本發(fā)明屬于寄生蟲檢測，具體涉及一種用于非疾病診斷目的的華支睪吸蟲的檢測方法。

背景技術(shù)：

1、華支睪吸蟲病，是由華支睪吸蟲寄生于膽道系統(tǒng)引起的一種重要的食源性寄生蟲病。除晚期后遺癥外，華支睪吸蟲病的確切臨床癥狀尚不明確，因?yàn)榇蠖鄶?shù)受感染的個體都有較低的蟲量，癥狀輕微，中度至重度感染可伴有右上腹部隱痛；與此相反，慢性或反復(fù)感染與膽管炎、膽汁性肝炎和膽道梗阻等表現(xiàn)有關(guān)。因此，華支睪吸蟲病在流行地區(qū)是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

2、現(xiàn)有的食源性寄生蟲病檢查方法包括病原學(xué)檢測方法、免疫學(xué)檢測方法、影像學(xué)檢測方法。病原學(xué)檢測方法包括樣本直接涂片、定量透明厚涂片法，集卵法，十二指腸引流膽汁檢查蟲卵；免疫學(xué)檢測方法包括elisa、iha、ifa；影像學(xué)檢測方法包括b超、ct。在《華支睪吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)》（ws309-2009）中推薦了elisa和3種病原學(xué)檢查：改良加藤厚涂片法、醛醚離心沉淀法和膠囊拉線法。其中，樣本蟲卵檢查如改良加藤厚涂片法和福爾馬林醚濃度法，在低感染情況下檢測會出現(xiàn)假陰性，并且因?yàn)槁训南嗨菩噪y以區(qū)分睪吸蟲、后睪吸蟲和異形吸蟲等魚源性吸蟲。華支睪吸蟲病免疫學(xué)檢測方法具有客觀、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，有取代傳統(tǒng)檢測方法的趨勢，但另一方面這些方法也存在著假陰性、假陽性及交叉反應(yīng)等不足。

3、為了克服與傳統(tǒng)寄生蟲學(xué)方法相關(guān)的檢測局限性，目前開發(fā)了許多基于pcr的檢測技術(shù)，能夠快速直接從樣本中的蟲卵中擴(kuò)增并辨別吸蟲種類。

4、中國專利（公開號cn105132539a）公開了一種基于核糖體dna?its1基因檢測華支睪吸蟲囊蚴的pcr擴(kuò)增試劑盒及擴(kuò)增引物，包括pcr擴(kuò)增反應(yīng)液，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)液包括：tris-hcl?10mmol/l，kcl?50mmol/l，mgcl2?1.5mmol/l，dntps?0.8mmol/l，正向引物0.4μmol/l，反向引物0.4μmol/l，dna模板20ng/μl，taq酶0.075u/μl。本發(fā)明靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測快速、準(zhǔn)確，為華支睪吸蟲感染的診治和預(yù)防提供有效的技術(shù)手段。

5、中國專利（公開號cn114959082?a）公開了用于檢測多種動物源性食品病原體的引物探針組、試劑盒及其應(yīng)用。該引物探針組包括針對沙門氏菌、大腸桿菌0157:h7、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、2型豬鏈球菌、布魯氏菌、結(jié)核分支桿菌、旋毛蟲、弓形蟲、囊蟲、棘球絳蟲、廣州管圓線蟲、華支睪吸蟲和戊型肝炎病毒多種動物源性食品病原體的特異性引物對和探針。上述引物探針組能夠快速、高效、特異地檢測出動物源性食品中的病原體，對于保障食品安全和人體健康具有重要意義。

6、期刊文獻(xiàn)“實(shí)時(shí)熒光定量?pcr?檢測注射用門冬酰胺酶制劑中核苷酸殘留”公開了選擇大腸桿菌23s核糖體rna基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。

7、上述現(xiàn)有技術(shù)中，cn105132539a涉及的引物只包含了根據(jù)華支睪吸蟲轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1基因序列設(shè)計(jì)的引物；cn114959082?a中雖然包括了大腸桿菌引物和華支睪吸蟲引物，但是大腸桿菌并不是作為內(nèi)參；上述期刊文獻(xiàn)雖然公開了選擇大腸桿菌23s核糖體rna基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，但大腸桿菌也不是作為內(nèi)參。可見，現(xiàn)有技術(shù)均未設(shè)計(jì)內(nèi)參引物，無法監(jiān)測擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是否異常，如是否存在假陽性或假陰性，從而無法保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明提供一種用于非疾病診斷目的的華支睪吸蟲的檢測方法，采用兩套引物組進(jìn)行結(jié)合，其中，以擴(kuò)增大腸桿菌基因的引物組b作為內(nèi)參引物，可監(jiān)控檢測過程中樣本和質(zhì)控品核酸是否提取成功及檢測結(jié)果是否可信，解決了以往的華支睪吸蟲檢測技術(shù)無法監(jiān)控?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)是否異常的技術(shù)問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種用于非疾病診斷目的的華支睪吸蟲的檢測方法：以靶向擴(kuò)增華支睪吸蟲基因的引物組a作為目標(biāo)引物，以靶向擴(kuò)增大腸桿菌基因的引物組b作為內(nèi)參引物。通過自主設(shè)計(jì)全新的引物探針組合，分別對華支睪吸蟲和大腸桿菌的特異性基因序列進(jìn)行靶向擴(kuò)增，具有較高特異性，可高度匹配華支睪吸蟲基因和大腸桿菌基因的多個拷貝片段，且具有較高的擴(kuò)增效率。

