本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種水凝膠微孔陣列及其模具和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傳統(tǒng)的動(dòng)物來(lái)源細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式是二維細(xì)胞培養(yǎng)。利用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔板培養(yǎng)細(xì)胞，產(chǎn)生的一大問(wèn)題是細(xì)胞停留在一個(gè)平面上貼壁生長(zhǎng)。這樣的培養(yǎng)模式改變了其原來(lái)的在動(dòng)物體內(nèi)的三維生長(zhǎng)模式，缺乏細(xì)胞在三維環(huán)境中才能獲得的各種生化和機(jī)械信號(hào)，不能很好地模擬細(xì)胞原本的體內(nèi)生長(zhǎng)微環(huán)境，造成了細(xì)胞本身的生物學(xué)性質(zhì)及行為的改變，故利用該模式培養(yǎng)的細(xì)胞得到的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果無(wú)法令人信服。

2、三維細(xì)胞培養(yǎng)更貼近細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的真實(shí)狀態(tài)，這種培養(yǎng)模式可以形成具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞微球，在這種模式下，細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞之間以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，獲得二維培養(yǎng)模式下無(wú)法獲得的各種生化及機(jī)械信號(hào)，以維持正常生物學(xué)表型。研究表明，細(xì)胞-細(xì)胞之間以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用對(duì)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移均具有重要意義。而細(xì)胞微球可以大部分重建細(xì)胞與外界環(huán)境之間的相互作用，因此能夠更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境，使其在基因表達(dá)及功能等方面更接近于體內(nèi)細(xì)胞。三維細(xì)胞微球在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究、藥物篩選及生物工程等領(lǐng)域受到極大關(guān)注，亟需易操作的、可實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的、能控制微球的位置和大小的三維細(xì)胞微球制備方法和技術(shù)。

3、獲得細(xì)胞微球有多個(gè)手段，包括使用超低吸附培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)、懸滴板、不粘附涂層法、水凝膠微孔陣列系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、磁懸浮和磁性3d生物打印。懸滴法雖在細(xì)胞微球的大小和位置的控制上具有優(yōu)勢(shì)，但步驟繁瑣，難以進(jìn)行大量制備。懸浮培養(yǎng)和不粘附涂層法雖可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微球的大量制備，但因細(xì)胞微球分布寬的問(wèn)題限制了其應(yīng)用。水凝膠微孔陣列系統(tǒng)制作成本相對(duì)較低，并且憑借其優(yōu)于旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、磁懸浮和磁性3d生物打印的易操作性，優(yōu)于超低吸附培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板、懸滴板的高重復(fù)利用率，逐漸被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室選擇使用。

4、當(dāng)前，隨著時(shí)間成本效益受到更大重視，高通量成了研究人員關(guān)注的一大要點(diǎn)，包括高通量成像技術(shù)。其中，能夠滿足高通量實(shí)驗(yàn)需求的高內(nèi)涵成像儀器需要匹配的成像專用玻璃底孔板，以達(dá)到高內(nèi)涵儀器鏡頭的工作需求。

5、動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞常常直接植于超低吸附孔板內(nèi)使之成球，但孔中形成的細(xì)胞微球的數(shù)量、位置、大小均無(wú)法進(jìn)行人為控制。高內(nèi)涵專用孔板缺少低吸附性，不利于細(xì)胞微球的形成，這也阻礙了高內(nèi)涵成像在細(xì)胞微球高通量成像方面的應(yīng)用。

6、當(dāng)前解決上述問(wèn)題的主要手段是通過(guò)定制的微球培養(yǎng)專用孔板和利用專用陽(yáng)模制作水凝膠微孔陣列系統(tǒng)。專用孔板造價(jià)高，且重復(fù)利用率低下，無(wú)法很好的滿足當(dāng)前研究對(duì)高通量成像的要求，例如sun?bioscience的gri3d??microwell?plates、stemcell的aggrewell??microwell?plate。商品化的專用陽(yáng)模同樣具有成本高的缺點(diǎn)，例如microtissues?inc.的3d?petri?dish?。自研陽(yáng)模雖可以解決成本高的問(wèn)題，但無(wú)法很好的應(yīng)用于適合更高通量成像的96孔板，例如多篇文獻(xiàn)（1-3）中所提到的模具；此外，制作水凝膠微孔陣列的過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)且對(duì)操作者的操作要求高，重復(fù)性差。以上現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案，均難以用于數(shù)量、位置及大小可控的細(xì)胞微球及類器官的三維形成和培養(yǎng)，進(jìn)而難以用于高質(zhì)量的高內(nèi)涵成像。

