成人骨髓中Muse細胞誘導為神經(jīng)前體細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞生物技術領域，涉及一種細胞的分離和誘導分化，具體即從成人 骨髓中分離出Muse細胞并體外誘導成神經(jīng)前體細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 脊髓損傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞大量凋亡、死亡，僅存的極少 量神經(jīng)干細胞無法足量補充丟失的神經(jīng)細胞，且受損的神經(jīng)元再生能力也相對較弱，這是 導致軸突再生和功能恢復障礙的重要原因之一。為了補充丟失的神經(jīng)細胞，有必要對損傷 脊髓進行細胞治療，而如何選取合適的種子細胞則是細胞治療面臨的首要和關鍵問題。各 種干細胞因為具有多向分化潛能和自我復制能力而被廣泛應用，目前已報道的應用研究于 神經(jīng)損傷的干細胞有：（1)成體干細胞：由于是天然的多能干細胞，曾被認為能安全應用于 臨床，但是由于它們最初在活體器官中的角色是維持和修補其所在組織的細胞類型，因此 分化能力較為局限，尤其在來源較方便、研究較多的中胚層干細胞跨胚層分化方面更是如 此；即使是同一分化方向的神經(jīng)干細胞，也由于取材困難同樣較難應用于臨床。（2)胚胎干 細胞（embryonic stem cell，ES cell):是從胚泡內(nèi)細胞群分離得到的全能干細胞，能經(jīng)誘 導分化為機體幾乎所有的細胞類型，但由于倫理學問題和致瘤性而備受爭議。（3)誘導多 能干細胞（induced pluripotent stem cell, iPS cell):可以從體細胞得到在細胞倍增能 力、分化能力等方面都與ES細胞相似的多能干細胞，且沒有倫理學爭議；但是添加4個重新 編程基因或取代疾病細胞中有缺陷基因的方法都可能有致瘤的副作用，目前還沒有明確的 檢測和消除其所含未分化致瘤細胞的方法。（4)間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs):存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的多種組織中，如真皮、骨髓、脂肪組織和臍帶等中均可 分離和制備MSCs。與造血干細胞和神經(jīng)干細胞等一般成體干細胞不同，MSCs的成分復雜， 且各種細胞分化能力差異較大，其中僅少部分細胞的分化方向較廣泛，具有向內(nèi)、中、外三 個胚層分化和自我更新的干細胞特性，且與ES細胞相比沒有倫理學的困擾，因此成為細胞 替代治療和組織工程的熱點細胞。目前研究最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，大部分報 道是通過差速貼壁法來分離獲取這種細胞，實際上得到的是骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells, BMSCs)，免疫表型鑒定為 CD29、CD49、CD73、CD90、CD105 和 Stro-I 陽性， ⑶Ilb和⑶45陰性。雖然BMSCs已被證明在體外、體內(nèi)能分化為神經(jīng)細胞，我們前期試驗也 發(fā)現(xiàn)體內(nèi)移植BMSCs可以少部分分化為neurofilament (NF)免疫反應陽性的神經(jīng)細胞，但分 化率僅5%左右。所以實際上BMSCs中存在的MSCs僅是一群數(shù)量少、且分化能力有差異的 干細胞亞群，僅通過貼壁這種簡單的篩選方法得到的原代培養(yǎng)細胞大多是異種間充質(zhì)細胞 群，含有大比例的多種不同表型和功能的非干細胞；當移植到體內(nèi)，能真正分化為所在組織 相關細胞的數(shù)量極少，多數(shù)報道僅為百分之幾，而更多的陽性效果可能是由于移植細胞分 泌細胞因子等方面的間接作用，因此這種方法得到的BMSCs作為種子細胞移植并不能充分 發(fā)揮干細胞治療的優(yōu)勢。當采用BMSCs作為脊髓損傷修復應用的種子細胞時，植入前即有 必要對其進行純化，篩選出其中真正的多能干細胞，以進一步提高干細胞移植治療的效果。
[0003] 2010年，Mari Dezawa等從BMSCs和皮膚纖維母細胞中分離出多系分化持續(xù)應 激細胞（multilineage differentiating stress enduring cells, Muse cells), Muse 細胞可以從間充質(zhì)中，如皮膚、脂肪組織、骨髓中分離得到，對胰蛋白酶長時間孵育等限制 性的培養(yǎng)條件有很好的適應力。Muse細胞表現(xiàn)未分化胚胎干細胞標記物一階段特異性 胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen-3，SSEA-3)陽性，以及間充質(zhì)細胞標記 物⑶105、⑶29、⑶90陽性。Muse細胞在黏附培養(yǎng)基中呈成纖維細胞樣形態(tài)；單個Muse 細胞懸浮培養(yǎng)后，細胞開始增殖并形成細胞球，其形態(tài)類似于ES細胞的胚狀體，并表達 多能干細胞相關標志物，如0ct3/4、Sox2、Nanog和ALP等；但不表達其他干細胞的標記 物，如造血干細胞（⑶34、⑶117)、皮膚前體細胞（Snail、Slug)、神經(jīng)嵴前體細胞（⑶271、 SoxlO)、血管周細胞（NG2、CD146)和內(nèi)皮前體細胞（CD31、von Willebrand factor)等， 表明Muse細胞與骨髓、真皮等間充質(zhì)中的已知干細胞不同。通過實驗確認Muse細胞至 第5代仍具有自我更新的能力。當Muse細胞球轉(zhuǎn)移至明膠培養(yǎng)基中，可自發(fā)分化為三 個胚層的細胞：內(nèi)胚層細胞（肝細胞、膽管細胞），中胚層細胞（骨細胞、平滑肌細胞）， 外胚層細胞（表皮細胞）。雖然都具有向三個胚層分化的潛能，但與ES細胞和iPS細胞 不同的是，Muse細胞移植進入免疫缺陷小鼠體內(nèi)并不會形成畸胎瘤（參見文獻：Kuroda Y，Kitada Mj Wakao S，et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 ； 107 (19):8639 - 43. ；Kitada MjWakao Sj Dezawa M. Muse cells and induced pluripotent stem cell: implication of the elite model. Cell Mol Life Sci. 2012 ;69 (22) :3739 - 50. ;Wakao S，Kitada M，Kuroda Y，et al. Multilineage-differentiating stress-enduring(Muse)cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 ;108(24) :9875-80.) ?
