一種人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物材料及其功能化研宄開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘 素融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，生物活性材料在組織工程領(lǐng)域的研宄和應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注，尤其是 隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，基于蛋白質(zhì)工程的生物材料對于特殊的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研 宄已逐漸成為一個新的熱點(diǎn)領(lǐng)域。材料的抗凝血及血管化問題一直是組織工程和再生醫(yī)學(xué) 研宄中所面臨的瓶頸之一，尤其是對于尺寸超過200 μ m的再生組織，血管化的不足會導(dǎo)致 細(xì)胞氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)不足進(jìn)而導(dǎo)致組織內(nèi)部細(xì)胞凋亡。在目前血管組織工程中，受 損血管替代物或血管移植支架材料體內(nèi)移植后，由于缺乏結(jié)構(gòu)完整、功能正常的內(nèi)皮層的 覆蓋和調(diào)控作用，常常導(dǎo)致植入物表面血小板的粘附和聚集，形成血栓以及平滑肌過度增 生而形成的再狹窄，最終導(dǎo)致體內(nèi)移植的失敗。如何提高內(nèi)皮細(xì)胞在體外基質(zhì)或支架材料 表面的特異性吸附與功能維持一直是血管組織工程所面臨的巨大挑戰(zhàn)。研宄表明，生物材 料組織工程支架的表界面功能化改性可有效調(diào)控細(xì)胞行為，如：細(xì)胞的粘附、增殖、迀移、細(xì) 胞行為和細(xì)胞的定向分化。因此，我們通過研宄制備可溶性生物信號分子的融合蛋白并用 做人工細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)現(xiàn)生物材料表面功能性改性，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、生長和增殖。
[0003] 人工細(xì)胞外基質(zhì)通過模擬天然細(xì)胞一細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞一細(xì)胞間相互作用，調(diào)控 細(xì)胞生存及其生物學(xué)功能。人工細(xì)胞外基質(zhì)來源主要分為三類：天然生物大分子、化學(xué)合成 聚合物以及近年發(fā)展起來的基因重組型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。其中，天然生物大分子以其良好 的生物相容性和生物降解性而廣泛用于組織工程領(lǐng)域，然而這些大分子具有機(jī)械性能差， 使用過程中不穩(wěn)定的缺點(diǎn)?；瘜W(xué)合成聚合物雖然機(jī)械性能強(qiáng)，但其生物相容性差，易引起 免疫應(yīng)答反應(yīng)。與前兩種人工細(xì)胞外基質(zhì)相比，基因重組融合蛋白型細(xì)胞外基質(zhì)通過不同 功能蛋白的有序組合，不僅可特異性增強(qiáng)靶細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，而且可用于構(gòu) 建一種安全、可控的細(xì)胞外微環(huán)境達(dá)到調(diào)控細(xì)胞的黏附、增殖、分化等細(xì)胞生物學(xué)行為的目 的。
[0004] 血管內(nèi)皮鈣粘素蛋白是鈣粘素超家族中一種典型的亞型，其基因定位在十六號染 色體長臂的六個鈣粘素基因簇上，該蛋白是一種鈣離子依賴性細(xì)胞與細(xì)胞間粘附糖蛋白， 由三部分組成：細(xì)胞外五個鈣粘素重復(fù)單位、跨膜段和胞內(nèi)高度保守的胞質(zhì)尾區(qū)。近年來研 宄發(fā)現(xiàn)，膜蛋白VE - cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞細(xì)胞信號通路在血管新生過程中是動態(tài)變化的， VE - cadherin介導(dǎo)的這種動態(tài)的細(xì)胞與細(xì)胞之間連接作用分別為"抑制"或"激活"，即當(dāng) 連接激活時，翻轉(zhuǎn)的VE - cadherin是比較多的，此時細(xì)胞表現(xiàn)為高運(yùn)動性，而當(dāng)在膜上的 處于動態(tài)活動的VE - cadherin減少時，表現(xiàn)為連接抑制并且細(xì)胞逐漸表現(xiàn)為靜止態(tài)。此 外，膜蛋白VE - cadherin介導(dǎo)的這種"激活"連接在血管新生過程中起著特殊的作用，包 括骨架重排，細(xì)胞極性建立，下游通路激活如FAK、Bcl - 2等。免疫球蛋白的Fc段具備多 種功能，，F(xiàn)c段與目的功能片段融合可促進(jìn)功能蛋白域二聚體的形成，顯著延長其半衰期， 提高融合蛋白的活性和穩(wěn)定性，上述特性為組織工程生物材料支架表面修飾的應(yīng)用提供了 絕佳的優(yōu)勢，在未來的再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研宄和臨床應(yīng)用中有巨大的應(yīng)用潛能。
[0005] 在此背景條件下，通過基因重組技術(shù)技術(shù)設(shè)計(jì)制備人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素與Fc的融 合蛋白，并用于生物材料表面改行，使其不僅能夠極大的改善生物材料的生物相容性，同時 提高內(nèi)皮細(xì)胞生長性能和血管化功能調(diào)控等，在組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有非常重要的 應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白，這種基于 人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素的融合蛋白是可用做人工細(xì)胞外基質(zhì)的融合蛋白，其可用于改善疏水材 料表面的親水性并賦予生物材料內(nèi)皮細(xì)胞特異性親和力，改善內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖及分 化功能表達(dá)等。
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白 (hVE - cad - Fc融合蛋白）的制備方法。
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于提供上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白 (hVE - cad - Fc融合蛋白）用于組織工程材料表面改性（即基質(zhì)化）的條件。