4、優(yōu)選地，所述的華支睪吸蟲基因?yàn)槿A支睪吸蟲轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1中一段保守序列（序列號為kx378008.1），所述的大腸桿菌基因?yàn)榇竽c桿菌23s?rna中一段保守序列（序列號cp139887.1）。當(dāng)內(nèi)參基因?yàn)榇竽c桿菌23s?rna中一段保守序列時(shí)，匹配度達(dá)到了100%，大大提高了擴(kuò)增效率。

5、優(yōu)選地，所述的引物組a包含引物f1、引物r1和探針p1，所述的引物f1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述的引物r1的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述的探針p1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

6、優(yōu)選地，所述的探針p1的3’端帶6-fam的熒光基團(tuán)，5’端帶bhq1的熒光淬滅基團(tuán)。

7、優(yōu)選地，所述的引物組b包含引物f2、引物r2和探針p2，所述的引物f2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述的引物r2的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述的探針p2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

8、優(yōu)選地，所述的探針p2的3’端帶cy5的熒光基團(tuán)，5’端帶bhq2的熒光淬滅基團(tuán)基團(tuán)。

9、優(yōu)選地，所述的用于非疾病診斷目的的華支睪吸蟲的檢測方法，包括樣本核酸的提取、陽性對照核酸的提取、陰性對照核酸的提取，所述的樣本核酸的提取、陽性對照核酸的提取、陰性對照核酸的提取均加入抗抑制劑。

10、優(yōu)選地，所述的抗抑制劑為inhibitex?buffer。在核酸提取過程中添加抗抑制劑inhibitex?buffer，能夠顯著抑制樣本中pcr抑制物的活性，大大提高了pcr的擴(kuò)增效率、檢測效率和檢測通量，提高檢測的靈敏度。

11、優(yōu)選地，所述的抗抑制劑的加入量為1ml/250mg干便或1ml/1ml稀便。

12、優(yōu)選地，所述的樣本核酸的提取、陽性對照核酸的提取、陰性對照核酸的提取均采用磁珠法進(jìn)行核酸提取。采用廣州達(dá)安基因股份有限公司的核酸提取或純化試劑，貨號hyk0139作為提取試劑。

13、優(yōu)選地，所述的陽性對照核酸的提取過程中采用含有華支睪吸蟲dna的質(zhì)粒和陰性樣本作為陽性質(zhì)控品。

14、優(yōu)選地，所述的質(zhì)粒的獲取途徑如下：在puc57（2710bp）載體中插入華支睪吸蟲轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1中一段300bp的序列，合成構(gòu)建為質(zhì)粒。合成后將質(zhì)粒稀釋成1×106copies/ul、1×105copies/ul、1×104copies/ul、1×103copies/ul四個濃度梯度，作為檢測限參考品。多個不同濃度的質(zhì)粒+陰性樣本組成陽性參考品，選擇其中一個濃度的參考品即為陽性質(zhì)控品。

15、優(yōu)選地，所述的300bp序列如seq?id?no.7所示。

16、優(yōu)選地，所述的陰性對照核酸的提取過程中采用無核酸酶水作為陰性質(zhì)控品。

17、采用陽性質(zhì)控品質(zhì)粒、陰性質(zhì)控品、內(nèi)參引物相結(jié)合，形成質(zhì)控體系，該質(zhì)控體系參與樣本前處理、dna提取與pcr檢測過程，其中，以無核酸酶水作為陰性質(zhì)控品，監(jiān)控該批次整個檢測的背景是否有污染；以一定濃度的質(zhì)粒+陰性樣本作為陽性質(zhì)控品，監(jiān)控該批次檢測的效率；內(nèi)參引物則直接擴(kuò)增樣本中提取出的大腸桿菌核酸，監(jiān)控樣本和質(zhì)控品核酸是否提取成功，檢測結(jié)果是否可信。

18、本發(fā)明具有如下有益效果：

19、1.本發(fā)明對現(xiàn)有的華支睪吸蟲檢測的引物探針進(jìn)行了優(yōu)化創(chuàng)新，采用了自主設(shè)計(jì)的兩套全新的引物組進(jìn)行結(jié)合，分別對目的基因（華支睪吸蟲基因）和內(nèi)參基因（大腸桿菌基因）進(jìn)行靶向擴(kuò)增，可快速、準(zhǔn)確匹配和檢測靶標(biāo)病原體基因。其中，采用擴(kuò)增大腸桿菌基因的引物組b作為內(nèi)參引物，可監(jiān)控檢測過程中樣本和質(zhì)控品核酸是否提取成功及檢測結(jié)果是否可信，具有假陽性或假陰性少、檢測特異性和靈敏度高的特點(diǎn)，解決了以往的華支睪吸蟲檢測技術(shù)無法監(jiān)控?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)是否異常的技術(shù)問題。

20、2.本發(fā)明的檢測方法包含了上述針對華支睪吸蟲和內(nèi)參基因的兩套引物組，可快速針對靶標(biāo)病原體和內(nèi)參基因進(jìn)行檢測，一次可以同時(shí)檢測多個樣本，大大縮短檢測時(shí)間，助力臨床快速明確病原體；同時(shí)，因包含了內(nèi)參引物，可對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制；獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)，使得檢測方法具有較高的特異性和明顯的時(shí)效性。

21、3.本發(fā)明的檢測方法簡單易行，能夠同時(shí)對病原體和內(nèi)參核酸進(jìn)行檢測，一次可以同時(shí)檢測多個樣本，具有較高的特異性和明顯的時(shí)效性，大大縮短檢測時(shí)間，具有理想的靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，為流行病學(xué)調(diào)查中對華支睪吸蟲的分布情況及華支睪吸蟲的基因變異規(guī)律等基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。