一種cik細(xì)胞培養(yǎng)液及cik細(xì)胞的培養(yǎng)方法和香菇多糖在cik細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)液及CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法 和香菇多糖在CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自體免疫細(xì)胞治療是最成熟的腫瘤生物治療技術(shù)，它是從患者自體外周血中分離 出單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)室激活、修飾、擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，起到調(diào)節(jié)和增強(qiáng)患者 的免疫功能，并直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的作用。從上世紀(jì)80年代應(yīng)用于臨床腫 瘤治療以來，自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)日趨成熟，越來越得到腫瘤患者與醫(yī)生的認(rèn)可。
[0003] 自體免疫細(xì)胞治療按照方式不同，主要可分為主動(dòng)免疫治療和過繼性免疫治療兩 種。其中，主動(dòng)免疫治療是采集患者的外周血，分離能夠活化患者自身體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞的因 子，然后在體外培養(yǎng)、修飾、增殖后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這樣就能迅速激發(fā)增強(qiáng)人體自身的抗 癌能力；過繼性免疫治療是分離患者自身體內(nèi)本就存在的抗癌細(xì)胞，在體外活化，增殖后直 接輸入患者體內(nèi)對(duì)抗腫瘤。
[0004] 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（Cytokine-InducedKiller,CIK)細(xì)胞是一種用于過繼性免 疫治療的抗癌細(xì)胞。CIK細(xì)胞由于同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK 細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。 因此，應(yīng)用CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。
[0005] 目前，常見的CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法是在添加相應(yīng)的細(xì)胞因子的無血清培養(yǎng)基中 培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)，在細(xì)胞因子的刺激下誘導(dǎo)PBMC成為CIK細(xì)胞。但采用這種 方法培養(yǎng)CIK細(xì)胞時(shí)，CIK細(xì)胞的增殖效果較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)液及CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法和 香菇多糖在CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，CIK細(xì)胞在本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中的增殖效果較好。
[0007] 本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)液，包括干擾素-y、⑶3激發(fā)型單抗、白細(xì)胞介 素-2、香菇多糖和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0008] 優(yōu)選的，所述香菇多糖在培養(yǎng)液中的含量為0. 05~0. 3mg/mL。
[0009] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液還包括血清。
[0010] 優(yōu)選的，所述血清在培養(yǎng)液中的體積百分含量為5~20%。
[0011] 優(yōu)選的，所述干擾素-y在培養(yǎng)液中的含量為200~lOOOU/mL;所述⑶3激發(fā)型 單抗在培養(yǎng)液中的含量為10~80ng/mL;所述白細(xì)胞介素-2在培養(yǎng)液中的含量為100~ 600U/mL〇
[0012] 本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0013] a)、使用權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)液培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞，獲得CIK 細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟a)具體包括以下步驟：
[0015] al)、外周血單個(gè)核細(xì)胞在所述培養(yǎng)液中重懸，得到細(xì)胞懸液；
[0016] a2)、將所述細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得CIK細(xì)胞。
[0017] 優(yōu)選的，所述細(xì)胞懸液中的外周血單個(gè)核細(xì)胞密度為0. 5XIO6~IX10 6個(gè)/mL。
[0018] 優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的溫度為37°C;所述培養(yǎng)的CO2體積濃度為5% ;所述培養(yǎng)的時(shí) 間為12~16天。
[0019] 本發(fā)明提供了一種香菇多糖在CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)液及CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法和香 菇多糖在CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的CIK細(xì)胞培養(yǎng)液包括干擾素-Y、CD3激發(fā) 型單抗、白細(xì)胞介素-2、香菇多糖和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明在CIK細(xì)胞培養(yǎng)液中加入香 菇多糖，使用這種培養(yǎng)液進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，能夠促進(jìn)PBMC產(chǎn)生淋巴細(xì)胞活化因子和釋 放輔助性T細(xì)胞因子，從而促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖，進(jìn)而使培養(yǎng)得到的CIK細(xì)胞表現(xiàn)出大的擴(kuò) 增倍數(shù)、強(qiáng)的殺傷活性和高的細(xì)胞表面抗原含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)液 培養(yǎng)CIK細(xì)胞14天后，CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)大于300倍，CIK細(xì)胞體外殺傷率（效靶比40:1) 大于（80±2) %，CIK細(xì)胞表面抗原（CD3+和CD56+)數(shù)量大于48%。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例 僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0022] 本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)液，包括干擾素-y、⑶3激發(fā)型單抗、白細(xì)胞介 素-2、香菇多糖和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0023] 在本發(fā)明中，所述干擾素-Y(IFN-Y)是一種水溶性二聚體細(xì)胞因子，具有抗病 毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述干擾素-Y在CIK細(xì)胞培 養(yǎng)液的含量為200~lOOOU/mL;在本發(fā)明提供的另一個(gè)實(shí)施例中，所述干擾素-y在CIK細(xì) 胞培養(yǎng)液的含量為400~800U/mL;本發(fā)明對(duì)所述干擾素-y的來源沒有特別限定，采用市 售商品即可。在本發(fā)明中，所述干擾素-T的主要作用是通過與培養(yǎng)液中的其他組分協(xié)同 作用，從而促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性。
