腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體， 還涉及該siRNA表達(dá)載體的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] RNAi是在生物進(jìn)化上高度保守的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，并已經(jīng)成為強(qiáng)大的 基因操作工具。它幾乎可以用來研宄任何一種基因的分子途徑以及表型和基因型之間的關(guān) 系。但仍存在些許不足之處，如RNAi時(shí)間和空間上的不可控性及非靶向性，上述不足嚴(yán)重 限制了RNAi在基因治療領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。因此，RNAi在時(shí)間和空間上的不可控性以及 非靶向性是需要亟待解決的難題。誘導(dǎo)型RNAi技術(shù)可以通過誘導(dǎo)物介導(dǎo)shRNA的表達(dá)進(jìn) 而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的有效調(diào)控，因此也成為了近些年RNAi技術(shù)的研宄熱點(diǎn)。目前所存在的誘 導(dǎo)型RNAi系統(tǒng)主要包括兩大類：一種是利用已經(jīng)構(gòu)建成熟的調(diào)控系統(tǒng)（例如：Tet-〇n和 Tet-off)，另一種是基于脅迫誘導(dǎo)型PolII類啟動(dòng)子（如HSP70)。相比較而言，前者成本 高，耗時(shí)長，調(diào)控系統(tǒng)比較復(fù)雜，不可控因素較多，其中誘導(dǎo)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性較大。而后者 可直接在外界因素（如：缺氧、熱激和冷激）的刺激下實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的調(diào)控，操作簡單，成 本較低，同時(shí)對(duì)細(xì)胞無明顯損傷，但是脅迫誘導(dǎo)型PolII類啟動(dòng)子受外界因素調(diào)控，并不具 有靶向性，同樣不能滿足RNAi在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0003] 因此，急需一種在時(shí)間和空間上可調(diào)控的靶向RNAi表達(dá)載體，為RNAi在基因治療 領(lǐng)域中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供腫瘤特異性和可熱調(diào)控的SiRNA表達(dá)載 體；本發(fā)明的目的之二在于提供腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體的制備方法；本 發(fā)明的目的之三在于提供腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體，所述siRNA表達(dá)載體含有由腫瘤特異 性啟動(dòng)子和熱休克元件調(diào)控表達(dá)的siRNA表達(dá)框。
[0007] 優(yōu)選的，所述腫瘤特異性啟動(dòng)子為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 3 所示。
[0008] 優(yōu)選的，所述熱休克元件為HSE(MN)或HSE(XY)，所述HSE(MN)的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示，所述HSE(XY)的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0009] 優(yōu)選的，所述siRNA表達(dá)框如SEQIDNO. 6所示。
[0010] 2、所述腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：
[0011]a.以SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示序列為引物克隆人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng) 子，然后合成熱休克元件，所述熱休克元件的核苷酸序列如SEQIDNO. 4或SEQIDNO. 5所 示；
[0012] b.將步驟a克隆的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子和熱休克元件替換pMHSP70psil質(zhì)粒 的HSP70啟動(dòng)子，所述熱休克元件位于所述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的5'端；再將SEQID NO. 6所示序列連入啟動(dòng)子的3'端，得腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體。
[0013] 優(yōu)選的，步驟a中，克隆人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min ; 95°〇變性3〇8,56°0退火3〇8,721：延伸3〇8,30個(gè)循環(huán)；最后721：延伸1〇111111，41：保存。
[0014] 3、所述腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建靶向干擾腫瘤治療基因表 達(dá)的載體中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選的，所述腫瘤治療基因?yàn)镾NCG基因。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了腫瘤特異性和可熱調(diào)控的siRNA表達(dá)載 體，該載體具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1)具有良好的腫瘤特異性，從而可以降低其對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生的毒副作用；
[0018] 2)由hTERT和熱休克元件HSE啟動(dòng)子調(diào)控的siRNA本底表達(dá)水平很低，具有較強(qiáng) 的熱誘導(dǎo)性；
[0019] 3)由hTERT/HSE啟動(dòng)子調(diào)控的siRNA表達(dá)載體在熱激的條件下可高效率地敲除目 的基因，由于本發(fā)明是用熱來控制siRNA的表達(dá)而不是傳統(tǒng)的外源誘導(dǎo)物，因此避免了免 疫反應(yīng)。
【附圖說明】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0021] 圖 1 為pHSP70-EGFP、phTERTp-EGFP質(zhì)粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP質(zhì)粒和phTERT/ HSE(XY)p-EGFP質(zhì)粒在人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT)和人正常肝細(xì)胞（HL7702)細(xì)胞中熒光分 布情況。
