本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種大麻二酚酸合成酶突變體、高產(chǎn)重組酶畢赤酵母菌株及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大麻植物中有100多種不同的植物大麻素，其中大麻二酚(cbd)是僅次于四氫大麻酚(thc)的第二豐富的大麻素。有研究報道，cbd具有抗癲癇、抗驚厥、抗焦慮、抗精神病、抗癌和抗風(fēng)濕等功效。最新研究顯示，cbd還具有調(diào)節(jié)恐懼記憶、保護(hù)皮膚、抗炎等功能。與thc不同的是，cbd不具有精神活性，有著更高的安全性。近年來cbd已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到醫(yī)療保健領(lǐng)域。隨著cbd市場的擴大，cbd的產(chǎn)量需求也隨之增加。而目前大麻二酚的合成途徑主要是從大麻植物體直接提取和化學(xué)合成法，然而這些方法不僅在時間和成本上具有一定的限制，在環(huán)境方面也具有一定的污染性。因此，生物合成的方法在近年來受到廣泛關(guān)注。

2、然而，對大麻二酚酸合成酶(cbdas)的改造和異源表達(dá)研究較少。大麻二酚(cbd)已被證實是由大麻二酚酸(cbda)在自然條件下脫羧生成的，而大麻二酚酸是由cbdas催化大麻萜酚酸產(chǎn)生的，所以大麻二酚酸合成酶是大麻二酚合成的關(guān)鍵酶。開發(fā)高活性的cbdas酶，有利于提高催化大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的轉(zhuǎn)化效率，從而提高生物合成大麻二酚的產(chǎn)量。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種大麻二酚酸合成酶突變體、高產(chǎn)重組酶畢赤酵母菌株及應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。該大麻二酚酸合成酶突變體具有優(yōu)異的催化性能，能夠有效提高催化大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的轉(zhuǎn)化效率。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明還提供上述的大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，包括上述的編碼基因。

6、進(jìn)一步地，所述重組質(zhì)粒是將所述編碼基因連接入表達(dá)載體而得到；所述表達(dá)載體為ppic9k載體。

7、本發(fā)明還提供一種高產(chǎn)大麻二酚酸合成酶突變體的畢赤酵母菌株，包括上述的重組質(zhì)粒。

8、本發(fā)明還提供上述的高產(chǎn)大麻二酚酸合成酶突變體的畢赤酵母菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

9、將如seq?id?no.2所示的編碼基因連接入表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒；

10、將所述重組質(zhì)粒連續(xù)兩次導(dǎo)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，即為所述高產(chǎn)大麻二酚酸合成酶突變體的畢赤酵母菌株。

11、進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為ppic9k載體。

12、本發(fā)明還提供上述的編碼基因、重組質(zhì)?；虍叧嘟湍妇暝谥苽渖鲜龅拇舐槎铀岷铣擅竿蛔凅wcbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明還提供一種提高大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w的酶活性的方法，所述大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述方法包括將所述大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w的114位氨基酸突變?yōu)楣劝彼?，?76位氨基酸突變?yōu)槔野彼?，?28位氨基酸突變?yōu)楣劝滨０?，?16位氨基酸突變?yōu)楸彼岬牟襟E。

14、本發(fā)明還提供一種提高從大麻植株中提取大麻二酚的產(chǎn)量的方法，包括利用上述的大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w催化大麻植株中的大麻萜酚酸生成大麻二酚酸，進(jìn)而形成大麻二酚的步驟。

15、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

16、本發(fā)明以大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w為研究材料，通過系統(tǒng)改造活性位點周圍的殘基和糖基化位點，并結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能分析及計算機輔助計算，篩選出能夠顯著提升大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w酶活性的關(guān)鍵突變位點，最終獲得的多重突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w表現(xiàn)出優(yōu)異的催化性能。

17、在表達(dá)系統(tǒng)方面，本發(fā)明選用畢赤酵母gs115作為宿主菌，ppic9k作為表達(dá)載體，成功實現(xiàn)了重組酶的高效轉(zhuǎn)化，獲得了高產(chǎn)cbdas的畢赤酵母工程菌株。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明顯著提高了cbdas的異源表達(dá)產(chǎn)量，并增強了其對大麻葉片粗提液底物的催化效率。這不僅提升了大麻副產(chǎn)物的附加值，還賦予了該技術(shù)重要的市場應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。

技術(shù)特征：

1.一種大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述的大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，包括權(quán)利要求2所述的編碼基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒是將所述編碼基因連接入表達(dá)載體而得到；所述表達(dá)載體為ppic9k載體。

5.一種高產(chǎn)大麻二酚酸合成酶突變體的畢赤酵母菌株，其特征在于，包括權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒。

6.一種如權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)大麻二酚酸合成酶突變體的畢赤酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為ppic9k載體。

8.一種如權(quán)利要求2所述的編碼基因、權(quán)利要求3或4所述的重組質(zhì)?；驒?quán)利要求5所述的畢赤酵母菌株在制備權(quán)利要求1所述的大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w中的應(yīng)用。

9.一種提高大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w的酶活性的方法，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶突變體cbdasg183v-n482w的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；

10.一種提高從大麻植株中提取大麻二酚的產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求1所述的大麻二酚酸合成酶突變體cbdash114e-s116a-c176y-g183v-n328q-n482w催化大麻植株中的大麻萜酚酸生成大麻二酚酸，進(jìn)而形成大麻二酚的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種大麻二酚酸合成酶突變體、高產(chǎn)重組酶畢赤酵母菌株及應(yīng)用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。該大麻二酚酸合成酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明以突變體CBDAS<supgt;G183V?N482W</supgt;為研究材料，通過系統(tǒng)改造活性位點周圍的殘基和糖基化位點，并結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能分析及計算機輔助計算，篩選出能夠顯著提升大麻二酚酸合成酶突變體CBDAS<supgt;G183V?N482W</supgt;酶活性的關(guān)鍵突變位點，最終獲得的多重突變體CBDAS<supgt;H114E?S116A?C176Y?G183V?N328Q?N482W</supgt;表現(xiàn)出優(yōu)異的催化性能，能夠有效提高催化大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的轉(zhuǎn)化效率。

技術(shù)研發(fā)人員：戴凌燕,康悅,高靜,李志江,遲建,藺吉順,遲學(xué)勇,吳增輝,肖垌
受保護(hù)的技術(shù)使用者：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15