[0024] 在本發(fā)明中，所述⑶3激發(fā)型單抗又稱⑶3單抗，可與T淋巴細(xì)胞表面的⑶3分子 進(jìn)行特異性結(jié)合。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述CD3激發(fā)型單抗在培養(yǎng)液中的含量 為10~80ng/mL;在本發(fā)明提供的另一個(gè)實(shí)施例中，所述CD3激發(fā)型單抗在培養(yǎng)液中的含 量為20~60ng/mL。本發(fā)明對(duì)所述CD3激發(fā)型單抗的來源沒有特別限定，采用市售商品即 可。在本發(fā)明中，所述CD3激發(fā)型單抗的主要作用是通過與培養(yǎng)液中的其他組分協(xié)同作用， 從而促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性。
[0025] 在本發(fā)明中，所述白細(xì)胞介素-2(IL-2)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的 一類細(xì)胞因子，由于最初是由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用，所以由此得名。在本發(fā) 明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述白細(xì)胞介素-2在培養(yǎng)液中的含量為100~600U/mL;在本發(fā) 明提供的另一個(gè)實(shí)施例中，所述白細(xì)胞介素-2在培養(yǎng)液中的含量為200~500U/mL。本發(fā) 明對(duì)所述白細(xì)胞介素-2的來源沒有特別限定，采用市售商品即可。在本發(fā)明中，所述白細(xì) 胞介素-2的主要作用是通過與培養(yǎng)液中的其他組分協(xié)同作用，從而促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖， 增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性。
[0026] 在本發(fā)明中，所述香菇多糖是從香菇子實(shí)體中提取的有效活性成分，香菇多糖中 的活性成分是具有分支的(6-(1-3)-D-葡聚糖，其主鏈由(6-(1-3)-連接的葡萄糖基組成， 沿主鏈隨機(jī)分布著由(6-(1-6)連接的葡萄糖基，呈梳狀結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施 例中，所述香菇多糖在培養(yǎng)液中的含量為〇. 05~0. 3mg/mL;在本發(fā)明提供的另一個(gè)實(shí)施例 中，所述香菇多糖在培養(yǎng)液中的含量為〇. 0625~0. 25mg/mL。本發(fā)明對(duì)所述香菇多糖的來 源沒有特別限定，采用市售商品即可。在本發(fā)明中，所述香菇多糖的主要作用是促進(jìn)CIK細(xì) 胞的增殖，增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性。
[0027] 在本發(fā)明中，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基是CIK細(xì)胞培養(yǎng)液的基礎(chǔ)成分。在本發(fā) 明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所選用的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI(RoswellParkMemorial Institute)提供的RPMI-1640培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基的作用是在細(xì) 胞培養(yǎng)過程中為培養(yǎng)的細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)成分。
[0028] 在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述CIK細(xì)胞培養(yǎng)液還包括血清。在本發(fā)明提供 的一個(gè)實(shí)施例中，所述血清為自體血清。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述血清在培養(yǎng)液 中的體積百分含量為5~20% ;在本發(fā)明提供的另一個(gè)實(shí)施例中，所述血清在培養(yǎng)液中的 體積百分含量為5~10%。在本發(fā)明中，所述血清的主要作用是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中為細(xì)胞 生長和增殖提供營養(yǎng)，同時(shí)通過與培養(yǎng)液中的其他組分協(xié)同作用促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖，增 強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性。
[0029] 本發(fā)明在CIK細(xì)胞培養(yǎng)液中加入香菇多糖，使用這種培養(yǎng)液進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)， 能夠促進(jìn)PBMC產(chǎn)生淋巴細(xì)胞活化因子和釋放輔助性T細(xì)胞因子，從而促進(jìn)CIK細(xì)胞的增 殖，進(jìn)而使培養(yǎng)得到的CIK細(xì)胞表現(xiàn)出大的擴(kuò)增倍數(shù)、強(qiáng)的殺傷活性和高的細(xì)胞表面抗原 含量。同時(shí)，本發(fā)明通過優(yōu)化CIK細(xì)胞培養(yǎng)液的配方，通過培養(yǎng)液中各組分的協(xié)同作用，進(jìn) 一步促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供 的培養(yǎng)液培養(yǎng)CIK細(xì)胞14天后，CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)大于300倍，CIK細(xì)胞體外殺傷率（效靶 比40:1)大于（80±2)%，CIK細(xì)胞表面抗原（⑶3+和⑶56+)數(shù)量大于48%。
[0030] 本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0031] a)、使用上述技術(shù)方案所述的培養(yǎng)液培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞，獲得CIK細(xì)胞。
[0032] 在本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法中，通過使用所述培養(yǎng)液培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞，獲得 CIK細(xì)胞，該過程具體包括以下步驟：
[0033] al)、外周血單個(gè)核細(xì)胞在所述培養(yǎng)液中重懸，得