一種腫瘤特異性til細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤特異性TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤過繼免疫治療（adoptiveimmunotherapy，ACI)是指通過向腫瘤患者輸注具 有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的 目的。它包括非特異性激活和特異性激活的效應(yīng)細(xì)胞，前者是采用非特異性刺激因子（IL2、 干擾素）刺激前體效應(yīng)細(xì)胞，使其活化為具有抗腫瘤活性的效應(yīng)細(xì)胞，如LAK細(xì)胞、腫瘤浸 潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokineinducedkillcells，CIK)等； 特異性激活的效應(yīng)細(xì)胞是指采用腫瘤抗原作刺激物所誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，如樹突狀細(xì) 胞（DC)，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD8+細(xì)胞）等。ACI在惡性實(shí)體腫瘤治療中的應(yīng)用已引起了 人們的普遍關(guān)注。
[0003] HL細(xì)胞是特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，其殺瘤活性較LAK細(xì)胞強(qiáng)50~100 倍；TIL細(xì)胞療法是一種特異性免疫活性細(xì)胞療法，盡管其用于腫瘤治療領(lǐng)域已有20多年 的歷史，但至今一直有新技術(shù)、新成果在不斷報(bào)道。2004年SteveRosenberg教授在PNAS 上發(fā)表文章指出：腫瘤特異性的TIL治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床有效率大于50%，35個(gè)病 人中18名病人有響應(yīng)，其中4人完全響應(yīng)。TIL因其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性殺傷作 用，因而一直是國(guó)內(nèi)外惡性腫瘤生物治療的熱點(diǎn)之一。
[0004] 但是TIL細(xì)胞制備技術(shù)復(fù)雜，通常需要篩選上百個(gè)甚至幾百個(gè)T淋巴細(xì)胞克隆才 能得到腫瘤特異性的TIL細(xì)胞，同時(shí)目前，體外培養(yǎng)TIL細(xì)胞主要還是用含有人血清或FBS 的培養(yǎng)基，使用動(dòng)物血清的缺點(diǎn)是有潛在傳播傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，以及由于異種蛋白導(dǎo)致過敏 癥的發(fā)生，而使用人AB血清的供應(yīng)量有限，而且也存在傳播傳染病的風(fēng)險(xiǎn)。這些因素嚴(yán)重 地限制了其的應(yīng)用和有效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供簡(jiǎn)便、有效的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn) 有技術(shù)的缺陷。
[0006] 為此，本發(fā)明公開了一種腫瘤特異性TIL細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括下列步驟：
[0007] 無菌條件下制備固體腫瘤單細(xì)胞懸液或采集惡性胸腔積液或腹水；
[0008] 采用淋巴細(xì)胞分離液離心，收集含淋巴細(xì)胞的云霧狀細(xì)胞層；
[0009] 云霧狀細(xì)胞層用無菌緩沖液洗一次，再用無血清培養(yǎng)液洗一次，離心收集細(xì)胞；
[0010] 按IX106/ml的濃度將細(xì)胞懸于無血清培養(yǎng)液中，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中 而后置于飽和濕度、37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后取出，收集懸浮細(xì)胞；
[0011] 懸浮細(xì)胞采用磁珠分離儀分離⑶8+T細(xì)胞；
[0012] CD8+T細(xì)胞采用磁珠分離儀分離CD8+PD-1+T細(xì)胞；
[0013] ⑶8+PD_l+T細(xì)胞用無菌緩沖液洗一次，再用無血清培養(yǎng)液洗一次，離心收集細(xì)胞；
[0014] 按0.5-2.OXIO6Ail的濃度將⑶8+PD-l+T細(xì)胞懸于無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)的第1天 無血清培養(yǎng)液加入終濃度為lOU/ml的IFN-y、100ng/ml的PHA，40-50U/ml的IL-2 ;而后 隔1~2d加入含有IL-2 100U/ml的無血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)5-7天；
[0015] 含有IL-2lOOOU/ml的無血清培養(yǎng)液下每隔2-3天傳代培養(yǎng)，15-20天即可收集細(xì) 胞；
[0016] 所述無血清培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、維生素類物質(zhì)、微量元素、2-巰基乙醇、丙谷 二肽和甘油酯；
[0017]其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基是Iscove'sModifiedDulbecco'sMedia、或者是RPMI-1640,或 者是Dulbecco'sModifiedEagleMedium和Ham's_F12按照1:1的體積比例混合而成的。
[0018] 在一些實(shí)施例中，其中維生素類物質(zhì)含量為生物素1-5yM;肌醇0. 1-0. 2mM;葉酸 0. 01-0. 02mM;煙酸 0. 03-0. 05mM;砒洛醇 7-10yM;葉黃素 0. 5-1yM;硫銨 7-10yM;維生素 B12 0? 3-0. 9yM;泛酸鈣 0? 01-0. 03mM。