[0004] 綜上所述，Muse細胞是在天然單細胞水平上具有多能干細胞特性和自我更新能力 的干細胞，它同時克服了 ES細胞、iPS細胞以及其他成體干細胞在體內(nèi)移植治療研究中的 許多不足。Muse細胞作為理想的種子細胞已被用于一些小鼠損傷的模型修復研究中，如人 Muse細胞修復骨骼肌退變、糖尿病、急性重癥肝炎等，結果發(fā)現(xiàn)Muse細胞在這些損傷組織 中能順利和宿主組織整合并分別向相應胚層的細胞分化，最終促成組織重建。
[0005] 但Muse細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中，尤其是脊髓損傷方面的應用研究還未見報道，也無 文獻報道從成人骨髓中分離出Muse細胞并體外誘導成神經(jīng)前體細胞（neural precursor cells, NPCs)。
[0006] 本領域也一直致力于尋找在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后進行細胞治療和組織工程治療的合 適的種子細胞，種子細胞需要尋找取材方便、增殖力強、無倫理學問題的新的細胞來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種從成人的骨髓中分離出Muse細胞，并體外誘導成神 經(jīng)前體細胞（Muse-NPCs)的方法，本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法制備得到的神經(jīng)前 體細胞。
[0008] 新近發(fā)現(xiàn)的Muse細胞是不同于已知干細胞的獨特亞群，存在于骨髓、BMSCs等間 充質(zhì)或間充質(zhì)細胞中，可以從自體方便獲取，具有多能干細胞標志及生物學特性。從骨髓中 分離出Muse細胞，并經(jīng)體外誘導為Muse-NPCs作為種子細胞，可以為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的干細 胞治療和組織工程治療提供有力的支持。
[0009] 本發(fā)明的技術關鍵在于，如何將成人骨髓中的Muse細胞篩選、分離出來，如何將 Muse細胞在體外成功誘導成Muse-NPCs。
[0010] 本發(fā)明提供了一種從成人的骨髓中分離Muse細胞并誘導分化為神經(jīng)前體細胞 (Muse-NPCs)的方法，流程如圖1所示，具體步驟如下：
[0011] A、從成人骨髓中分離、培養(yǎng)Muse細胞：
[0012] 將健康成人骨髓采用密度梯度離心法分離骨髓單核細胞，所述的密度梯度離心 法，為本領域常規(guī)技術，可參見 Sch〖ick LM, Noack S, Weist R, Jagodzinski M, Krettek Cj Buettner M，Hoffmann A. Analysis of surface protein expression in human bone marrow stromal cells:new aspects of culture-induced changes, inter-donor differences and intracellular expression. Stem Cells Dev.2013Dec 15 ； 22(24) :3226-35.
[0013] 采用差速貼壁法，24小時后BMSCs貼壁，倒去懸浮的未貼壁細胞，加入新的 DMEM/F12完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)5天至10天（最優(yōu)為7天），所述的差速貼壁法，為本 領域常規(guī)技術，可參見 Mareddy Sl，Crawford R，Brooke G，Xiao Y. Clonal isolation and characterization of bone marrow stromal cells from patients with osteoarthritis. Tissue Eng. 2007Apr ；13 (4):819-29.
[0014] 用0· 25% Trypsin-EDTA重懸貼壁細胞，并以IO5Ail的密度接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 6小時至10小時（最優(yōu)為8小時），終止胰酶反應后洗滌，MC培養(yǎng)基重懸細胞，以8X IO3/ ml的密度，每孔Iml接種于預先經(jīng)過polyHEM包被處理的培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)，3-7天后