本發(fā)明涉及生物分離，尤其是涉及一種酒酒球菌胞外囊泡的提取方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、葡萄酒釀造初始階段，葡萄中的糖類經(jīng)由一種或多種酵母菌株(特別是釀酒酵母)發(fā)酵形成酒精。酒精發(fā)酵結(jié)束后發(fā)生蘋果酸-乳酸發(fā)酵(mlf)，雖然這個過程有時會更早發(fā)生。蘋果酸是葡萄中主要有機酸之一，其含量約為3-5g/l。葡萄酒中蘋果酸的存在會顯著影響葡萄酒的酸度、ph以及口感，同時蘋果酸也是幾種腐敗菌的營養(yǎng)來源之一。蘋果酸-乳酸發(fā)酵是提高葡萄酒感官品質(zhì)的關(guān)鍵過程，該過程是釀酒乳酸菌(大部分是酒酒球菌)通過蘋果酸-乳酸酶將酒體中酸澀感較強的l-蘋果酸通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為口感較柔和的l-乳酸，同時釋放出co2的過程。該過程不僅可以改善酒體風味，包括口感、香氣，還可以避免一些腐敗酵母菌利用l-蘋果酸繁殖生長，從而提高酒體的穩(wěn)定性。此外，mlf還有助于其他代謝物的產(chǎn)生，如乳酸乙酯、2,3-丁二醇、丙烯醛、雙乙酰等，豐富了葡萄酒中的萜類、醇類、多酚類等物質(zhì)。

2、酒酒球菌(oenococcus?oeni，o.oeni)是最常用的蘋果酸-乳酸發(fā)酵菌，在葡萄酒生產(chǎn)過程中發(fā)揮重要作用。第一，酒酒球菌可以產(chǎn)生細菌素抑制雜菌生長，提高酒體微生物穩(wěn)定性。第二，酒酒球菌可以改善葡萄酒酸度，該菌通過分解二元酸蘋果酸產(chǎn)生一元酸乳酸提高酒體ph。酒環(huán)境脅迫因素如乙醇、低ph、so2和低溫是影響酒酒球菌進行mlf的主要因素。目前許多研究都集中在酒酒球菌脅迫應(yīng)答機制方面，例如菌體完整性、胞內(nèi)ph穩(wěn)定、核酸與蛋白質(zhì)修復(fù)、應(yīng)激蛋白、胞外多糖合成(eps)等方面。另有研究表明，在發(fā)酵的葡萄汁中接種具有生物膜特性的酒酒球菌和浮游酒酒球菌，結(jié)果顯示生物膜可以顯著提高菌體對葡萄酒脅迫的耐受性以及蘋果酸乳酸發(fā)酵速率。因此，探索酒酒球菌生物膜的產(chǎn)生機制，有助于酒酒球菌脅迫耐受機制的研究。

3、胞外囊泡(evs)是細菌在生長過程中從細胞膜向細胞外空間分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的納米級囊泡體。evs是細菌的一種分泌和遞送系統(tǒng)，對細菌的生存不可或缺。evs可通過群體感應(yīng)以及清除有害物質(zhì)的方式增強細菌的防御和抵抗能力；evs可作為胞外dna的成核位點或通過提供有益的蛋白質(zhì)來促進生物膜的形成；evs還可以作為有效平臺為細菌、蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)以及胞外多糖之間相互作用提供便利?？傮w來說，胞外囊泡是復(fù)雜的、功能豐富的納米粒子，在細胞間通信、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細胞遷移和腫瘤生物學等多個領(lǐng)域都有關(guān)鍵作用，與其來源細胞的功能和狀態(tài)密切相關(guān)。它們能夠影響目標細胞的功能，傳遞生物活性分子，并調(diào)控細胞間的信號傳導(dǎo)。目前還缺少從釀酒乳酸菌中獲得evs的方法，也沒有將脅迫調(diào)控處理用于提高蘋果酸-乳酸發(fā)酵菌evs產(chǎn)量的相關(guān)報道。

4、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的在于提供一種酒酒球菌胞外囊泡的提取方法，以解決上述技術(shù)問題。

2、本發(fā)明的第二目的在于提供上述提取方法提取得到的酒酒球菌胞外囊泡在提高酒酒球菌耐酸和乙醇脅迫中的應(yīng)用。

3、為了實現(xiàn)以上目的，特采用以下技術(shù)方案：

4、第一方面，本發(fā)明提供了一種酒酒球菌胞外囊泡的提取方法，包括如下步驟：

5、a.將酒酒球菌的發(fā)酵液以1000～2000×g的離心力進行第一次離心，去除大部分菌體，收集獲得第一上清液，然后將上清液以10000～20000×g的離心力進行第二次離心，去除剩余的菌體和菌體碎片，收集獲得第二上清液；

6、b.將a步驟獲得的第二上清液進行切向流超濾膜包濃縮，然后采用緩沖液稀釋后再次進行切向流超濾膜包濃縮，獲得濃縮液；所述切向流超濾膜包的截留分子量小于酒酒球菌胞外囊泡的最小直徑；

