本申請涉及牛病毒性腹瀉病毒核酸的檢測，特別是涉及一種檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的引物組合物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、牛病毒性腹瀉病是由牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)引起的一種嚴重影響反芻動物健康的傳染病，其典型癥狀包括水樣腹瀉、免疫功能抑制、母牛繁殖障礙和持續(xù)性感染，這些癥狀不僅會降低牛的生產(chǎn)性能，同時也影響了動物福利。bvdv是一種單股正鏈rna病毒，基因組大小約為12.3kb，其在分類學(xué)上屬于黃病毒科、瘟病毒屬。依據(jù)5’-utr基因差異，其基因型分為bvdvⅰ型(22個亞型)和bvdvⅱ型(4個亞型)。研究表明，bvdv不僅感染牛，還能對豬、羊、駱駝、牦牛等動物發(fā)生感染。在中國西部某些地區(qū)，bvdv感染率高達80％，甚至100％，對畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。bvdv的快速傳播性、宿主范圍廣、高變異性及適應(yīng)性共同構(gòu)成了其流行特征的核心，使得bvdv的控制難度及管理復(fù)雜性增加。在這樣的背景下，充分了解bvdv的基因型、亞型分布，bvdv的變異和流行趨勢對于研發(fā)更廣譜的毒株疫苗，制定針對性地防控策略具有重要的作用。因此如何穩(wěn)定、有效檢測bvdv具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請的目的在于提供一種檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的引物組合物、試劑盒及方法。本申請?zhí)峁┑囊锝M合物可以對bvdv的感染進行特異性檢測，且能夠?qū)vdvⅰ型、bvdvⅱ型的不同亞型進行穩(wěn)定、有效的檢測。具體技術(shù)方案如下：

2、本申請的第一方面提供了一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的引物組合物，包括正向引物和反向引物；其中，所述正向引物的序列如seq?id?no:1所示，所述反向引物的序列如seq?id?no:2所示。

3、在本申請的一些實施方式中，所述牛病毒性腹瀉病毒包括牛病毒性腹瀉病毒i型和牛病毒性腹瀉病毒ii型。

4、在本申請的一些實施方式中，所述引物組合物不能對牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛細小病毒、牛副流感病毒3型和牛傳染性鼻氣管炎病毒進行擴增。

5、本申請的第二方面提供了一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的試劑盒，其中，所述試劑盒包括本申請第一方面所述的引物組合物。

6、本申請的第三方面提供了本申請第一方面所述的引物組合物或本申請第二方面所述的試劑盒在檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸中的應(yīng)用。

7、本申請的第四方面提供了一種定性檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的方法，其中，包括步驟：

8、s11：提取待測樣品的rna并進行反轉(zhuǎn)錄，得到待測樣品的cdna；

9、s12：以所述待測樣品的cdna為模板，采用本申請第一方面所述的引物組合物或本申請第二方面所述的試劑盒進行qpcr(熒光定量pcr)擴增反應(yīng)；

10、s13：分析擴增曲線和融解曲線，如果擴增曲線呈現(xiàn)s型且融解曲線呈現(xiàn)單一峰，融解溫度為84±0.5℃，則所述待測樣品包括牛病毒性腹瀉病毒；和/或

11、將擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果和牛病毒性腹瀉病毒5’-utr基因序列進行比對，根據(jù)序列的一致性，判斷所述待測樣品是否包括牛病毒性腹瀉病毒i型或牛病毒性腹瀉病毒ii型。

12、在本申請的一些實施方式中，所述qpcr擴增體系包括：0.3-0.5μmol/l正向引物；0.3-0.5μmol/l反向引物；1-20ng/μl模板cdna；2×chamq?universal?sybr?qpcr?mastermix0.4-0.6μl/l。

13、在本申請的一些實施方式中，所述qpcr擴增的條件包括：94-96℃，25-35s；94-96℃，4-6s；58-62℃，25-35s；35-45個循環(huán)。

14、在本申請的一些實施方式中，所述qpcr擴增的條件包括：94-96℃，25-35s；94-96℃，4-6s；53-63℃，25-35s；70-74℃，25-35s；35-45個循環(huán)。

15、本申請的第五方面提供了一種定量檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的方法，其中，包括步驟：

