干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞凍存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙周炎是累及四種牙周支持組織（牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)）的慢性感染性 疾病，往往引發(fā)牙周支持組織的炎性破壞。在35歲以后較為多見。常見病因?yàn)榫?、牙石?創(chuàng)傷性咬合、食物嵌塞、不良修復(fù)體、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁 的炎癥、牙槽骨吸收、牙齒逐漸松動(dòng)。嚴(yán)重的牙周炎會(huì)造成牙齒脫落，從而導(dǎo)致咀嚼功能低 下而引起消化不良及胃腸病，影響全身心的健康。
[0003] 治療牙周炎的主要在于消除炎癥，促進(jìn)被破壞的牙周組織的再生，恢復(fù)牙齒的正 常功能。臨床常采用的牙周炎治療方法包括：牙周基礎(chǔ)治療（潔治、刮治、根面平整）、牙周 翻瓣術(shù)及牙周組織再生術(shù)。
[0004] 牙周基礎(chǔ)治療：潔治，也稱潔牙，俗稱洗牙，其是預(yù)防和治療牙病的一種方法。即 用潔治器械清除齦上牙石、菌斑和牙面上附著的色素，并拋光牙面，是防止菌斑和牙石再沉 積，防治牙周病的措施。在潔治時(shí)還應(yīng)該將齦溝內(nèi)與齦上牙石相連的一部分齦下牙石也一 并清除掉。根據(jù)所用的器械不同，齦上潔治術(shù)分為手用器械潔治法和超聲波潔牙機(jī)潔治法。 對(duì)于牙齦炎患者，每6~12個(gè)月作一次潔治，可有效地維護(hù)牙周健康。齦下刮治術(shù)，即根面 平整術(shù)，其是用手工的齦下刮治器械伸入牙周袋內(nèi)去除附著于牙周袋內(nèi)根面上和嵌入牙骨 質(zhì)內(nèi)的齦下牙石和菌斑，并刮除牙根表面受到毒素污染的病變牙骨質(zhì)，從而形成光滑、清潔 的根面，使根面具有生物相容的表面，有利于牙周組織的附著和新生。根面平整術(shù)不應(yīng)用于 健康牙周部位，以免導(dǎo)致牙周附著喪失。
[0005] 牙周翻瓣術(shù)：指采用不同的手術(shù)切口，將牙齦與下方的組織分離，形成牙齦組織 瓣，暴露病變區(qū)的根面和牙槽骨，提供清創(chuàng)入路和可視性。刮除病變組織和菌斑牙石后，將 牙齦瓣復(fù)位在合適的位置上并縫合，達(dá)到消除牙周袋或使牙周袋變淺的目的。
[0006] 牙周組織再生術(shù)：在已經(jīng)缺失的牙槽骨區(qū)植入人工骨，并覆蓋專用的生物引導(dǎo)膜， 使牙周膜上的細(xì)胞選擇性地在根面上生長(zhǎng)，從而達(dá)到牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)的再生。通過 這種骨植和生物膜的技術(shù)，恢復(fù)已經(jīng)破壞的牙槽骨、牙齦及其他的牙周組織，完成牙齒的重 新穩(wěn)定。
[0007] 以上方法無(wú)法修復(fù)損傷的牙周附著及牙槽組織，不能滿足目前臨床上對(duì)口腔頌面 部組織缺損修復(fù)再生及功能、外形恢復(fù)的要求，其次牙周炎治療通過抗生素來控制菌斑生 長(zhǎng)，進(jìn)行全身和局部的藥物治療。但抗生素副作用較多，病原微生物也會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
[0008] 牙髓干細(xì)胞（dentalpulpstemcells，DPSCs)是存在于牙齒牙髓組織中的一類 具有自我更新、增殖能力強(qiáng)，及多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞具有多向分化 的潛能，它除了能形成礦化結(jié)節(jié)能力的細(xì)胞外，經(jīng)過不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，還能夠分化為脂 肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)等細(xì)胞系類型。據(jù)報(bào)道，牙髓干細(xì)胞在牙周炎治療中 可起到很好的修復(fù)作用，作用機(jī)制為：通過植入局部并分化為缺損細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，趨 化干細(xì)胞到局部，抑制局部炎癥，促進(jìn)局部血管新生。
[0009] 目前，用于牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞凍存液的配方為10%DMS0+90%FBS，該細(xì)胞凍存液 在保存或運(yùn)輸牙髓干細(xì)胞的過程中會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定損傷作用，使得牙髓干細(xì)胞活率未達(dá)到 理想水平，影響其治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明提供了干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞凍存方法。該干細(xì)胞凍存液可顯 著減少凍存液對(duì)細(xì)胞的損傷作用，從而可顯著提高干細(xì)胞的活率；本發(fā)明選用無(wú)血清培養(yǎng) 基，避免了血清帶來的潛在污染。。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0012] 本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞凍存液，包括DMS0、羥乙基淀粉和無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0013] 作為優(yōu)選，以體積百分含量計(jì)，DMSO占5%~15% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀 粉占1 %~3% ;余量為無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0014] 優(yōu)選地，以體積百分含量計(jì)，DMSO占10% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀粉占1% ; 余量為無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0015] 優(yōu)選地，以體積百分含量計(jì)，DMSO占15% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀粉占2% ; 余量為無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0016] 優(yōu)選地，以體積百分含量計(jì)，DMSO占5% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀粉占3% ; 余量為無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0017] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，干細(xì)胞凍存液用于凍存牙髓干細(xì)胞。