[0019] 微量元素：腐胺0.OlmM;乙醇胺0.ImM;亞油酸0.OOlmM;檸檬酸鐵10mg/L;硫 酸銅0? 05-0.IyM硫酸鋅5-10yM;硒酸鈉0? 01-0.IyM;氯化鋁0? 05-0. 01yM;碘化鉀 0? 04-0. 06yM;氯化鈷 0? 03-0. 07yM。
[0020] 其中2-巰基乙醇的含量為L(zhǎng)0-5. 0yg/ml;
[0021] 其中丙谷二肽的含量為0? 5-3mM。
[0022] 本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，能高效地增殖培養(yǎng)出腫瘤特異性TIL細(xì)胞，大大提高了TIL 細(xì)胞的殺瘤效果，同時(shí)采用無血清培養(yǎng)解決現(xiàn)有技術(shù)中潛在傳播病毒和其他危險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)， 為其今后的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0023] 圖1，不同培養(yǎng)基體外CD8+PD-1+T細(xì)胞增殖比較。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 除非另有指示或定義，否則所有所用術(shù)語均具有本領(lǐng)域中的通常含義，該含義將 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。
[0025] 參考例如標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，為進(jìn)一步詳細(xì)描述在本發(fā)明的實(shí)踐中所使用的常規(guī)技術(shù)， 實(shí)踐者可參看有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)、組織結(jié)構(gòu)學(xué)以及胚胎學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)的教科書及評(píng)論。包括 Teratocarcinomasandembryonicstemcell:Apracticalapproach[E.J.Robertson編， IRL出版有限公司，1987];GuidetotechniquesinMouseDevelopment[P.M.Wasserman 等編，學(xué)術(shù)出版社，1993]!EmbryonicStemCellDifferentiationinVitro[M. V.Wiles,Meth.EnzymoI.225:900,1993]!PropertiesandusesofEmbryonicStem Cells:ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy[P.D.Rathjen 等，Reprod.Fertil.Dev. 10:31，1998] 〇
[0026] 細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、和抗體技術(shù)可以在"蛋白科學(xué)中的當(dāng)前方案" [J. E.Colligan等編輯，Wiley&Sons]、"細(xì)胞生物學(xué)中的當(dāng)前方案" [J.S.Bonifacino等， Wiley&Sons]和"兔疫學(xué)功時(shí)當(dāng)亦方案" [J.E.Colligan等編輯，Wiley&Sons]中找到。與 本發(fā)明相關(guān)的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如BioRad、 Stratagene、InvitrogeruClonTech以及sigma-Aldrich公司。
[0027] 細(xì)胞培養(yǎng)方法通常在"動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：基本技術(shù)手冊(cè)"最新版本（R.I.Freshney編 輯，Wiley&Sons)細(xì)胞培養(yǎng)一般技術(shù)"(M.A.Harrison和I.F.Rae,劍橋大學(xué)出版）；和"胚 胎干細(xì)胞：方法和操作規(guī)定"(K.Turksen編輯，Humana出版）中有描述。組織培養(yǎng)基和試劑 可從商業(yè)供應(yīng)商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-NuncInternational、SigmaChemical Co.、以及ICNBiomedicals。以及本文中引用的一般現(xiàn)有技術(shù)；
[0028] 此外，除非另有說明，否則未具體詳述的所有方法、步驟、技術(shù)及操作均可以且已 經(jīng)以本身已知的方式進(jìn)行，該方式將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。亦參考例如標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)、上述 一般現(xiàn)有技術(shù)及其中引用的其他參考文獻(xiàn).以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的 實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0029] 一、材料與方法
[0030]( -）材料收集
[0031] 從上海醫(yī)院收集6例晚期腫瘤患者（2例肺癌、1例肝癌、1例胃癌、1例十二指腸腺 癌）的胸腔積液或腹水各200ml(肝素抗凝5U/ml)，立即進(jìn)行分離制備試驗(yàn)。上述標(biāo)本均為 臨床治療過程中的廢棄物。
[0032] (二）實(shí)驗(yàn)方法
[0033] 1.腫瘤特異性TIL細(xì)胞的分離和FACS檢測(cè)
[0034] 無菌收集經(jīng)肝素抗凝的惡性胸腔積液或腹水100ml，經(jīng)2000r/min離心10min，沉 淀細(xì)胞用無菌緩沖液洗滌2次后懸于20ml的緩沖液中；
[0035] 而后將100%的淋巴細(xì)胞分離液5ml加入15ml的無菌離心管中，再小心加入IOml 上述細(xì)胞懸液，經(jīng)2000以1^11離心201^11，在100%的淋巴細(xì)胞分離液界面上收集云霧狀的 細(xì)胞層細(xì)胞即為腫瘤細(xì)胞與TIL細(xì)胞的混合體，1500r/min，離心5