7、參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種水凝膠微孔陣列及其模具和應(yīng)用，可用于數(shù)量、位置及大小可控的細(xì)胞微球及類器官的三維形成和培養(yǎng)，進(jìn)而用于高質(zhì)量的高內(nèi)涵成像。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種水凝膠微孔陣列制備模具，包括底座和與底座連接的多個(gè)柱體，每個(gè)柱體的頂部設(shè)置有多個(gè)微柱和多個(gè)支撐柱；

4、所述微柱的特征尺寸為0.4~0.6mm，高為0.7~0.8mm；

5、所述支撐柱直徑為0.7~0.9mm，高為2.5~3mm。

6、優(yōu)選的，所述支撐柱位于微柱外圍。

7、優(yōu)選的，相鄰兩個(gè)微柱中心的距離為0.8~1.2mm。

8、優(yōu)選的，所述微柱的俯視圖形狀包括圓形、正方形、六邊形、八邊形或十一邊形；

9、對(duì)于圓形微柱，所述特征尺寸指直徑；

10、對(duì)于正方形微柱，所述特征尺寸指邊長(zhǎng)；

11、對(duì)于六邊形、八邊形或十一邊形微柱，所述特征尺寸指最小外接圓直徑；

12、所述多個(gè)微柱在柱體頂部呈3*3陣列。

13、優(yōu)選的，所述柱體的高度為14~15mm；

14、所述底座上，相鄰兩個(gè)柱體中心的距離為8~10mm；

15、所述多個(gè)柱體在底座呈6*10陣列。

16、優(yōu)選的，所述模具的材料包括樹(shù)脂材料、金屬材料、有機(jī)硅材料或復(fù)合材料。

17、所述樹(shù)脂材料包括聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、高沖擊聚苯乙烯、丙烯腈-苯乙烯-丙烯酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰胺、聚碳酸酯-丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯酰胺樹(shù)脂等。

18、本發(fā)明還提供了一種水凝膠微孔陣列，由上述水凝膠微孔陣列制備模具模制得到，模具中的微柱模制形成陣列微孔。

19、優(yōu)選的，所述水凝膠微孔陣列的水凝膠材料包括瓊脂糖、阿拉伯膠、黃原膠、葡甘露聚糖、卡拉膠、刺槐豆膠、褐藻膠、褐藻糖膠、木聚糖、甘露聚糖或半乳甘露聚糖中的一種或幾種。

20、本發(fā)明還提供了上述水凝膠微孔陣列在用于細(xì)胞微球或類器官高內(nèi)涵成像中的應(yīng)用。

21、優(yōu)選的，所述高內(nèi)涵成像包括以下步驟：

22、將細(xì)胞置于陣列微孔中，形成細(xì)胞微球或類器官；

23、將水凝膠微孔陣列進(jìn)行高內(nèi)涵成像，得到圖像結(jié)果；

24、所述細(xì)胞為人正常組織來(lái)源的細(xì)胞、人轉(zhuǎn)化細(xì)胞、人腫瘤細(xì)胞、動(dòng)物正常組織來(lái)源的細(xì)胞、動(dòng)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞與其他類型細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)、人原代腫瘤細(xì)胞、人原代腫瘤細(xì)胞與其他類型細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)或患者來(lái)源的異種移植瘤細(xì)胞。

25、本發(fā)明的有益效果：

26、本發(fā)明提供的水凝膠微孔陣列制備模具微柱的結(jié)構(gòu)可以選擇不同形狀以適應(yīng)不同種類細(xì)胞對(duì)機(jī)械力等物理環(huán)境的不同要求；該模具能夠適配細(xì)胞培養(yǎng)微孔板，有效提高了實(shí)驗(yàn)通量，該模具的設(shè)計(jì)使微孔板的每個(gè)孔中可以形成多個(gè)水凝膠微孔，滿足其中形成細(xì)胞微球后續(xù)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求且不會(huì)造成細(xì)胞的浪費(fèi)，尤其對(duì)于珍貴的患者來(lái)源的細(xì)胞。

27、使用該模具制作的水凝膠微孔陣列形成的細(xì)胞微球數(shù)量、位置、大小均可控；且僅需在細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的孔中進(jìn)行一次處理，比如藥物處理，就可以實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少了操作者本身的操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性。