[0022] 圖 2 為pMHSP70psil、phTERTp-EGFP質(zhì)粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP質(zhì)粒和phTERT/ HSE(XY)p-EGFP質(zhì)粒在人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT)和人正常肝細(xì)胞（HL7702)細(xì)胞中EGFP 蛋白表達(dá)情況。
[0023] 圖3為表達(dá)siRNA的質(zhì)粒表達(dá)框結(jié)構(gòu)圖。
[0024] 圖 4 為pMhTERTppsil質(zhì)粒、pMhTERT/HSE(MN)ppsil質(zhì)粒和pMhTERT/HSE(XY) ppsil質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0025] 圖5為SqRT-PCR和Western-blot檢測IfepG2細(xì)胞中不同處理組SNCG基因含量； a為在H印G2細(xì)胞中通過SqRT-PCR檢測SNCG基因的沉默效果；b為用柱形圖顯示SNCG基 因在RNA水平上的表達(dá)差異（均值土標(biāo)準(zhǔn)差，n= 3, *p〈0. 01)，Control組是指空白對(duì)照 組，Mockcontro1是指只在細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染試劑，pMhTERTpsi1組是本實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照組 即不含有熱休克元件組；c為在H印G2細(xì)胞中通過Western-blot檢測SNCG基因的沉默效 果。
[0026] 圖6為SqRT-PCR技術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞中不同實(shí)驗(yàn)組SNCG基因含量；a為在MCF-7 細(xì)胞中通過SqRT-PCR檢測SNCG基因的沉默效果，b為用柱形圖顯示SNCG基因在RNA水平上 的表達(dá)差異（均值土標(biāo)準(zhǔn)差，n= 3，*p〈0. 01)，Control組是指空白對(duì)照組，Mockcontrol 是指只在細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染試劑，pMhTERTpsi1組是本實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照組即不含有熱休克 元件組）。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0028] 實(shí)施例1、克隆人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)啟動(dòng)子
[0029] 根據(jù)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)基因啟動(dòng)子序列（Genbank:AF325900)設(shè)計(jì)克隆 hTERT啟動(dòng)子的引物，具體如下：
[0030]上游引物：5' -ggaagatctgattcgcgggcacagacg-3'(SEQIDNO.1)，下劃線為 Bglll酶切位點(diǎn)；
[0031]下游引物：5' -cggggtaccccacgtgcgcagcaggac-3'(SEQIDNO. 2)，下劃線為 Kpnl酶切位點(diǎn)。
[0032] 然后以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7基因組為模板，SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示序列 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，4°C保存，將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，獲得hTERT啟動(dòng) 子，其核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0033] 實(shí)施例2、合成熱休克元件（HSE)
[0034] 人工合成HSE(MN)和HSE(XY)序列，具體如下：
[0035]HSE(MN)序列為：5' -gaaggttcatttgaaggttcatttgaaggttc-3'（SEQIDNO. 4);
[0036]HSE(XY)序列為：5' -agaacgttctagaacgttctagaacgttcttctagaacgttct-3'（SEQ IDNO. 5) 〇
[0037] 然后設(shè)計(jì)根據(jù)hTERT啟動(dòng)子序列和HSE(MN)與HSE(XY)的序列，設(shè)計(jì)含hTERT和 HSE的啟動(dòng)子hTERT/HSE(MN)與hTERT/HSE(XY)的上游引物，具體引物如下：
[0038]hTERT/HSE(MN)啟動(dòng)子上游引物：5'-ggaagatctgaaggttcatttgaaggttcatttgaa 區(qū)區(qū)1:1:。831:1:。8。888。3。383。8-3'(5￡(>)10勵(lì).6)，下劃線為1^111酶切位點(diǎn)，黑體為批￡(1?);
[0039]hTERT/HSE(XY)啟動(dòng)子上游引物：
[0040] 5'-cggKgtaccagaacgttctagaacgttctagaacgttcttctagaacgttctccacgtgcgcagc aggac-3'(SEQIDNO. 7)，下劃線為Bglll酶切位點(diǎn)，黑體為HSE(XY)。
[0041] 然后分別以SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7為上游引物，SEQ ID NO. 2為下游引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得hTERT/HSE (MN)啟動(dòng)子和hTERT/HSE (XY)啟動(dòng)子。
[0042]實(shí)施例3、構(gòu)建phTERTp-EGFP和phTERT/HSEp-EGFP質(zhì)粒
[0043] 1、構(gòu)建phTERTp-EGFP質(zhì)粒
[0044] 將實(shí)施例1克隆hTERT啟動(dòng)子用Bglll和Kpnl雙酶切，回收目的片段，然后用 Bglll和Kpnl雙酶切pHSP70_EGFP質(zhì)粒（構(gòu)建方法參見YiLiao,JianguoFeng,Qian Yi,HanweiCui,LingHeandLilingTang*.AsiRNAsystembasedonHSP70promoter resultsincontrollableandpowerfulgenesilencingbyheat-induction. BiotechnologyProgress. 2013 ;29 (5) : 1289-97)，回收骨架載體，將回收的目的片段和骨 架載體用T4連接酶連接，從而成功獲得phTERTp-EGFP質(zhì)粒。
[0045] 2、構(gòu)建phTERT/HSE(MN)p-EGFP質(zhì)粒
[0046] 將實(shí)施