一種鼠腫瘤模型的構建方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及鼠腫瘤模型的構建方法及其應用。更具體地，本發(fā)明涉及用于評價雙 特異性抗體治療其靶向抗原相關疾病效力的鼠腫瘤模型的構建方法，以及評價雙特異性抗 體治療其靶向抗原相關疾病效力的系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002] 雙特異性抗體（bispecific antibody，BiAb)是含有兩種特異性抗原結合位點的 人工抗體，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導向性的效應功能。BiAb在 生物醫(yī)學中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。通過BiAb介導細胞毒作用 殺死腫瘤細胞是當前免疫治療應用研宄的熱點，其主要特點是BiAb能同時結合腫瘤相關 抗原和免疫效應細胞上的靶分子，從而促進免疫效應細胞識別腫瘤細胞，并形成免疫復合 體，直接觸發(fā)免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。以下是針對所研宄的免疫細胞抗原 和腫瘤細胞抗原，以及相關技術發(fā)展的一些【背景技術】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004]CD3分子由4個亞基組成：S、e、丫、（，其分子質(zhì)量分別為18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條肽 鏈，常與TCR緊密結合形成含有8條肽鏈的TCR-CD3復合體，結構示意圖見圖1。此復合體 具有T細胞活化信號轉(zhuǎn)導，穩(wěn)定T細胞受體（TCR)結構的功能。CD3胞質(zhì)段含免疫受體酪 氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR識別并結 合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，導致 0)3 的ITAM的 保守序列的酪氨酸殘基被T細胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷酸化，然后可募集其他含有 SH2(Scrhomology2)結構域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和與ZAP-70 的結合是T細胞活化信號傳導過程早期階段的重要生化反應之一。因此，CD3分子的功能 是轉(zhuǎn)導TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號。
[0005] 2.HER2
[0006] 1981 年Shih等（ShihC，PadhyLC，MurrayM，etal.Transforminggenes ofcarcinomasandneuroblastomasintroducedintomousefibroblasts[J]. Nature, 1981,290(5803) :261-264.)首次從大鼠神經(jīng)母細胞瘤基因組中克隆出癌基因 neu，Slamon等（1987,Science2 ;35; 177-182)從人cDNA文庫中分離出HER2 基因。隨后 的序列分析和染色體譜分析發(fā)現(xiàn)neu和HER2為同一個基因，習慣上稱為HER2/neu基因或 c-erbB-2基因。HER2是人類表皮生長因子受體家族的第2個成員，該家族屬于I型受體酪 氨酸激酶，又稱ErbB受體家族，其在許多正常和異常表皮細胞的生長、分化和轉(zhuǎn)移過程中 起著重要的調(diào)控作用，許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和病情輕重與其活性大小密切相關。家族內(nèi)共 有四個受體：HER1，HER2,HER3和HER4。這些受體可以相互作用產(chǎn)生異源或同源二聚體，激 活細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導通路，其中J1ER2在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起著重要作用。HER2的結構 包括胞外生長因子的結合區(qū)，親脂的跨膜區(qū)和帶有調(diào)節(jié)羧基末端片段的胞內(nèi)區(qū)。J1ER2受體 胞內(nèi)區(qū)有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸殘基Tyr磷酸化位點。特異性 生長因子與J1ER2受體結合后可誘導二聚體化并激發(fā)受體的交叉磷酸化，磷酸化的受體可 以把細胞外的生長信號迅速轉(zhuǎn)導至核內(nèi)，刺激控制與細胞分裂有關的基因表達。
[0007]HER2定位于人染色體17q21，編碼分子量為185kD的跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶RTK活性，正常情況下處于非激活狀態(tài)，參與細胞正常分化的調(diào)節(jié)，通常只在胎兒期表達， 成年后，僅在極少數(shù)正常組織內(nèi)微量表達。正常細胞中HER2基因為2個拷貝，基因突變 可將其激活，其擴增將導致轉(zhuǎn)錄上調(diào)，蛋白合成增加，從而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細 胞增殖，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子VEGF/血管通透性因子VPF，促進腫瘤新生血管生成，增加 腫瘤細胞侵襲力，破壞機體組織抗侵襲屏障等[ArtufelMV，ValeroAC，LladoRR，etal. MolecularProtocolforHer-2/neuanalysisinbreastcarcinoma[J].ClinTransl 0ncol，2005,7. (11):504-511.]。HER2蛋白的過度表達也在細胞的分裂、增殖、轉(zhuǎn)化、促進 腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、粘附中發(fā)揮重要作用[HynesNE,StemDF.ThebiologyoferbB_2/neu/ HER-2anditsroleincancer[J].BiochemBiophysActa, 1994, 1198(2-3):165-184. ]〇
[0008] 除可發(fā)生基因突變或擴增外，上調(diào)HER2的表達也可激HER2下游的兩個主要信號 轉(zhuǎn)導途徑：MAPK通路，PI3K/Akt通路，從而引發(fā)瀑布式連鎖反應，調(diào)節(jié)凋亡相關基因，促進 細胞無限增殖分化，抑制凋亡，從而發(fā)生癌變。前者主要參與細胞的有絲分裂，后者主要影 響細胞的存活和凋亡。J1ER2可通過MAPK途徑活化Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員ER81而上調(diào)人端 粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT，進而導致細胞端粒末端轉(zhuǎn)移酶異常活化，使細胞轉(zhuǎn)化并進 入永久增殖狀態(tài)[GoueliBS,JanknechtR.Upregulationofthecatalytictelomerase subunitbythetranscriptionfactorER81andoncogenicHER2/Neu,Ras,orRaf.Mol Cel1Biol，2004,24:25-35.]。PI3K活化后，可催化磷脂酰肌醇PI生成PIP2和PIP3,它 們是細胞內(nèi)重要的第二信使，能激活下游的蛋白激酶Akt/PKB，進一步導致下游BAD蛋白的 磷酸化，從而阻止BAD與凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL組成復合物，同時還誘導叉頭轉(zhuǎn)錄因子 1磷酸化，從而抑制原凋亡基因的表達。
[0009] 另外，HER2癌基因也是腫瘤轉(zhuǎn)移驅(qū)動因子，HER2過表達能通過啟動多種轉(zhuǎn)移相關 機制而增加腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力，如細胞迀移率、體外侵襲力、W型膠原酶活性等，還可以影響 某些黏附分子如上皮細胞媽黏蛋白等的合成，從而促進轉(zhuǎn)移。Carter等（CarterW，Hoying J,Boswel1C,etal.HER-2/neuover-expressioninducesendothelialcel1 retraction[J].IntCancer, 2001, 91(3) :295-299.)研宄認為，HER2 過表達可使內(nèi)皮細胞 收縮，細胞間隙增寬，腫瘤細胞易于從內(nèi)皮細胞間穿越，腫瘤細胞發(fā)生移位或轉(zhuǎn)移。多數(shù)研 宄認為，HER2基因擴增和（或）蛋白過表達往往提示腫瘤惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強。
[0010]J1ER2的過表達常與腫瘤的發(fā)生有關，例如：
[0011] (1)胃癌：胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，預后差，進展期胃癌5年生存率 僅為5%~20%，中位生存時間不超過1年。不同的研宄小組檢測HER2蛋白在胃癌中過 表達的比率變異為7%~43%。HER2蛋白在胃癌中的陽性表達與腫瘤分化程度、Laur