[0009] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白 (hVE - cad - Fc融合蛋白）作為人工細(xì)胞外基質(zhì)在促血管化生物材料表面改性等開發(fā)中 的應(yīng)用。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0011] 一種人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白（hVE - cad - Fc融合蛋白），將人血管內(nèi)皮細(xì) 胞鈣粘素蛋白（hVE - cadherin)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因片段與人免疫球蛋白G的Fc基因片 段重組構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒，并經(jīng)真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)、純化而制得，是可用作 人工細(xì)胞外基質(zhì)的人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素胞外域與人免疫球蛋白IgG的Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白 hVE - cad - Fc，其基因序列為序列表中< 400 > 1所示序列，其中Fc基因序列為序列表 中< 400 > 2所示序列。
[0012] 上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白的制備方法，步驟如下：
[0013] (1)構(gòu)建pcDNA3. 1/VE - cad - Fc表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒小提；
[0014] (2) 293 - 6E細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取上清，純化即PEI轉(zhuǎn)染293 - 6E細(xì)胞，6天后收集上清， 通過rProtein A FF和SEC純化蛋白；
[0015] (3)純化蛋白進(jìn)行SDS - PAGE和Western blot分析?；?br>[0016] ①構(gòu)建pcDNA3. Ι/hVE - cad - Fc表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒小提；
[0017] ②真核細(xì)胞（包括CH0、293等）通過所上述pcDNA3. Ι/hVE - cad - Fc基因轉(zhuǎn)染， 懸浮培養(yǎng)表達(dá)、取上清，蛋白A親和層析柱分離純化；
[0018] ③經(jīng) SDS - PAGE 和 Western blot 分析、定性評價 hVE - cad - Fc 的分子量，HPLC 分析純度。
[0019] 上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白用于生物材料表面修飾的應(yīng)用，人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘 素融合蛋白（hVE - cad - Fc融合蛋白）基質(zhì)化最適條件是：用無菌PBS ( -）或生理鹽水 (PH = 7. 4)溶解hVE - cad - Fc融合蛋白，配置成所需溶液，使用濃度為0. 1 - 30ug/ml， 37°C孵育2 - 8h或者4°C孵育12 - 24h，棄上清，PBS或生理鹽水清洗3次，除去未穩(wěn)定結(jié) 合的hVE - cad - Fc融合蛋白，即獲得穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素活性域蛋白層，立即用于細(xì) 胞實(shí)驗(yàn)或者PBS浸泡保存。
[0020] 優(yōu)選的，上述應(yīng)用，所述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白（hVE - cad - Fc融合蛋白） 基質(zhì)化條件中，所述hVE - cad - Fc融合蛋白，包括血管內(nèi)皮鈣黏素蛋白的胞外域和免疫 球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域，通過Fc介導(dǎo)的物理或化學(xué)結(jié)合，用于修飾二維平面或三維支架表面； 所述生物材料為疏水材料或表面含有Fc結(jié)合位點(diǎn)（如蛋白A或特異性多肽等），通過物理 或化學(xué)結(jié)合經(jīng)Fc結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)在二維或三維多孔生物材料支架表面形成hVE - cadherin功 能蛋白基質(zhì)層。
[0021] 優(yōu)選的，上述應(yīng)用，所述人內(nèi)皮細(xì)胞媽粘素融合蛋白（hVE - cad - Fc融合蛋白） 基質(zhì)化最適條件中，配制所需溶液是指為不含二價陽離子（如鈣或鎂）的磷酸鹽緩沖液 (pH7. 4)或生理鹽水，過酸或過堿會破壞融合蛋白二聚體結(jié)構(gòu)。
[0022] 優(yōu)選的，上述應(yīng)用，所述人內(nèi)皮細(xì)胞媽粘素融合蛋白（hVE - cad - Fc融合蛋白） 基質(zhì)化條件中，所述孵育時間必須大于2h(37°C孵育）或12h(4°C孵育），時間過短會影響融 合蛋白固定效率。
[0023] 優(yōu)選的，上述應(yīng)用，所述人內(nèi)皮細(xì)胞媽粘素融合蛋白（hVE - cad - Fc融合蛋白） 基質(zhì)化條件中，所述hVE - cad - Fc融合蛋白使用濃度為0. 1 - 30ug/ml。
[0024] 優(yōu)選的，上述應(yīng)用，所述人內(nèi)皮細(xì)胞媽粘素融合蛋白（hVE - cad - Fe融合蛋白） 基質(zhì)化條件中，修飾后的內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素活性域蛋白層在PBS浸泡下能保持長期穩(wěn)定（至 少一周）。
[0025] 上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白（hVE - cad - Fe融合蛋白）在組織工程支架材 料表面改性領(lǐng)域的應(yīng)用，hVE - cad - Fe融合蛋白經(jīng)Fe端介導(dǎo)在材料表面形成穩(wěn)定的內(nèi)皮 細(xì)胞鈣粘素活性域蛋白層，即形成仿內(nèi)皮細(xì)胞間粘附鏈接相互作用的人工細(xì)胞外基質(zhì)（基 質(zhì)化），提高生物材料的生物相容性，同時促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附和增殖以及血管化等功能的應(yīng) 用。
[0026] 優(yōu)選的，上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白（hVE - cad - Fe融合蛋白）基質(zhì)化的 應(yīng)用，用于改善疏水材料的親水性、顯著提高生物材料表面的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性粘附性能。
[0027] 優(yōu)選的，上述人內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘素融合蛋白（hVE - cad - Fe融合蛋白）基質(zhì)化的 應(yīng)用，能夠用于促進(jìn)