生防菌株x1中試發(fā)酵工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術領域，涉及一種枯草芽孢桿菌Xl的發(fā)酵工藝。
【背景技術】
[0002] 拮抗能力強且抗菌譜廣的優(yōu)良菌種是中草藥土傳病害生物防治研究和微生物菌 劑研制的關鍵，而適宜的生產(chǎn)方法和培養(yǎng)條件則是發(fā)揮優(yōu)良菌種性能的保證。在篩選獲得 高效廣譜生防菌株后，為最終達到產(chǎn)業(yè)開發(fā)目的，需要對目的菌株進行液體深層發(fā)酵研究， 包括適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基篩選、液體發(fā)酵條件的優(yōu)化和中試生產(chǎn)工藝的確定。
[0003] 搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵對微生物的生長存在很大差異，將搖瓶發(fā)酵的實驗條件直 接放大到生產(chǎn)罐，菌株的生長往往不相一致。為了能夠適應工業(yè)生產(chǎn)的需要，消除這兩種規(guī) 模發(fā)酵結(jié)果的差異，將搖瓶發(fā)酵的實驗結(jié)果有效的應用到大型生產(chǎn)當中去，就必須經(jīng)過實 驗室小型發(fā)酵罐發(fā)酵條件研究。在了解菌株在發(fā)酵罐中的代謝規(guī)律的情況下，合理建立小 型發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝后，才能進行中試規(guī)模的發(fā)酵研究或工廠規(guī)模的發(fā)酵研究。
[0004] 中間試驗是小試完成后，在概念設計基礎上進行的，介于實驗室裝置與工業(yè)裝置 之間的研究型試驗，是工程研究的基礎，也是過程開發(fā)的一個重要環(huán)節(jié)。通過中試后，可使 工業(yè)裝置獲取相對較大的安全系數(shù)，及早發(fā)現(xiàn)實驗室工作無法觀察到的現(xiàn)象，糾正設計中 可能出現(xiàn)的失誤。中試工作必須按工業(yè)化條件進行，其目的和作用如下：（1)建立一定規(guī)模 的工業(yè)模擬裝置，對新工藝過程進行全面模擬考察，明確操作條件和控制方法。（2)考察實 驗室研究結(jié)果在工業(yè)規(guī)模下實現(xiàn)的技術及經(jīng)濟可行性。（3)考察工業(yè)因素對工藝過程和設 備的影響，發(fā)現(xiàn)和解決實際生產(chǎn)條件下可能發(fā)生的各種問題。
[0005] -般來說微生物在不同體積的反應器中的生長速率是不同的，原因可能是，罐的 深度造成氧的溶解度、空氣停留時間和分布不同，剪切力不同，滅菌時營養(yǎng)成分破壞程度不 同所致。發(fā)酵罐的規(guī)模變化，無論是絕對值還是相對值都會引起許多物理和生物參數(shù)的改 變，從而很難使大、小規(guī)模過程中菌體所處的外界環(huán)境保持一致，在放大生產(chǎn)時就會常常出 現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)水平不穩(wěn)定或者發(fā)酵產(chǎn)率太低，最終導致研究成果長期停留在實驗室的研究階 段，無法進行大規(guī)模生產(chǎn)應用。要將實驗室研究中的優(yōu)化培養(yǎng)或發(fā)酵結(jié)果轉(zhuǎn)移到工業(yè)規(guī)模 的發(fā)酵生產(chǎn)過程中去，保證規(guī)模放大后能夠在大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中同樣取得成功的效 果，則需要進行規(guī)模更大一些的發(fā)酵條件的研究或工廠規(guī)模的中間試驗，以驗證在實驗室 研究階段的發(fā)酵工藝，然后才能放大到工廠規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種生防菌株Xl中試發(fā)酵工藝，在100L自控罐發(fā)酵工藝的 基礎上，對生防菌株Xl進行了 2000L罐放大中間試驗的研究。通過研究菌體在中試條件下 的生長，為進行該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗基礎和依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0008] -種生防菌株Xl發(fā)酵培養(yǎng)基，包括如下成分：葡萄糖I. 0~1. 5%，酵母膏0. 5~ 0.8%，淀粉0? 1~0.3%，磷酸氫二鈉0.2~0.4%，磷酸二氫鈉0? 10~0.20%，硫酸鎂 0.04~0.06 %，碳酸鈣0.05~0. 15 %，硫酸錳0.05~0. 15%，加蒸餾水至1000毫升，調(diào) 節(jié)pH7. 5-8. 0,115°C滅菌 25 分鐘。
[0009] -種利用上述培養(yǎng)基對生防菌株Xl進行中試發(fā)酵的工藝，包括如下步驟：
[0010] (1)用4~6mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后轉(zhuǎn)接入裝有 40~60mL種子培養(yǎng)基的茄瓶中，于20~40°C恒溫箱中培養(yǎng)16~20h，加入無菌水用玻璃 棒平刮菌苔，制成孢子懸浮液，作為種子液。
[0011] (2)將種子液接種到裝有1400~1600L培養(yǎng)基的2000L發(fā)酵罐中通氣攪拌培養(yǎng)， 保持發(fā)酵溫度30±0. 5°C;攪拌速度80~100r/min;罐壓0. 5~IMPa;通氣量開始時0. 8(V/ V.min)，6~IOh后提高至I. 0 (V/V.min)，22 ~26h后降為 0? 8 (V/V.min);接種量L5 ~ 2. 〇% ;發(fā)酵時間36~40h。