16、s21：將倍比稀釋的含有不同拷貝數(shù)的牛病毒性腹瀉病毒質(zhì)粒的標準品進行qpcr擴增反應(yīng)，繪制不同質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)的對數(shù)與循環(huán)數(shù)ct值之間的標準曲線；

17、s22：提取待測樣品的rna并進行反轉(zhuǎn)錄，得到待測樣品的cdna；

18、s23：以所述待測樣品的cdna為模板，采用本申請第一方面所述的引物組合物或本申請第二方面所述的試劑盒進行qpcr擴增反應(yīng)；

19、s24：分析擴增曲線和融解曲線，如果擴增曲線呈現(xiàn)s型且融解曲線呈現(xiàn)單一峰，融解溫度為84±0.5℃，則所述待測樣品包括牛病毒性腹瀉病毒；和/或

20、將擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果和牛病毒性腹瀉病毒5’-utr基因序列進行比對，根據(jù)序列的一致性，判斷所述待測樣品是否包括牛病毒性腹瀉病毒i型或牛病毒性腹瀉病毒ii型；

21、s25：根據(jù)待測樣品的循環(huán)數(shù)ct值，利用所述標準曲線換算得到所述待測樣品中牛病毒性腹瀉病毒載量。

22、在本申請的一些實施方式中，所述qpcr擴增體系包括：0.3-0.5μmol/l正向引物；0.3-0.5μmol/l反向引物；1-20ng/μl模板cdna；2×chamq?universal?sybr?qpcr?mastermix0.4-0.6μl/l。

23、在本申請的一些實施方式中，所述qpcr擴增的條件包括：94-96℃，25-35s；94-96℃，4-6s；58-62℃，25-35s；35-45個循環(huán)。

24、在本申請的一些實施方式中，所述qpcr擴增的條件包括：94-96℃，25-35s；94-96℃，4-6s；53-63℃，25-35s；70-74℃，25-35s；35-45個循環(huán)。

25、本申請的有益效果：

26、本申請?zhí)峁┝艘环N用于檢測牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)核酸的引物組合物，可以對bvdv的感染進行特異性檢測，且對bvdvⅰ型、bvdvⅱ型的不同亞型進行有效檢測。本申請還提供了定性或定量檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的方法(通用性bvdv?sybr?greenⅰqpcr檢測方法)，通過特異性、敏感性及臨床樣本檢測結(jié)果可知，本申請?zhí)峁┑姆椒軌蛱禺愋詸z測bvdv，且可以實現(xiàn)對bvdv不同基因型、不同亞型進行穩(wěn)定、有效的檢測。

27、當然，實施本申請的任一產(chǎn)品或方法并不一定需要同時達到以上所述的所有優(yōu)點。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的引物組合物，包括正向引物和反向引物；其中，所述正向引物的序列如seq?id?no:1所示，所述反向引物的序列如seq?id?no:2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其中，所述牛病毒性腹瀉病毒包括牛病毒性腹瀉病毒i型和牛病毒性腹瀉病毒ii型。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物組合物，其中，所述引物組合物不能對牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛細小病毒、牛副流感病毒3型和牛傳染性鼻氣管炎病毒進行擴增。

4.一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的試劑盒，其中，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-3中任一項所述的引物組合物。

5.權(quán)利要求1-3中任一項所述的引物組合物或權(quán)利要求4所述的試劑盒在檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸中的應(yīng)用。

6.一種定性檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的方法，其中，包括步驟：

7.一種定量檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的方法，其中，包括步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，

9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述qpcr擴增的條件包括：94-96℃，25-35s；94-96℃，4-6s；58-62℃，25-35s；35-45個循環(huán)。

10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述qpcr擴增的條件包括：94-96℃，25-35s；94-96℃，4-6s；53-63℃，25-35s；70-74℃，25-35s；35-45個循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本申請?zhí)峁┝艘环N檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的引物組合物、試劑盒及方法；用于檢測牛病毒性腹瀉病毒核酸的引物組合物包括正向引物和反向引物；其中，所述正向引物的序列如SEQ?ID?NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ?ID?NO:2所示。本申請?zhí)峁┑囊锝M合物可以對BVDV的感染進行特異性檢測，且能夠?qū)VDVⅠ型、BVDVⅡ型的不同亞型進行穩(wěn)定、有效的檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：馬曉霞,馬忠仁,安樂樂,韓文祥
受保護的技術(shù)使用者：西北民族大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15