的是，所述心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及ipscs來(lái)源的心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞含量配比為4：2：1：1；和/或所述培養(yǎng)基包括1mlb27?with?insulin+1ml胎牛血清+0.5ml抗生素抗霉菌溶液+25μl?vegf+25μl?fgf?2+0.5ml?glutamax+46.95ml?dmem/f-12。

42、本發(fā)明還提供所述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的成纖維細(xì)胞中可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型在如下任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

43、(1)在心肌纖維化相關(guān)病理機(jī)制的基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用；

44、(2)在構(gòu)建心肌纖維化疾病治療及預(yù)防藥物研究的細(xì)胞模型中的應(yīng)用。

45、本發(fā)明公開(kāi)了以下技術(shù)效果：

46、(1)本發(fā)明采用了piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了目的基因在ipscs細(xì)胞中的高效、穩(wěn)定整合和表達(dá)。與傳統(tǒng)的病毒載體系統(tǒng)相比，piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有更高的安全性和可操作性，避免了病毒制備復(fù)雜、安全風(fēng)險(xiǎn)高、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。

47、(2)通過(guò)多西環(huán)素(doxycycline,dox)響應(yīng)元件和多西環(huán)素反式激活因子的組合使用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)成纖維細(xì)胞中目的基因的時(shí)空特異性過(guò)表達(dá)調(diào)控。這種調(diào)控方式不僅能夠在心臟類器官模型中精確模擬心肌纖維化病理過(guò)程，還能夠?yàn)檠芯科渌呐K疾病提供有力工具。

48、(3)利用構(gòu)建的心臟類器官模型，能夠深入探究特定基因過(guò)表達(dá)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖、分化及胞外基質(zhì)產(chǎn)生等功能的影響，為揭示心肌纖維化機(jī)制提供新視角。同時(shí)，該模型還能夠用于研究其他與心肌纖維化相關(guān)的基因和信號(hào)通路。

49、(4)心臟類器官模型可用于篩選針對(duì)心肌纖維化的潛在藥物靶點(diǎn)，評(píng)估藥物對(duì)心肌纖維化的治療效果。這種模型具有高度的生理相關(guān)性和可預(yù)測(cè)性，能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)新的治療策略提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

50、綜上所述，本發(fā)明提供了一種高效、穩(wěn)定、可誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)的心臟類器官模型的構(gòu)建方法及其在心肌纖維化研究中的應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的科學(xué)價(jià)值。該方法的成功實(shí)施，不僅有助于深入理解心肌纖維化的分子機(jī)制，還能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)新的治療策略提供有力支持。