[0012] 在生防菌株Xl2000L罐的中試生產(chǎn)中，種子由固體培養(yǎng)基前瓶培養(yǎng)后完全生成 孢子，制備孢子懸浮液后由容器中直接移入2000L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，操作簡便，不易 污染雜菌。
【附圖說明】
[0013] 圖1為菌株Xl生長曲線（100L);
[0014] 圖2為不同培養(yǎng)時間菌液的pH值（100L);
[0015] 圖3為菌株Xl生長曲線（2000L);
[0016] 圖4為不同培養(yǎng)時間菌液的pH值（2000L);
[0017] 圖5為Xl菌株的芽孢形態(tài)。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0019] 本發(fā)明提供了一種生防菌株Xl的中試發(fā)酵工藝，包括以下內(nèi)容：
[0020] 1材料與方法
[0021] I. 1 菌株
[0022] 生防菌株Xl:CGMCCNO. 4037。
[0023] L2培養(yǎng)基
[0024] 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氫二鈉0.3%，磷酸二氫鈉0. 15%， 硫酸鎂0. 05%，碳酸鈣0. 01 %，硫酸錳0. 01 %。調(diào)節(jié)PH7. 5-8. 0,115°C滅菌25分鐘。
[0025] 1. 3 方法
[0026] 1. 3. 1生防菌株Xl的100L自控罐液體深層發(fā)酵研究
[0027] 采用發(fā)酵罐（江蘇鎮(zhèn)江MCGS-100L)進行發(fā)酵培養(yǎng)，其操作如下：
[0028] (1)培養(yǎng)前的發(fā)酵罐要做好準備工作，確保電源供應，檢查冷卻水水源，檢查空氣 氣源；在發(fā)酵罐內(nèi)注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基必須浸沒攪拌槳葉；打開排氣過濾器頂部的排氣閥；
[0029] (2)在溫度控制器上設定發(fā)酵溫度和滅菌溫度；
[0030] (3)選擇控制模式中的"滅菌"項，滅菌開始；
[0031] (4)滅菌結(jié)束后，待溫度冷卻到發(fā)酵溫度后，在接種口上方點燃纏酒精棉的鐵圈， 打開接種口，接入培養(yǎng)好的種子液；選擇控制模式中的"發(fā)酵"項，發(fā)酵開始；
[0032] (5)定時取發(fā)酵液，檢測菌濃度和芽孢形成狀況，確定最佳的培養(yǎng)時間。
[0033]用5mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70 °C冰柜中枯草芽孢桿菌菌種，然后轉(zhuǎn)接入裝有 IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于30°C，150r/min條件下培養(yǎng)18h，制成種子發(fā)酵液。 將種子發(fā)酵液按1.5%的接種量接種到裝有751培養(yǎng)基的（1?1^-1001)發(fā)酵罐中，在30 1€ 的條件下，保持通氧量在50%的水平，通氣攪拌培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中，每隔6h取樣測定發(fā)酵 液的OD6。。值，繪制菌株生長曲線。另外每隔8h取樣測定發(fā)酵液的pH值。
[0034]L3. 2生防菌株Xl的2000L自控罐液體深層發(fā)酵研究
[0035] 采用發(fā)酵罐（DS-Y-500L-2000L智能發(fā)酵罐）進行發(fā)酵培養(yǎng)，其操作如下：
[0036] (1)培養(yǎng)前的發(fā)酵罐要做好準備工作，確保電源供應，檢查冷卻水水源，檢查空氣 氣源；在發(fā)酵罐內(nèi)注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基必須浸沒攪拌槳葉；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值至7. 5;打開 排氣過濾器頂部的排氣閥；
[0037] (2)在溫度控制器上設定發(fā)酵溫度和滅菌溫度；
[0038] (3)選擇控制模式中的"滅菌"項，滅菌開始；
[0039] (4)滅菌結(jié)束后，待溫度冷卻到發(fā)酵溫度后，在接種口上方點燃纏酒精棉的鐵圈， 將裝有孢子懸浮液的接種瓶與接種口相連，將培養(yǎng)好的種子液由容器中移種入發(fā)酵罐；選 擇控制模式中的"發(fā)酵"項，發(fā)酵開始；
[0040] (5)定時取發(fā)酵液，檢測菌濃度和芽孢形成狀況，確定最佳的培養(yǎng)時間。
[0041] 用5mLNYD培養(yǎng)基活化存于-70°C冰柜中枯草芽孢桿菌菌種，然后轉(zhuǎn)接入裝有50mL 種子培養(yǎng)基的茄瓶中，于30°C恒溫箱中培養(yǎng)18h，加入無菌水用玻璃棒平刮菌苔，制成孢子 懸浮液，作為種子液。將種子液接種到裝有1500L培養(yǎng)基的DS-Y-2000L發(fā)酵罐中通氣攪拌 培養(yǎng)。保持發(fā)酵溫度30±0. 5°C;攪拌速度lOOr/min;罐壓0. 5;通氣量開始時I:0. 8WM， 7h后提高至I:lVVM，20h后降為I:0. 8VVM;裝液量1500L，接種量2%;發(fā)酵時間40h。在發(fā) 酵過程中，每隔4h從取樣口取樣測定發(fā)酵液的0D_值，繪制菌株生長曲線；測定發(fā)酵液的 pH值，掌握發(fā)酵過程中pH值的變化規(guī)律。
[0042] 2結(jié)果與分析
[0043] 2. 1生防菌株Xl的IOOL自控罐液體深層發(fā)酵研究
[0044] 在生防菌株Xl的中試發(fā)酵中，為了降低生產(chǎn)成本，提高芽孢形成率，用酵母膏替 代培養(yǎng)基中的牛肉膏，同時增加了MgS04、CaCO3和、MnSO