一種纖維素酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種纖維素酶，編碼該酶的基 因，含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是指能夠水解纖維素 β -1，4-葡萄糖苷鍵，使得纖維素變成纖維二糖 和葡萄糖的一類酶系的總稱，根據(jù)對糖苷鍵不同的催化作用，可以分為外切葡聚糖苷酶 (1，4_ β -D-glucanase 或 exo-1, 4_ β -D-glucanase，EC3. 2. 1. 91，來自真菌的簡稱 CBH，來 自細菌的簡稱 Cex)，內(nèi)切葡聚糖苷酶（1，4_ β -D-glueanase 或 end〇-l，4_ β -D-glueanase， EC 3. 2. I. 4, CMC酶，來自真菌的簡稱EG，來自細菌的簡稱Cen)和β -葡聚糖苷酶 (0-l，4-glucosidase，EC3. 2. 1.21，簡稱BG)。其中內(nèi)切葡聚糖苷酶作用于纖維素分子內(nèi) 部的無定型區(qū)，能隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長的纖維素分子截短，產(chǎn)生大量不同長度的 帶非還原性末端的小分子纖維素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種纖維素酶，編碼該酶的基因， 含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明旨在提供一種從芽孢桿菌sp. 48-1中分離得到的纖維素酶基因，該 基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQ ID NO. 2所示，或與SEQ ID NO. 2互補的核苷 酸序列，該基因序列長度為1086 bp (堿基)。
[0005] 本發(fā)明的核苷酸序列是DNA形式的，包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA，可 以是單鏈的或是雙鏈的。由于核苷酸序列的特殊性，任何與SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序 列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸變體，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。所 述多核苷酸變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列，可以使用本領(lǐng)域所 熟知的取代、缺失或插入變異來獲得。
[0006] 本發(fā)明中的纖維素酶基因編碼的氨基酸序列是具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸殘 基序列的多肽或蛋白質(zhì)。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸 序列的多肽片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物與SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸殘基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白質(zhì)，均在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。這些方法包括氨基酸序列中氨基酸殘基的缺失、插入、化學(xué)修飾或替換，所述蛋白可以 是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種含有纖維素酶基因的重組表達載體，是將SEQ ID NO. 2所示基因直接與不同表達載體連接所構(gòu)建的重組載體。
[0008] 本發(fā)明中，編碼纖維素酶的多核苷酸序列可以插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明 所述的重組載體。載體是指本領(lǐng)域所熟知的質(zhì)粒、病毒或其他載體，建議優(yōu)選PET載體系列 及其他原核表達載體。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼纖維素酶的核苷酸序 列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技 術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述編碼纖維素酶的核苷酸序列可以有效連接到表達載體中的適當 啟動子上，以指導(dǎo)mRNA的合成。這些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的Iac或trp啟動 子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和 晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細 胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子 等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA 表達的順式作用因子，通常大約有10_300bp，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄，如腺病毒增 強子。
[0009] 本發(fā)明中，編碼纖維素酶的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可以用本領(lǐng)域 的技術(shù)人員熟知的方法轉(zhuǎn)化或者導(dǎo)入到宿主細胞中，該細胞可以是細菌細胞、真菌細胞、植 物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代，代表性例子有：大腸桿菌；真菌細胞或酵母； 植物細胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細胞如CHO、COS或Bowes黑 色素瘤細胞等。
[0010] 本發(fā)明還涉及所述編碼基因在制備重組纖維素酶中的應(yīng)用，通過常規(guī)的重組DNA 技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可以構(gòu)建表達或生產(chǎn)重組的纖維素酶。一般來說可以通 過以下步驟實現(xiàn)：構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化入宿主細胞構(gòu)建重組細胞，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿 主細胞，從培養(yǎng)基或細胞中分析、純化蛋白質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為： 本發(fā)明利用大腸桿菌表達系統(tǒng)構(gòu)建了纖維素酶的工程菌，可以用來快速、大量表達纖 維素酶。所需培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件簡單，工藝簡單，周期短，可以大大降低生產(chǎn)成本。在構(gòu)建載 體時在纖維素酶的C-末端加入了組氨酸（His)標簽，可與鎳柱特異性結(jié)合，便于純化。該 纖維素酶基因來源于烤煙表面微生物基因組，可以利用生產(chǎn)的纖維素酶作用于烤煙純化過 程，進而改變烤煙純化進程，有利于改善煙葉品質(zhì)。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌BL21 (DE3)表達載體48-pET-30a ; 圖2為本發(fā)明中重組質(zhì)粒的雙酶切圖譜，圖中：M是marker ;泳道1是重組質(zhì)粒，泳道2 是雙酶切結(jié)果，泳道3是克隆產(chǎn)物。
[0013] 圖3是本發(fā)明SDS-PAGE檢測純化效果示意圖，圖中M是marker，泳道1是未加誘 導(dǎo)劑對照；2是未純化的誘導(dǎo)表達蛋白；3是純化后的蛋白。
[0014] 圖4為本發(fā)明中用不同濃度咪唑洗脫蛋白后SDS-PAGE檢測結(jié)果示意圖，圖中M是 marker，泳道 1~8 分別為 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 500mmol/l 咪唑洗脫液。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0016] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā) 明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件 或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未