7、c.將b步驟獲得的濃縮液進行濾膜過濾，收集濾液；所述濾膜的截留分子量大于酒酒球菌胞外囊泡的最大直徑；

8、d.將c步驟收集的濾液以100000～150000×g的離心力進行第一次離心，獲得初步純化的胞外囊泡，然后將初步純化的胞外囊泡采用緩沖液重懸后以100000～150000×g的離心力進行第二次離心，獲得純化后的胞外囊泡。

9、作為進一步技術(shù)方案，a步驟中，所述第一次離心的時間為5～10min，第二次離心的時間為5～10min。

10、作為進一步技術(shù)方案，所述切向流超濾膜包的截留分子量為100kda。

11、作為進一步技術(shù)方案，b步驟中，所述采用緩沖液稀釋為采用與第一次切向流超濾膜包濃縮液等體積的緩沖液稀釋；

12、b步驟中，所述緩沖液包括pbs緩沖液；

13、b步驟中，第一次切向流超濾膜包濃縮20倍，第二次切向流超濾膜包濃縮至體積不變。

14、作為進一步技術(shù)方案，c步驟中，所述濾膜的孔徑為0.45μm。

15、作為進一步技術(shù)方案，d步驟中，所述第一次離心的時間為1.5～2.5h，第二次離心的時間為1.5～2.5h；

16、d步驟中，所述緩沖液包括pbs緩沖液。

17、作為進一步技術(shù)方案，提取的溫度為0～4℃。

18、作為進一步技術(shù)方案，所述酒酒球菌的發(fā)酵液為將酒酒球菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期的液體。

19、作為進一步技術(shù)方案，采用含有乙醇的酒酒球菌培養(yǎng)基對酒酒球菌進行培養(yǎng)，獲得酒酒球菌的發(fā)酵液；所述乙醇的濃度在8％(v/v)以內(nèi)；

20、或者，采用ph為3.5～4.8的酒酒球菌培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，獲得酒酒球菌的發(fā)酵液。

21、第二方面，本發(fā)明提供了上述提取方法提取得到的酒酒球菌胞外囊泡在提高酒酒球菌耐酸和乙醇脅迫中的應(yīng)用。

22、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

23、本發(fā)明提供的酒酒球菌胞外囊泡的提取方法，首先將酒酒球菌的發(fā)酵液在特定離心力下進行兩次離心，以去除菌體及其碎片，避免因菌體黏附而導(dǎo)致胞外囊泡的產(chǎn)量降低；然后依次通過兩次切向流超濾膜包濃縮和濾膜過濾以充分去除直徑大于或者小于胞外囊泡的雜質(zhì)；再經(jīng)過兩次超離心分離純化處理后，得到酒酒球菌胞外囊泡。該提取純化方法簡單、高效、成本低，不會破壞胞外囊泡的結(jié)構(gòu)，提取得到的酒酒球菌胞外囊泡純度高。

24、此外，經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，將酒酒球菌培養(yǎng)過程中對其進行酸或乙醇脅迫，能夠進一步提高胞外囊泡的提取產(chǎn)量，因此，將酸或乙醇脅迫培養(yǎng)液用于胞外囊泡的提取，有助于進一步提高酒酒球菌胞外囊泡的產(chǎn)量。

技術(shù)特征：

1.一種酒酒球菌胞外囊泡的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，a步驟中，所述第一次離心的時間為5～10min，第二次離心的時間為5～10min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述切向流超濾膜包的截留分子量為100kda。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，b步驟中，所述采用緩沖液稀釋為采用與第一次切向流超濾膜包濃縮液等體積的緩沖液稀釋；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，c步驟中，所述濾膜的孔徑為0.45μm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，d步驟中，所述第一次離心的時間為1.5～2.5h，第二次離心的時間為1.5～2.5h；

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，提取的溫度為0～4℃。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述酒酒球菌的發(fā)酵液為將酒酒球菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期的液體。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，采用含有乙醇的酒酒球菌培養(yǎng)基對酒酒球菌進行培養(yǎng)，獲得酒酒球菌的發(fā)酵液；所述乙醇的濃度在8％(v/v)以內(nèi)；

10.權(quán)利要求1～9任一項所述的提取方法提取得到的酒酒球菌胞外囊泡在提高酒酒球菌耐酸和乙醇脅迫中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種酒酒球菌胞外囊泡的提取方法及應(yīng)用，涉及生物分離技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的酒酒球菌胞外囊泡的提取方法，首先將酒酒球菌的發(fā)酵液在特定離心力下進行兩次離心，以去除菌體及菌體碎片，避免因菌體黏附而導(dǎo)致胞外囊泡的產(chǎn)量降低；然后依次通過兩次切向流超濾膜包濃縮和濾膜過濾以充分去除直徑大于或者小于胞外囊泡的雜質(zhì)；再經(jīng)過兩次超離心分離純化處理后，得到酒酒球菌胞外囊泡。該提取方法簡單、高效、成本低，不會破壞胞外囊泡的結(jié)構(gòu)，提取得到的酒酒球菌胞外囊泡純度高。

技術(shù)研發(fā)人員：楊昆,朱揚,張國強,戴賢君
受保護的技術(shù)使用者：中國計量大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15