但本發(fā)明并 不限定于凍存牙髓干細(xì)胞，其它種類的干細(xì)胞也可用本發(fā)明提供的干細(xì)胞凍存液凍存。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種干細(xì)胞凍存方法，采用本發(fā)明的干細(xì)胞凍存液凍存干細(xì)胞； 該干細(xì)胞凍存液包括DMS0、羥乙基淀粉和無(wú)血清培養(yǎng)基；作為優(yōu)選，以體積百分含量計(jì)， DMSO占5%~15%;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀粉占1%~3%;余量為無(wú)血清培養(yǎng)基；優(yōu) 選地，以體積百分含量計(jì)，DMSO占10% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀粉占1% ;余量為無(wú) 血清培養(yǎng)基；優(yōu)選地，以體積百分含量計(jì)，DMSO占15% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥乙基淀粉占 2% ;余量為無(wú)血清培養(yǎng)基；優(yōu)選地，以體積百分含量計(jì)，DMSO占5% ;以質(zhì)量百分含量計(jì)，羥 乙基淀粉占3% ;余量為無(wú)血清培養(yǎng)基；在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，干細(xì)胞凍存液用于 凍存牙髓干細(xì)胞。
[0019] 作為優(yōu)選，干細(xì)胞的密度為（0. 1~10)XIO6細(xì)胞/mL。
[0020] 優(yōu)選地，干細(xì)胞的密度為IXIO6細(xì)胞/mL。
[0021] 作為優(yōu)選，凍存的溫度<-80°c。
[0022] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，凍存的溫度為_180°C。
[0023] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，干細(xì)胞為牙髓干細(xì)胞。
[0024] 作為優(yōu)選，干細(xì)胞為P3代干細(xì)胞。
[0025] 本發(fā)明提供了干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞凍存方法。該干細(xì)胞凍存液包括DMSOJSZ 基淀粉和無(wú)血清培養(yǎng)基。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢(shì)之一：
[0026] 本發(fā)明提供的干細(xì)胞凍存液可顯著減少凍存液對(duì)細(xì)胞的損傷作用，從而可顯著提 高干細(xì)胞的活率；
[0027] 本發(fā)明選用無(wú)血清培養(yǎng)基，避免了血清帶來的潛在污染。
【附圖說明】
[0028] 圖1示復(fù)蘇后細(xì)胞活率柱狀圖；
[0029] 圖2示流式細(xì)胞儀檢測(cè)空白對(duì)照組細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況；
[0030] 圖3示流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明公開了干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞凍存方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi) 容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施 例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和 應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0032] 本發(fā)明提供的干細(xì)胞凍存液及干細(xì)胞凍存方法中所用試劑、儀器均可由市場(chǎng)購(gòu) 得。
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0034] 實(shí)施例1~3牙髓干細(xì)胞的制備
[0035] (一）分離培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞：
[0036] 經(jīng)家屬同意后，收集6歲-10歲兒童臨床上因滯留而拔除的乳切牙，要求沒有牙體 牙髓病變及壞死。拔除后立即放于4°C遇冷的裝有含有雙抗（100yg/mL青霉素、100yg/mL 鏈霉素）的PBS離心管中，24小時(shí)內(nèi)取出使用。
[0037] 取出牙齒，利用含雙抗的PBS溶液反復(fù)沖洗三次，將牙齒包在無(wú)菌紗布中用鉗夾 裂牙齒，暴露牙髓組織；用無(wú)菌鑷子夾取牙髓組織，切除根尖部Imm的牙髓組織。根據(jù)牙髓 組織大小，用眼科彎剪將牙髓組織剪成1mm3,置于50mL離心管中。加入10倍體積的5g/ LI型膠原酶，封口后充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至恒溫空氣搖床中，37°C、200R消化20min，再用 2000rpm離心3min。丟棄上清。，用30mLPBS清洗沉淀，反復(fù)吹打離散細(xì)胞團(tuán)塊，通過70um 的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，以獲得單個(gè)離散的細(xì)胞，1000 rpm離心5min。丟棄上清，沉淀用無(wú)血清培 養(yǎng)基重懸，以（0. 5~I. 5)X104/cm2接種至六孔板中，每孔加入2mL無(wú)血清培養(yǎng)基，再加入 表皮生長(zhǎng)因子EGF與堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(兩者終濃度為lOng/mL)，混勻細(xì)胞懸液，放 于37°C、濕度為95%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d換液1次，7-14d左右在顯微鏡下能 觀察到克隆的形成，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80% -90%匯合時(shí)，0. 125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳 代培養(yǎng)。
[0038] (二）牙髓干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)及凍存：
[0039] 當(dāng)上述原代細(xì)胞的細(xì)胞匯合度達(dá)80% -90%后，用0.1%-0.25%胰蛋白酶消化， 以1000-1500rpm離心5min，按照（0.5-1. 5)XIO4細(xì)胞/cm2細(xì)胞密度傳代，傳代培養(yǎng)的培 養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基+表皮生長(zhǎng)因子EGF與堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(兩